凋亡素基因重组腺病毒的构建

1、凋亡素基因重组腺病毒的构建【摘要】 目的 构建携凋亡素基因的腺病毒载体，为进一步研究凋亡素基因功能及其作用机制建立基础。方法 Pmel酶切线性化已经构建好的含凋亡素基因的穿梭质粒pAdTrackCMVVP3，然后电转化到BJ5183AD1细胞中进行同源重组。Pac酶切出含凋亡素基因的腺病毒DNA，然后转染293细胞进行包装获得重组腺病毒，运用RTPCR鉴定重组腺病毒。用氯化铯梯度离心纯化病毒。用物理和生物方法确定病毒的滴度。结果 Pac酶切证实同源重组成功。绿色荧光观察证实病毒包装成功并且具有感染力，RTPCR证实了重组腺病毒具有凋亡素蛋白的编码。重组腺病毒的浓度为84.52×109

2、 VP/ml，滴度为6.561×109 PFU/ml。结论 成功构建含凋亡素基因的重组腺病毒，它的滴度足以满足体内外实验。 【关键词】 凋亡素基因 腺病毒载体 基因治疗 【Abstract】 Objective To construct a recombinant adenovirus carrying Apoptin gene so as to provide basis for further studying Apoptin gene functions and ascertaining corresponding mechanism. Methods The shuttle

3、vector pAdTrackCMVVP3 containing Apoptin gene was linearized with Pmel and subsequently electrotransformed into BJ5183AD1 cells for homologous recombination. The DNA containing Apoptin gene of the recombinant adenovirus was obtained by digesting with PacI and then transfected into 293 cells, where t

4、he recombinant adenovirus containing Apoptin gene was identified by RTPCR and purified by cesium choride density centrifugation. Finally, the titre of the recombinant adenovirus was determined by biological and physical assays. Results Digestion with PacI proved successful homologous recombination.

5、Green fluorescence showed successful recombinant adenovirus with infectiveness. RTPCR confirmed that the recombinant adenovirus had coding of Apoptin gene proteins. The titre of the recombinant adenovirus was 84.52×109 VP/ml and 6.561×109 PFU/ml. Conclusion The recombinant adenovirus vecto

6、r containing Apoptin gene is successfully constructed, with its titre sufficient for in vivo and in vitro experiment. 【Key words】 Apoptin gene; Adenovirus vector; Gene therapy 凋亡素，又称Apoptin(apoptosis induction)1，是来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)的小分子蛋白质。它能引发一些肿瘤细胞凋亡和细胞转化，而对正常细胞无此作用。在肿瘤的治疗上具有巨大潜力1。由

7、于凋亡素是外来物质，在发挥作用前必须进入细胞，所以我们选择腺病毒作为载体来运载它，以期能探索它的作用机制，为肿瘤的治疗提供新的途径。 1 材料与方法 1.1 含凋亡素基因的穿梭质粒PAdtrackCMVVP3的获得2我们已经成功构建了含凋亡素基因的穿梭质粒，并且通过了酶切和测序鉴定，为下一步实验的进行奠定了基础2。 1.2 含凋亡素基因的腺病毒基因组(PAdVP3)质粒的构建 1.2.1 同源重组 pAdTrackCMVVP3用Pmel酶切，线性化，再用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)进行去磷酸化处理，最后电转化(BioRad Gene Pulser Electr

8、opoerator 2 500 V 200 max)到BJ5183AD1细胞中，与其内的pAd Easy1进行同源重组。设置阴性对照组为空载体pAdTrackCMV，经过以上处理后同样进行同源重组。 1.2.2 酶切鉴定 只有重组成功才能用Pac酶切出两个不同长度的条带：长的为23 kb，短的根据重组位点不同而不同，可以为3.0或4.5 kb条带。无论在何位点重组均不影响pAdVP3腺病毒基因组的功能。 1.3 含凋亡素基因腺病毒DNA的获得 从含pAdVP3腺病毒基因组的质粒中使用Pac酶切，然后用胶回收23 kb的DNA片段，即重组腺病毒基因组。 1.4 重组腺病毒在293细胞内的包装、扩

9、增及鉴定 1.4.1 重组腺病毒的包装 将获得的重组腺病毒DNA转染293细胞。6孔细胞培养板种入2×105细胞，待细胞密度达到60%，除去培养基，用不含小牛血清的DMEM洗涤细胞(5 min)，加入500 l不含小牛血清的DMEM与5 g 重组腺病毒DNA和5 l Lipofectamine reagent的混合物(混合10 min后加入)，空白对照用不含目的基因的腺病毒DNA转染。37 孵育箱中孵育3 h，吸取培养基，加入4 ml培养基重新孵育67 h后，再次更换培养基37 孵育57 d，此期间细胞长满后可以传代至大的培养瓶内继续生长。每天用荧光显微镜观察有否荧光蛋白以判断有无病

