常用生物化学检验技术一

1、第一节第一节 光谱分析技术光谱分析技术第二节第二节 电化学分析电化学分析第三节第三节 干化学分析技术干化学分析技术第四节第四节 电泳技术电泳技术第五节第五节 层析技术层析技术第六节第六节 离心技术离心技术第七节第七节 自动生化分析技术自动生化分析技术 n本章内容概要本章内容概要n教学目标和要求教学目标和要求1 1、掌握掌握分光光度技术的基本原理及定性和定量方法。分光光度技术的基本原理及定性和定量方法。掌握电化学分析方法基本原理掌握电化学分析方法基本原理2 2、熟悉熟悉分光光度计的基本结构和操作方法光源检查分光光度计的基本结构和操作方法光源检查和波长校正、原子分光光度计的类型和影响荧光分析和波长

2、校正、原子分光光度计的类型和影响荧光分析的因素。的因素。熟悉熟悉离子选择电极分类，离子选择电极的分离子选择电极分类，离子选择电极的分析方法析方法 3 3、了解了解其他光谱分析技术的基本原理及在生化检验中其他光谱分析技术的基本原理及在生化检验中的应用。的应用。n分光光度技术的基本原理分光光度技术的基本原理n分光光度计的基本结构分光光度计的基本结构n分光光度计的操作方法分光光度计的操作方法 n分光光度技术的定性和定量方法分光光度技术的定性和定量方法 一、光谱分析技术的基本原理：一、光谱分析技术的基本原理： 利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱

3、谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。征，以此来确定物质性质、结构或含量。1 1、 光谱分析技术分类：光谱分析技术分类：发射光谱分析技术：发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法法和荧光光谱法 吸收光谱分析技术：吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光度法和红外光谱法原子吸收分光光度法和红外光谱法 散射光谱分析技术：散射光谱分析技术：比浊法比浊法 微粒性微粒性(e=h(e=hv v) ) 波粒二象性波粒二象性波动性波动性( ( =c/=c/v v) )e=he=hv v =hc=hc/ / -光的能量与光的波

4、长成反比，与光的能量与光的波长成反比，与光的频率成正比光的频率成正比2 2、光的基本性质、光的基本性质-高速传播的电磁波3 3、物质对光吸收的基本原理：、物质对光吸收的基本原理：能量释放e1e0吸收光谱发射光谱激发态基态e1 e04. 4. 分类分类 1 1、定义：、定义： 根据被测物质对各种不同波长光的根据被测物质对各种不同波长光的吸收能力，绘制吸收曲线，并根据曲线的吸收能力，绘制吸收曲线，并根据曲线的特性鉴定物质的方法。特性鉴定物质的方法。 属光谱分析法。属光谱分析法。二二 分光光度法分光光度法 2 2、特点：、特点：（1 1）定性分析）定性分析 定性鉴定定性鉴定 纯度鉴定纯度鉴定 结构分

5、析结构分析（2 2）定量分析）定量分析 l1l2入射光透过光入射光透过光l2 l1 ，i1 i2i0i1i0i2摩尔吸光系数摩尔吸光系数：当溶液层厚度单位为：当溶液层厚度单位为cm，浓度单位为，浓度单位为mol/l时，时，k即成为摩尔吸光系数即成为摩尔吸光系数光源单色器样品室检测器显示 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 可见光区：钨灯作可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范为光源，其辐射波长范围在围在3203202500 nm2500 nm。

6、 紫外区：氢、氘灯。紫外区：氢、氘灯。发射发射185185400 nm400 nm的连的连续光谱。续光谱。 将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。波长单色光的光学系统。 入射狭缝：光源的光由此进入单色器；入射狭缝：光源的光由此进入单色器； 准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； 色散元件：将复合光分解成单色光；色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅棱镜或光栅； 聚焦装置：透镜或聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至后所得单色光聚焦至出

