第九章 liu-9-转基因动物与生物反应器

1、第九章 转基因动物与动物生物反应器 一、转基因动物的定义及简单发展史二、转基因动物的培育技术三、转基因动物的应用四、转基因动物应用面临的问题五、动物乳腺生物反应器纲要转基因动物（转基因动物（transgenic animal）是指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。一、转基因动物的定义及简单发展史 1974年，年，Jaenish和和Mintz将纯化的将纯化的SV40 DNA注入老鼠的囊注入老鼠的囊胚腔胚腔(blastocoele cavity)中，在该胚胎发育成鼠之后，可以在中，在该胚胎发育成鼠之后，

2、可以在老鼠体组织中侦测到注入的老鼠体组织中侦测到注入的DNA。由此可以推断：注入的。由此可以推断：注入的DNA可以插入胚胎细胞的染色体组可以插入胚胎细胞的染色体组(genome)内。内。 1980，Gorden et al.发表了第一篇有关成功地经由微量注射发表了第一篇有关成功地经由微量注射(microinjection)将基因转殖到老鼠体细胞中的研究报告。随即，将基因转殖到老鼠体细胞中的研究报告。随即，也有不少研究单位利用相同的方法植入许多转殖基因。也有不少研究单位利用相同的方法植入许多转殖基因。 1982年，年，Palmiter获得转基因小鼠。转入大鼠的生长激素基因，获得转基因小鼠。转入大

3、鼠的生长激素基因，使小鼠体重为正常个体的二倍，因而被称为使小鼠体重为正常个体的二倍，因而被称为“超级小鼠超级小鼠”。 以后相继在以后相继在10年间报道过转基因兔、绵羊、猪、鱼、昆虫、牛、年间报道过转基因兔、绵羊、猪、鱼、昆虫、牛、鸡、山羊、大鼠等转基因动物的成功。鸡、山羊、大鼠等转基因动物的成功。 由于转基因动物体系打破了自然繁殖中的种间隔离，使基因能在种系关系很远的机体间流动，它将对整个生命科学产生全局性影响。因此转基因动物技术在1991年第一次国际基因定位会议上被公认是遗传学中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第四代技术，被列为生物学发展史上126年中第14个转折点。评价：二、转基因动

4、物的培育技术转基因动物培育的基本过程 是借助分子生物学和胚胎工程的技术，将外源目的基因在体外扩增或加工，再导入动物的早期胚胎细胞中，使其整合到染色体上，当胚胎被移植到代孕动物的输卵管或子宫中后，发育成携带有外源基因的转基因动物。 生物体细胞中的DNA能精确合成并防止被DNA酶降解是由于存在由限制酶与修饰酶组成的生物屏障。 一般情况下，限制酶能将外源DNA切割并降解掉，而细胞本身合成的DNA由于修饰酶的甲基化作用而避免了被限制酶降解从而保持遗传稳定性。 但是，偶然也会发生外源DNA幸免降解的情况，使生物体产生小的变异。转基因技术就是利用生物这一特性，把外源基因注入细胞核而获得符合要求的转基因动物

5、。 转基因动物培育的理论基础培育转基因动物的关键技术外源目的基因的制备外源目的基因的有效导入胚胎培养与移植外源目的基因表达的检测 （1）基因显微注射法 （2）逆转录病毒感染法 （3）胚胎干细胞介导法 （4）精子载体导入法 （5）YAC介导的基因转移 （6）细胞核移植技术外源目的基因的导入方法显微注射法显微注射法原理原理 通过显微注射仪将外源基因直接注射到受精卵的雄原核内，使外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。基因显微注射法制备转基因动物的基因显微注射法制备转基因动物的操作步骤操作步骤： 1）目的基因的准备 2）供体母鼠和受体母鼠的准备 3）受精卵的超排和获取 4）基因显微注射 5）受精卵

