过程分子生物学

1、过程分子生物学张 惠 展过程分子生物学分子生物学是生命科学的主导性学科基因的表达与调控是分子生物学的主题思想过程分子生物学是分子生物学理论发展的高级阶段1953-1983 基础分子生物学阶段20世纪50年代 DNA双螺旋模型的建立20世纪60年代 遗传密码的破译20世纪70年代 DNA重组技术的诞生1983-？ 过程分子生物学阶段20世纪80年代 动植物转基因技术的问世20世纪90年代 人类基因组计划的实施21世纪00年代 RNA干扰现象的发现过程分子生物学过程分子生物学523416基因表达的调控机制细胞通讯的分子机制免疫多样性的分子识别胚胎发育的基因表达谱肿瘤发生的分子机制基因组学与系统生物

2、学过程分子生物学基因表达的调控机制BCDAEF原核生物基因表达的启动开关真核生物多转录因子的协同作用原核生物的RNA结构调控真核生物的RNA剪切调控原核生物反义RNA的调控真核生物sRNA介导的RNA干扰G真核生物应答元件的转录调控过程分子生物学1A 原核生物基因表达的启动开关 通过对100多个大肠杆菌启动子的序列分析，结果表明：大多数具有普通生理生化功能的基因所属的启动子，具有统一的特征序列。a 大肠杆菌启动子的多样性TTGACAAACTGTTATAATATATTA16 - 10 bp5 - 9 bp结构基因转录起始位点-35区 T82T84G78A65C54A45-10区 T80A95T4

3、5A60A50T96启动子一个典型的大肠杆菌启动子通常包括下列四个结构要素： 过程分子生物学1A 原核生物基因表达的启动开关 绝大多数原核生物的RNA聚合酶均由五个亚基组成：a a2 2bbbbs s（全酶），其中a a2 2bbbb称为（核心酶）。各种原核细菌的a a、b b、b b亚基呈高度的同源性，唯独s s因子差别较大。RNA聚合酶核心酶对DNA链具有非特异性的亲和力（碱性蛋白与酸性DNA之间的静电引力），但s s因子增强了RNA聚合酶与启动子区域的特异性结合。s s因子帮助RNAa 大肠杆菌启动子的多样性聚合酶识别启动子，同时启动转录。过程分子生物学大肠杆菌启动子与s s因子的对应关

4、系 （Lewins GENES X 2010）氨基酸-35区序列识别数间隔区-10区序列因子/基因TTGACATATAAT100016-18 bp613s 70（rpoD）CTGGNATTGCA56 bp477s 54（rpoN）CCCTTGAACCCGATNT3013-15 bp284s 32（rpoH）TTGACATATAAT10016-18 bp330s S（rpoS）CTAAAGCCGATAA4015 bp239s F（rpoF）GAAYCTGA2016 bp202s E（rpoE）2173s FecI（fecI）TGNCTGCGTCTT15 bp过程分子生物学1A 原核生物基因表达的

5、启动开关 枯草杆菌中存在着大约二十类不同的启动子，其中有些隶属于正常的生理代谢基因，有些则隶属于噬菌体感染、孢子生成、次级代谢过程中的相关基因。 b 枯草杆菌启动子的多样性过程分子生物学在SPO1噬菌体感染过程中的RNA聚合酶及其s因子 SPO1噬菌体感染枯草杆菌后，早期基因表达；4-5分钟后，中期基因表达，早期基因关闭；8-12分钟后，晚期基因表达，中期基因关闭。早期基因的启动子由s s43（即s sA）识别启动，这是枯草杆菌细胞内具有广泛生理生化功能的s s因子，与大肠杆菌中的s s70同源，组成a a2bbbbs s43型RNA聚合酶，转录中期基因表达所需的s s因子编码基因gp28。中

6、期基因的启动子由s sgp28识别启动，它与枯草杆菌的核心酶构成a a2bbbbs sgp28型RNA聚合酶全酶，负责转录晚期基因表达所需的s s因子编码基因gp33和gp34。晚期基因的启动子由s sgp33和s sgp34识别启动，分别构成RNA聚合酶全酶a a2bbbbs sgp33和a a2bbbbs sgp34。过程分子生物学SPO1噬菌体基因表达的级联调控模式通过更换不同的s s因子，识别并作用于不同基因的启动子，最终导致这些基因有次序地级联表达。前一基因编码后一基因表达所需的s s因子。s43s28s28s33 / 34 早期基因中期基因晚期基因（Lewins GENES X 2

