线粒体的分离与鉴定

1、实验四线粒体的分离与鉴定Welcome to Anhui University细胞生物学精品课程比、 屛H实验简介线粒体是真核细胞内一种重要和独特的细胞器，人体内95纟 的ATP是由线粒体中的呼吸链所产生的，因此线粒体是细用 内的“能量加工厂二 线粒体通过氧化磷酸化作用，进行能重 转换，为细胞进行各种生命活动提供能量。本实验以小鼠肝组织为实验材料，通过对肝组织匀浆液悬爭在蔗糖介质中进行差速离心法制备线粒体样本，然后通过名纳斯绿活染法进行显微镜观察线粒体的形态。实验学时3个。、实验目的初步掌握用差速离心法分离大鼠肝细胞线粒体的方 法。学习并掌握高速离心机和匀浆器的使用方法。1、实验原理线粒体(m

2、itochondria)是真核细胞中产生能量的重要细胞器。细胞中的 能源物质一脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联 磷酸化生成ATP,供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研 究通常是在离体的线粒体上进行的。制备线粒体时，可将组织匀浆液悬浮在悬浮介质中进行差速离心法进 行分离。在一定的离心场中(选用离心机的一定转速)，大小不一的 颗粒沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一个均匀 悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由 于沉降速度不同而停留在高低k同的位置。依次增加离心力和离1、实验原理心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降 在

3、离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞 核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分 离。悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散 相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操 作过程应注意使样品保持4°C,避免酶失活。线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。二、实验用品1.材料昆明种小白鼠若干只參器材冷冻高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、20C 目尼龙网（通常为铜筛）、玻璃匀浆器、PH计、高压灭菌锅等。3.试剂K0.9%灭菌的生理盐水。m1%詹纳斯绿B染液，用0.9%灭菌的生理盐水配

4、制。FE 0.25mol/L蔗糖十O.Olmol / L Tris盐酸缓冲液(pH7.4)：E 034moI/L蔗糖十O.Olmol tris-盐酸缓冲液(pH7.4)K 固定液：甲醇：冰醋酸(9:1)叫 姬姆萨染液(原液)：Giemsa粉0.5g,甘油33ml,纯甲醇33ml先将Giemsa粉置于研钵内中，加少量甘油研磨至无颗粒，再将剩余甘W倒入混匀，56°C左右保温2h令其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为姬如萨原液，保存于棕色瓶。! 姬姆萨染液(应用液)：临用时，吸出lml原液，用9mll/15mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)作10倍稀释。0四、实验操作制备小鼠肝细胞匀浆：实验前小

5、鼠空腹12h,拉颈处死，剖腹取肝，迅 速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g,剪碎，用预冷 到04°C的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在04°C条件下， 按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶年 应分数次添加。匀浆液用200目铜筛过滤备用。离心：先将9ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心 地加入9ml肝匀浆使其覆盖于上层。用冷冻高速离心机按下图顺序进冇 差速离心。差速离心提取鼠肝线粒体流程见下图。差速离心提取鼠肝线粒体流程图取5g鼠肝ZI先用生理盐水洗净血水，滤纸吸干，然丿 I用预冷的0.

6、25嘛糖溶液洗3次。洁净的肝组织剪碎，按h 9用预冷的0. 25賺糖溶液进行匀浆鼠肝匀浆液I 700Xg 离心 10nin加10rrt预冷的0. 25M 蔗糖溶液2次，每次 1000Xg离心 15ni n（细胞核及质膜碎片）合并差速离心提取鼠肝线粒体流程图沉淀（线粒体）加10rrl预冷的 0. 25哦糖溶液2次, 每次10000Xg离心 15ni n上清液（纯化的线粒体）五、结果(1)细胞核：取细胞核沉淀1滴涂片，入甲醇冰醋酸液固定15min,充分吹干，滴1滴姬姆萨染液应用液染色lOmino自来水冲洗，吹干，镜检。结果：细胞核呈紫红色，上面附着的少量胞质及浅蓝色碎片O:线粒滋n嚮液染20min,覆上盖玻片，镜检。线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。六、注意事项注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程 不宜过长，以保持组分的生理活性。最好在在04°C或冰浴中 进行。将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离 心，以防匀浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层 效果。姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果较好。过期的应 用液不可使用。七、作业线粒体提取分离过程中,为什么要在04°C进行?将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体