6、的移植 6）目的基因的表达整合鉴定和检测 7）建系来源来源通过限制性内切酶预先分离的某一基因逆转录法得到的cDNA人工合成的DNA片段PCR扩增的特定基因片段扩增方式扩增方式载体方式PCR1）目的基因的制备）目的基因的制备2）供体母鼠和受体母鼠的准备）供体母鼠和受体母鼠的准备供体母鼠（与正常雄鼠交配）受体母鼠（与结扎雄鼠交配）3）超排卵与取卵）超排卵与取卵 （1）孕马血清促性腺激素（PMSG） （2）人绒毛膜促性腺激素（HCG） （3）剖腹取卵 4）基因显微注射）基因显微注射 显微操作仪下，将纯化的目的基因注射到受精卵的雄性原核内。5）受精卵移植）受精卵移植 单细胞/桑葚胚移植至受孕后0.5d

7、假孕母鼠输卵管 囊胚期移植至受孕后2.5d假孕母鼠子宫6）目的基因的表达整合鉴定和检测）目的基因的表达整合鉴定和检测小鼠、大鼠取尾部组织利用PCR、 Southern blot、FLSH，Northern blot、 以及Western blot等方法检测。 家兔取尾部组织或耳部组织或抽取血液制备待测材料，大动物除了取其组织外，主要抽取血液制备待测材料。7）建系）建系 大多数的插入突变是隐型的，只有通过近亲繁殖、培育出纯合子转基因小鼠，才会出现基因突变的表型。纯合子转基因小鼠的外源基因拷贝数是杂合子的两倍。定量PCR分析法点杂交放射自显影密度法 southern印迹法基因显微注射法小结：基因显

8、微注射法小结：优点：此方法操作简单，外源DNA在宿主动物染色体上的整合率 高，对外源基因片段的大小要求不严，外源注射基因长度 可达50kb。缺点： 外源基因是否能稳定地整合到受体基因组中，要等到子一代出生后经过选择才能确定。 整合位点随机 插入到宿主生命活动必需基因中，导致胚胎或动物死亡。 如果外源基因插入到原癌基因附近，可能诱导它的活 性，导致癌症发生；插入到性染色体附近，可能影响转 基因动物的育性。 整合一般是多拷贝守卫串联相接，不利于研究基因的结构、 功能及表达调控。（2）逆转录病毒感染法）逆转录病毒感染法基本原理：基本原理： 该方法是将目的基因重组到逆转录病毒基因组上，人为感染着床前或

9、着床后的胚胎，或直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层细胞共培养而达到转染的目的。逆转录病毒感染早期胚胎的逆转录病毒感染早期胚胎的操作步骤操作步骤： 1）逆转录病毒载体的构建 2）包装细胞 3）重组逆转录病毒感染早期胚胎1）逆转录病毒载体的构建）逆转录病毒载体的构建（1）提取病毒未整合的环状DNA（2）将环状DNA克隆到适当载体中（3）酶切去除病毒结构基因编码区（gag、pol、 env），保留识别外壳蛋白进行包装的信 号 。（4）将目的基因克隆到载体中（5）转染细胞测定外源基因的表达2）包装细胞）包装细胞 又称辅助细胞，这种细胞株包含有辅助病毒（helper virus）。辅助病毒能合成蛋白外壳

10、，但缺失了识别蛋白外壳进行包装的信号，因此它不能包装成病毒颗粒。当用逆转录病毒感染细胞株后，逆转录病毒的RNA进入辅助病毒的外壳蛋白，成为病毒颗粒。 3）重组逆转录病毒感染早期胚胎）重组逆转录病毒感染早期胚胎（1）取胚，例小鼠8细胞胚（2）去除透明带，洗净胚胎（3）辅助细胞与无透明带胚胎共培养（4）胚胎移植（5）仔鼠的筛选，杂交PS 将逆转录病毒载体技术与显微注射技术结合，受精前用显微注射方法将克隆有外源目的基因的逆转录病毒载体注射入处于减数分裂中期的卵母细胞，培育转基因动物。优点： 能高效感染宿主细胞，可以进行多细胞胚的转化。 载体DNA没有合成病毒蛋白的能力，不会产生病 毒颗粒，较为安全。