7、010）过程分子生物学枯草杆菌的孢子生成过程 枯草杆菌在对数生长阶段结束后，培养基中营养物质耗尽，这时便启动孢子生成过程：先是DNA复制，隔膜形成，孢衣合成，母体裂解，孢子释放。最后在细胞内约40%的mRNA是孢子生专一性的。对数生长期细菌基因组复制隔膜形成DNA转位至前孢孢衣形成母细胞裂解，孢子释放（Lewins GENES X 2010）过程分子生物学枯草杆菌孢子形成过程中的RNA聚合酶及其s因子 当环境压力（例如营养成份枯竭）时，枯草杆菌细胞内发生一连串的磷酸基团传递反应，最终导致转录调控因子Spo0A的磷酸化。磷酸化了的Spo0A同时启动两种不同操纵子的转录，分别表达出s sproE和

8、s sF。s sF一方面启动s sG的表达，另一方面又表达SpoIIR，后者再激活隔膜结合型蛋白SpoIIGA，活化了的SpoIIGA将母体细胞中表达的s sproE裂解为有活性的s sE；而在前孢区域内产生的s sE均被前孢特有的蛋白酶摧毁殆尽。母体细胞中s sE的活性是激活前孢区域s sG所必需的（通过SpoIIA和一种未知蛋白因子）；而s sG的活性又能产生一种信号，跨隔膜激活母体细胞中的s sK。即：s sF s sE s sG s sK 。过程分子生物学枯草杆菌孢子子交叉激活形成过程中两条途径的 s因s sFs sEs sGs sK激活表达前孢区母细胞Spo0ASpo0As43s43

9、sFsproEsEsGsproK隔膜SpoIIRSpoIIGASpoIIAsK5 h5 h打开262个基因打开75个基因打开48个基因打开81个基因SpoIVB过程分子生物学枯草杆菌各类s因子识别启动子的序列偏好性 Science 335 2012 19 bpsAsB18 bpsD15 bp15 bpsHsL13 bpsWsF17 bp17 bpsGsE14 bp13 bpsK过程分子生物学1A 原核生物基因表达的启动开关 链霉菌启动子的结构具有很大的离散性，通过对100多个启动子序列的比较，可将链霉菌启动子分成三大类： c 链霉菌启动子的多样性 具有典型原核生物启动子-10区和-35区特征的

10、启动子，仅占21% 具有典型原核生物启动子-10区而无保守的-35区的启动子 既无典型原核生物启动子-10区又无保守的-35区的启动子过程分子生物学1A 原核生物基因表达的启动开关 天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）的全基因组中存在多达65种不同的s s因c 链霉菌启动子的多样性s s66（hrdB） 链霉菌最重要的s s因子，hrdB-突变是致死性的。hrdB基因全程表达，称为看家基因。s sWhiG（whiG） 链霉菌次级代谢基因转录所需的s s因子。s sF链霉菌孢子生成基因转录所需的s s因子。s sBldN（bldN）链霉菌气生菌丝发育基因转录所需的s s

11、因子。s sR（sigR）链霉菌响应氧化压力基因转录所需的s s因子。s sE（sigE）链霉菌感应细胞膜完整性功能所需的s s因子。子，其中已被鉴定的有：过程分子生物学1B 真核生物多转录因子的协同作用 真核生物尤其是高等真核生物（哺乳动物）由于其细胞的高度分化，决定了基因转录调控机制的复杂性。 与原核生物不同，哺乳动物细胞内共有三大类RNA聚合酶系统，它们均由多转录因子构成，识别三大类真核生物的启动子，分别承担rRNA、mRNA、tRNA的转录。所有三种RNA聚合酶均由8-14个亚基组成，500kD，但它们并不能单独启动基因的转录。过程分子生物学1B 真核生物多转录因子的协同作用启动子由两