10、毒的产生。当50%细胞出现荧光蛋白时不再传代和换液，只是加液，直到病毒的继续产生。此时收集培养液和细胞，将上述细胞悬液移入5 ml的离心管中，并在-80 和37 水浴中反复冻融3次，每次冻融后，旋转离心管1次，以使细胞悬液充分冻融，室温下，12 000×g离心10 min，沉淀细胞碎屑，将上清液(主要成分为病毒原液)移入新的离心管中于-80 保存。 1.4.2 重组腺病毒的扩增 将AD293细胞接种于6孔板上，使每孔内细胞数达到(78)×105。吸去培养液，然后加入1 ml新鲜培养液，同时加入200 l病毒原液混匀，37 孵育2 h，再加入2 ml培养液继续孵育。每日用荧光

11、显微镜观察情况。当有病毒产生后即按上述方法收集病毒液。 1.4.3 重组腺病毒的鉴定 由于我们已经通过观察荧光蛋白的情况证实了重组腺病毒是包装出来的，并且具有感染能力。下一步需证实的是该腺病毒是否有目的蛋白的编码。采用RTPCR方法鉴定。转染后48 h，用Trizol抽提各孔细胞的总RNA，以Oligo(dT)为引物合成cDNA。然后以cDNA为模板，用人工合成的凋亡素基因上下游引物行PCR检测。 1.5 重组腺病毒的纯化及滴度测定 我们将扩增的病毒送成都基因治疗肿瘤药物工程技术研究中心纯化和滴度测定。 1.5.1 纯化 采用氯化铯梯度离心方法纯化。 1.5.2 滴度测定 1.5.2.1 物理

12、检测：物理检测指腺病毒蛋白和DNA(主要是DNA)能吸收紫外线的特性来测定，其对应公式为：1OD=1.1×1012病毒数。根据这个线性关系能测出病毒的实际病毒数。 1.5.2.1 生物检测：我们采用嗜斑形成单位(plaque forming units,PFU)来描述病毒的感染力。既通过观察细胞病变(cytopathic effect,CPE)来确定病毒的感染能力。用5% FBSDMEM将待测样本稀释至其106倍，再在盛2 ml 5% FBSDMEM培养液离心管(5 ml)中进行3倍倍比稀释(12)，共12管，各管有病毒液2 ml。用5% FBSDMEM培养液调细胞密度为1×

13、;105/ml，在96孔培养板中每孔加入此细胞悬液100 l，置于37 5% CO2细胞培养箱中培养24 h。弃去培养液，将倍比稀释的第1管病毒液加入第1列，第2管病毒液加入第2列，100 l/孔，直至第12管。培养后第12天显微镜下观察各孔，以培养孔中发生病变细胞数多于50为阳性，计数阳性细胞孔数。并以下式计算所测样本病毒颗粒滴度3： 腺病毒载体滴度 =稀释倍数×稀释度(CPE阳性细胞孔数-4)/8 =106×3(CPE阳性细胞孔数-4)/8(PFU/ml) 2 结果 2.1 含凋亡素基因的腺病毒基因组(PAdVP3)质粒的获得(见图1) 图1 含凋亡素基因腺病毒基因组质

14、粒的Pac酶切图 M: Hind,DNA Marker； 1：含腺病毒DNA的质粒Pac酶切电泳 从图1中可以看出：Pac酶切能切出两个条带：大于23 kb和4.5 kb的条带。表示同源重组成功。 2.2 重组腺病毒的包装 当感染病毒后293细胞增大，细胞丝状结构消失，细胞核增大，到第3天时，可观察到细胞已崩解成荧光碎片。由于有新病毒的产生，可使受感染的293细胞数目增多，到第5天，细胞全部出现荧光蛋白，随后荧光减弱，表示病毒已开始从多数的细胞内释放。到第7天时大部分细胞脱落，可看到细胞有发泡现象，细胞结构不清，并且细胞脱壁，漂浮在培养液中出现细胞崩解释放病毒。此时收集病毒液。见图2。 2.3

15、 重组腺病毒的鉴定(见图3) 从图3可看出：含凋亡素基因的腺病毒具有编码凋亡素蛋白的活性。而不含凋亡素基因的腺病毒不具有。 2.4 重组腺病毒的滴度测定 2.4.1 物理检测 重组腺病毒的浓度为84.52×109 VP/ml，见图4。不含凋亡素基因的腺病毒的浓度为67.14×109 VP/ml，见图5。 2.4.2 生物检测 实验发现，重组腺病毒及不含凋亡素基因的腺病毒均可见68个阳性孔(发生细胞病变率大于50%)，故滴度均为：106×3(68-4)/8=6.561×109 PFU/ml。 图3 重组腺病毒的RTPCR M: DL2000 DNA Mar