11、 感染效率高，可达100% 病毒基因组以转座的方式整合，其基因组不会发 生重排，因此所携带的外源基因也不会改变。 缺点： 获得纯合体的转基因动物的机会少，病毒载体构建复杂，转入的外源基因的大小受到限制，还有可能在转基因的同时带入病毒载体序列，带来潜在的安全性问题。这是我们所不需要的。逆转录病毒感染法小结：逆转录病毒感染法小结：（3）胚胎干细胞介导法）胚胎干细胞介导法 分离培养ES细胞 克隆培养ES细胞 将外源基因导入ES细胞 准备囊胚期胚胎材料作为移植受体 通过显微操作将ES细胞注入受体囊 胚腔，构建嵌合体。 胚胎移植，培育转基因鼠 杂交繁育，获得纯合体（4）精子载体导入法）精子载体导入法 直

12、接以精子作为外源DNA载体的转基因方法。操作步骤：操作步骤： 将外源目的基因导入精子 利用DNA与精子共育法、电穿孔导入法、脂质 体转染法等方法实现。 被导入外源目的基因的精子与卵子受精 采用人工受精、壶腹部手术受精、体外受精等方 法，培育转基因动物。 精细胞作为载体转导外源基因的研究主要集中在 如何有效地把外源基因结合于精子，而精子在转 导外源基因后仍需有生存能力。 以精子作为载体生产转基因动物是一种非常有用 的方法（尤其是大动物）。 精子载体法和显微注射法联合使用，辅以精子人 工破膜工作。精子载体导入法小结精子载体导入法小结：5）YAC介导的基因转移YAC介导基因转移的技术途径： 借助ES

13、细胞介导法 借助基因显微注射法YAC介导基因转移的优点： 保证巨大基因的完整性保证所有顺式元件的完整并与结构基因 位置关系不变消除或减弱基因整合后的位置效应使较长外源片段的整合率提高 YAC载体是近年来发展起来的新型载体，具有克隆百万碱基对的大片段外源DNA的能力。（6）细胞核移植技术通过细胞核移植技术制备转基因动物的技术路线： 外源目的基因通过脂质体介导等方法转染 动物体细胞 筛选整合有外源目的基因的体细胞作为 核供体 将核供体移植到去核卵母细胞进行动物 克隆。 优点：使转基因动物的群体能迅速被克隆扩大，还能保证目的基因在克隆后代中的稳定表达。且后代100%为转基因个体，由于遗传背景及遗传稳

14、定性一致，不需选配，仅一代就可建立转基因群体，省时省力。 缺点：技术难度大、成功率低、胎儿成活率不高。三、转基因动物的应用 改良动物品种 通过转移和表达适当的基因，使目的基因在宿主 基因组中得以表达，就可以培育出动物新品种。 如，提高动物生长速度、改良肉质和乳质、增强动物 抵抗力。2. 生物制药 转基因动物最大的应用就是用作乳腺生物反应 器。利用转基因动物来生产贵重的医用药物是目前 世界范围内转基因研究的热点之一。3.建立诊断和治疗人类疾病的动物模型 转基因动物是对多种生命现象本质深入了解的工具，如研究基因的结构与功能的关系，细胞发育的潜能性，细胞核与细胞质的相互关系，胚胎发育调控，肿瘤，神经