7、射狭缝；出射狭缝； 出射狭缝。出射狭缝。 样品室放置各种类型的吸收池样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。般用玻璃池。 利用光电效应将透过吸收池的利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。有光电池、光电管或光电倍增管。 检流计、数字显示、微机进行检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理仪器自动控制和结果处理 简单，价廉，适于在给定波长处

8、测量吸光度或透光度，简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。的稳定性。 自动记录，快速全波自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价结构分析。仪器复杂，价格较高。格较高。 将不同波长的两束单色光将不同波长的两束单色光( (1 1、2 2) ) 快束交替通过同快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。一吸收池而后到达检测器。产生交

9、流信号。无需参比池。 = =1 12nm2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。两波长同时扫描即可获得导数光谱。 可见分光光度计 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计 beckman 紫外紫外-可见可见分光光度计分光光度计eppendorf 紫外紫外-可见可见分光光度计分光光度计以以721-a721-a型分光光度计为例，其基本的操作步骤为：型分光光度计为例，其基本的操作步骤为：1.1.开开721-a721-a分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电2020分钟使仪分钟使仪器预热。器预热。2.2.将波长旋至测定的波长。将波长旋至测定的波长。3.3.将

10、空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。4.4.将开关置于将开关置于t t位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节t t为为0.0,0.0,关上关上比色池盖子，调节比色池盖子，调节t t为为100.0100.0。5.5.将开关置于将开关置于a a，用消光调零调节，用消光调零调节a a为为0.00.06.6.重复步骤重复步骤4 4和和5 57.7.将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（a a） 铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的

11、吸铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光度。在光度。在25，将，将4mg铬酸钾溶于铬酸钾溶于100ml的的0.05mol/l koh中，放入比色池中，在不同波长中，放入比色池中，在不同波长下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进行比较，可检测仪器吸光度的准确度行比较，可检测仪器吸光度的准确度。 1.开启电源，指示灯亮，仪器预热10分钟，选择开关置于“t” 。2.打开试样室盖（光门自动关闭），调节“0%t”旋钮，使数字显示为“00.0”。 3.将装有溶液的比色皿放置比色架中。 4.旋动波长手轮，把测试所需的波长调节至刻度线处。 6.将参比溶液比色皿置

12、于光路中，将选择开关置于a，旋动吸光度调零旋钮，使得数字显示为.000，然后移入被测溶液，显示值即为试样的吸光度a值。 8全部测定结束后，取出比色皿(洗净)，关闭开关.三、分光光度技术的定性和定量方法三、分光光度技术的定性和定量方法u定性依据：定性依据：最大吸收波长最大吸收波长maxmax和摩尔吸光系数和摩尔吸光系数 2.2.摩尔吸光系数摩尔吸光系数方法方法1.1.最大吸收波长最大吸收波长maxmax方法方法1.标准曲线法 将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度显色后，分别测吸光度(a)(a)，以，以a a为纵坐标，浓度为纵坐标

13、，浓度为横坐标制标准曲线为横坐标制标准曲线( (至少要至少要5 5点点) )。在相同条件。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度线找出相对应的浓度u方法：方法：axcxa（吸光度）（吸光度）c（浓度）（浓度）u制作和应用标准曲线时应注意下面几点：制作和应用标准曲线时应注意下面几点：（1 1）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应 重新绘制。重新绘制。（2 2）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。（3 3）当待测液吸光度超

14、过线性范围时，应将标本稀释后再）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再 测定。测定。（4 4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。2比较法 c cx x=(a=(ax xc cs s)/a)/as s 己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为： 其中其中cxcx和和axax为标本

15、管浓度和吸光度，为标本管浓度和吸光度，cscs和和asas分别为标准分别为标准管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量和标本管浓度相近。和标本管浓度相近。 3其它分析方法 包括差示法、多组份混合物分析和利用包括差示法、多组份混合物分析和利用摩尔吸光系数分析等方法。摩尔吸光系数分析等方法。四、其它光谱分析技术四、其它光谱分析技术（一）火焰光度法（一）火焰光度法（二）原子吸收分光光度法（二）原子吸收分光光度法 （三）荧光光度分析法（三）荧光光度分析法1 1基本原理基本原理 2 2组成组成1 1基本原理基本原理 2 2组成组成 3 3原