16、ker； 1： 不含凋亡素基因的腺病毒感染293细胞后的RTPCR结果； 2： 含凋亡素基因的腺病毒感染293细胞后的RTPCR结果。 3 讨论 腺病毒载体是目前基因治疗研究和临床应用中采用最多的载体，它具有不整合入细胞基因组，毒性低，致病性小，宿主范围广，对分裂及非分裂期细胞有较高的感染率和滴度，装载容量大等特点。已广泛用于基因治疗研究4，且已被美国FDA批准作为基因治疗载体应用于临床试验。 本实验的AdEasy系统为Johns Hopkins大学癌症研究中心He博士构建5。与以前的腺病毒构建相比，它有如下优点：(1)腺病毒基因组是以超螺旋形式存在大肠杆菌中，而非哺乳细胞内，可使同源重组效率

17、由传统方法的20%提高到80%90%，并且方便酶切鉴定；(2)在产生含目的基因的腺病毒基因组过程中，没有连接步骤，增加了目的基因导入腺病毒基因组的效率和准确性；(3)能接入高达10 kb的目的基因，并且允许导入多个基因；(4)腺病毒基因组中含有绿色荧光蛋白基因，便于直接观察转染和感染的效率，使实验可靠和准确；(5)该系统使用的是人的腺病毒属和人的宿主细胞系，故其能表达多种蛋白质并能正确进行翻译后的修饰和折叠。因此用此构建产生的病毒可以不用嗜斑纯化就能获得含目的基因的腺病毒，从而大大减少了复制活性病毒的产生。我们在构建含凋亡素基因的腺病毒过程中，在荧光蛋白的指示下，能充分观察到含目的基因的腺病毒

18、基因组转染293细胞的情况，在第7天观察到大量293细胞脱落、崩解，与文献报道的一致5。与没有荧光蛋白指示的转染靠主观判断来决定病毒产生时间相比，充分保证了最高滴度病毒的获取，为病毒的纯化创造了条件。 病毒颗粒(viral particles,VP)或光学颗粒(optical partical unit,OPU)是物理方法检测的结果。它不能区别传染型和缺陷型病毒，但它的结果从一个实验室到另一个实验室都很恒定。而基因转移单位(gene transfer unit,GTU)和PFU是生物方法检测的结果。他们能具体说明病毒感染细胞的能力，但不同实验室给出的结果是各不相同的，使交流受限6。所以我们同时

19、采用以上两种方法来说明病毒的量和活力，为以后的实验打下基础。 293细胞是转染腺病毒E1A基因的人胚肾上皮细胞系，有致瘤性，是转化细胞。由于凋亡素基因具有引发细胞转化和肿瘤细胞凋亡的特性，那么它会引发293细胞的凋亡，从而阻止病毒颗粒的包装吗?答案是否定的。因为凋亡素基因编码的凋亡素蛋白需定位到细胞核，并且有量的积累才能引发细胞的凋亡，那么在这一过程中病毒已经包装成功并且释放出来7。Pietersen等8用PCMVVP3质粒转染293、911和PER.C6细胞(均是腺病毒的包装细胞)，在不同时间点收集这些细胞检测凋亡率，发现在48 h，包装细胞的凋亡率为25%；5 d达到80%。而腺病毒的包装

20、到释放一共才需48 h8。因此凋亡素蛋白的作用并不影响腺病毒的包装和释放。我们的实验也证实了凋亡素基因的功能并不影响腺病毒的包装和释放。细胞感染病毒后会出现一些不同于凋亡的形态变化，这些变化称为CPE。首先是细胞形态的变化，由于病毒能增强细胞膜的渗透性，细胞外的离子如钠离子流入胞内，细胞可从原来的形态变为圆形，然后由于细胞支架的降解或破裂导致细胞从基质上脱落，最后破裂。也可出现临近细胞的膜融合形成一个含有多个核的大细胞，称为多核体。多核体细胞生存短暂，随即裂解，释放出病毒6。我们从293细胞的荧光照片观察到如下现象：细胞由原来的梭形变为圆形，细胞核增大，核质比例明显增大，细胞逐渐从贴壁生长中松

21、脱，漂浮于培养液中，约到第7天细胞崩解释放出病毒。以上这些变化充分说明了含凋亡素基因的腺病毒能在293细胞内包装成熟后释放。 本研究成功的构建了凋亡素基因重组腺病毒。我们希望能够以腺病毒载体为介导，进一步研究凋亡素基因对消化道肿瘤的作用机制，为消化道肿瘤的基因治疗提供候选基因，并为临床前研究提供实验依据。【参考文献】 1 Rohn J L, Noteborn M H. The viral death effectou Apoptin reveals tumorspecific processesJ. Apoptosis, 2004,9(3):315-337.2 陈健，王曙光.凋亡素基因转染对人

22、胆管癌细胞凋亡作用的研究J.第三军医大学学报，2005，27(15)：1593-1595.3 Keriel A, Rene C, Galer C, et al. Canine adenovirus vectors for lungdirected gene transfer: efficacy, immuneresponse, and duration of transgene expression using helperdependent vectorsJ. J of Virology,2006,80(3):1487-1496.4 Bernt K M, Ni S, Tieu A T, et al. Assessment of a combined adenovirusmediated oncolytic a