15、与发育等。 还可以用来建立多种疾病的动物模型，进而研究这些疾病的发病机理及治疗方法。4. 生产可用于人体器官移植的动物器官 利用转基因技术，通过免疫排斥相关基因转基因动物的建立。能够解决人类器官移植供体来源不足问题，促进异源器官移植研究和工作的进展。例如，培育出人体免疫系统基因的转基因猪心脏。5. 基因治疗(gene therapy) 是指将外源功能性目的基因导入患者体内，通过调控目的基因表达，抑制、替代或补偿缺陷基因，从而恢复受累细胞、组织或器官的生理功能，达到疾病治疗的目的。基因要转移到体内，大部分是通过以细胞为靶细胞和中介的，所以基因治疗也可称做细胞治疗。例如將自殺基因 (suicide

16、 gene) 導入腫瘤細胞。人类疾病基因治疗策略： 生殖细胞基因治疗 目的基因转入受精卵，治疗一些遗传疾病。 目前仅限于动物实验。 体细胞基因治疗 基因直接注射法： 经静脉或肌肉直接将带有外源DNA 的病毒、脂质体或裸露DNA注入患者有 关组织，使其进入相应的细胞并表达。 体外基因转移再回输体内的方法： 患者体细胞取出在体外培养并导入 外源目的基因后重新回输患者体内。6 基因打靶 利用特定的导向载体和选择系统，利用显微注射、电穿孔等方法构建出目的基因序列特异性的ES细胞（目的基因被敲除或被替换），进而完成基因剔除小鼠和基因替换小鼠的构建。 转基因以及基因打靶构建的小鼠可作为基因结构与功能、基因

17、表达与调控的常用模型。四、转基因动物应用面临的问题 1. 目的基因整合与表达的效率低 2. 转基因动物的负面效应 3. 研究费用高，需要相当的财力支持 4. 转基因动物相关的基础理论研究薄弱等五、动物乳腺生物反应器 动物乳腺生物反应器（mammary gland bioreactor）是利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物，指导外源基因在乳腺中表达，并从转基因动物的乳液中获取重组蛋白。（一）动物乳腺生物反应器的制备 1.表达载体的构建 四类乳腺定位表达调控元件： 第一类是：B2乳球蛋白基因调控序列 第二类：酪蛋白基因调控序列 第三类：乳清酸蛋白（WAP）基因调控序列 第四类:

18、乳清蛋白基因调控序列 2. 目的基因的选择 正常情况下浓度低、翻译后修饰复杂、其它表达体系难 以表达或表达量低、应用前景广阔。 3. 体外重组 4. 基因转导 将构建好的重组基因用基因转导方法转移到受精卵 5. 胚胎移植 6. 鉴定 DNA水平的鉴定和表达产物上的鉴定（二）动物乳腺生物反应器的优点 1. 产品质量稳定 基因产物可被充分修饰且生物活性稳定 表达产物不进入血液循环，不会对转基 因个体带来不良影响 2.产品成本低 3.研制开发周期短 4.无污染 5.经济效益显著 （三）动物乳腺生物反应器的应用1.改良乳汁品质2. 生产药用蛋白 例如，人尿激酶、-干扰素、人生长激素、-抗胰酶蛋白、凝血

19、因子IX、纤溶酶原激活物、抗凝血酶III等。（四）动物乳腺生物反应器存在的问题 外源基因在动物体内的位点整合问题 乳蛋白基因表达种系间组织特异性问题 目的蛋白的翻译后修饰问题 转基因表达产物的分离和纯化问题 转基因的技术与方法问题 伦理道德问题图中左侧为超级小鼠（将大鼠的生长素基因导入小鼠受精卵的雄原核中），右图中左侧为超级小鼠（将大鼠的生长素基因导入小鼠受精卵的雄原核中），右侧为一般小鼠侧为一般小鼠 内蒙古农业大学生命科学院动物生物技术重大专项项目负责人向记者介绍，2011年5月，他们的科研团队在一头黑白花奶牛怀孕45天的一个胎儿中提取了成纤维细胞，然后在实验室通过一个转染程序，把乳糖分解酶基因转到该细胞中，接着建成含有转乳糖分解酶基因克隆牛胚胎；2011年7月，