16、子吸收分光光度法的特点原子吸收分光光度法的特点 3 3荧光光度定量分析法荧光光度定量分析法 4 4 荧光光度分析技术的应用荧光光度分析技术的应用 1 1基本原理基本原理 2 2影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素火焰光度法火焰光度法等离子体发射光谱法等离子体发射光谱法原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法荧光光度法荧光光度法nanodrop nd-3300 fluorospectrometer n电化学分析方法基本原理电化学分析方法基本原理n离子选择电极分类离子选择电极分类n离子选择电极的分析方法离子选择电极的分析方法 电化学分析方法电化学分析方法电位分析法：测定原电池电动势以求物质含量的分析方

17、法电位分析法：测定原电池电动势以求物质含量的分析方法电导法：通过电阻测定以求物质含量的分析方法电导法：通过电阻测定以求物质含量的分析方法电容量分析法：借助某些物理量的突变作为分析重点的指示电容量分析法：借助某些物理量的突变作为分析重点的指示一、电化学分析方法基本原理一、电化学分析方法基本原理电池电动势和电极电势电池电动势和电极电势电池电动势：电池电动势：将电位差计接在电池的两个电极之间而直将电位差计接在电池的两个电极之间而直接测得的电势值习惯上称之为电池的电动势接测得的电势值习惯上称之为电池的电动势电极电势：电极电势：当采用相对电势法时，系用一定的参比电极当采用相对电势法时，系用一定的参比电极

18、与研究电极组成电池，与研究电极组成电池， 这一电池的电动势称为相对于给定参比这一电池的电动势称为相对于给定参比电极而确定的研究电极电势。电极而确定的研究电极电势。( (金属和溶液相接触的内电位差即金属和溶液相接触的内电位差即为金属电极和溶液间的电极电势为金属电极和溶液间的电极电势) )the absolute potential differenceacross a single electrified interface cannot be measured!it is not necessary to know exact value of it but the difference of

19、 absolute potential difference isimportant for electrochemists!单个界面上的绝对电位单个界面上的绝对电位是不可测的，对于电化是不可测的，对于电化学研究重要的是其差值学研究重要的是其差值参比电极参比电极顾名思义，参比电极是给出一个固定的值，其它的电顾名思义，参比电极是给出一个固定的值，其它的电极电势的测量以此为基础。一个好的参比电极应该不极电势的测量以此为基础。一个好的参比电极应该不受温度、时间和通过小电流而变化受温度、时间和通过小电流而变化, 应遵守应遵守nernst 方方程。程。指示电极指示电极指示电极的电位随离子浓度而变化，能指

20、示待测离子指示电极的电位随离子浓度而变化，能指示待测离子浓度。浓度。二二 离子选择性电极离子选择性电极1、定义：2、特点：3、测定原理：4、离子选择性电极分类按国际纯粹与应用化学联合会（按国际纯粹与应用化学联合会（iupaciupac）建议分类）建议分类5、离子选择性电极的基本构造（一）非晶膜电极（一）非晶膜电极玻璃电玻璃电极极1 玻璃电极的结构三三 常用的离子选择性电极常用的离子选择性电极（2）玻璃电极及膜电位：试试phfrt303. 2k,a lgfrt303. 2khm3.玻璃电极的优点（二）气敏电极（二）气敏电极该类电极其实是一种复该类电极其实是一种复合电极：将合电极：将 ph ph 玻璃电玻璃电极和指示电极插入中介极和指示电极插入中介液中，待测气体通过气液中，待测气体通过气体渗透膜与中介液反应，体渗透膜与中介液反应，并改变其并改变其 ph ph 值，从而值，从而可测得诸如可测得诸如coco2 2( (中介液中介液为为nahconahco3 3) )