12、部分元件构成。a RNA聚合酶 I 启动转录的程序 RNA聚合酶 I 定位于核仁，负责转录rRNA编码基因。RNA聚合酶 I 只作用于一种类型的启动子，这类过程分子生物学高等真核生物 I 型启动子的结构结构基因I 型启动子转录起始位点上游启动子元件（UPE）核心启动子GC丰富区GC丰富区增强启动效果启动基因转录CTCCGAGTCGNNNNNNNTGGGCCGCCGG 人类的这两个重复序列具有85%的同原性过程分子生物学I 型启动子介导rRNA基因转录的启动过程RNA聚合酶 I 在 I 型启动子处的定位需要两种转录因子并经历三个阶段：UBF1（UPE结合因子）装配因子SL1（四聚体核心结合因子）

13、定位因子其中之一为 TBPUBF1SL1起始位点核心启动子上游启动子元件（UPE）Pol IUBF1结合在启动子的UPE处SL1结合在核心启动子处Pol I 加入TBP过程分子生物学1B 真核生物多转录因子的协同作用 RNA聚合酶 II 定位于核内，负责转录mRNA的前体分子hnRNA。 RNA聚合酶 II 及其作用的 II 型启动子是真核生物细胞中最广泛最典型最重要的转录启动元件。b RNA聚合酶 II 启动转录的程序过程分子生物学高等真核生物 II 型启动子的结构结构基因II 型启动子转录起始位点启动子附加区TATA BOX转录的启动效率转录因子和RNA pol II 识别位点转录的时空特

14、异性启动基因转录转录起始子 Inr核心启动子过程分子生物学高等真核生物 II 型启动子的结构结构基因II 型启动子转录起始位点启动子附加区TATA BOXInrOCT BOXATTTGCAT单向性Oct 因子激活GC BOXGGGCGG双向性SP1 因子激活CAAT BOXGGCCAATCT双向性CTF/NF1 因子激活上述附加区元件并不一定同时存在，而且在间隔、排列顺序、拷贝数上均有很大的可变性。过程分子生物学高等真核生物 II 型启动子的结构结构基因II 型启动子转录起始位点启动子附加区TATA BOXInr TATA BOX 位于 -25区，普遍存在于所有的真核生物细胞中，由八对碱基组成

15、，两侧为GC碱基对。少数不含TATA BOX 特征结构的启动子成为 TATA-less 启动子。过程分子生物学RNA聚合酶 II 与转录因子复合物装配因子TF II A B E F H J RNA聚合酶 II 本身由10-12个亚基组成 ，这些亚基具有类似于原核细菌RNA聚合酶中a a、b b、b b亚基的功能，但同样不能识别启动子。对启动子的专一性识别由若干的一般转录因子负责。这些一般转录因子分为两大类：装配因子和定位因子。 定位因子聚合酶 IITBP TAFa a2bbbbs s 因子真核生物： 原核生物： 过程分子生物学II 型启动子介导的基因转录启动过程各种一般转录因子和RNA聚合酶

16、II 严格按照既定的顺序依次结合在DNA及其蛋白复合物上，每种一般转录因子的加入均使DNA-蛋白质复合物的空间构象发生一次改变，而这种构象变化又是下一轮的转录因TATAStartpointTFII DTAFsTBPTFII ATFII BTFII FPol IITFII JTFII HTFII E子加入所必需的。启动子校对转录启动流产转录加固过程分子生物学II 型启动子介导的基因转录启动过程TFIIH是唯一一种具有多重独立酶活性的一般转录因子，其酶活性包括ATP酶、双向解旋酶以及使RNA聚合酶II尾部CTD结构域磷酸化的磷酸激酶。RNA聚合酶II一旦被磷酸化，所有的一般转录因子便从转录起始复合

17、物上剥落下来，转录由起始阶TFII JTFII HPPPP段转换到延伸阶段。TFII F / Pol II过程分子生物学RNA聚合酶 II 在近启动子处暂停介导的转录延伸调控机制 以RNA聚合酶 II 为核心的转录因子复合物在 II 型启动子处装配完毕后，转录启动。但随后的转录进程并非像人们想象的那么一帆风顺。事实上在很多果蝇和哺乳动物的基因中，刚刚启动转录的RNA聚合酶 II 会在转录起始位点下游25-50个碱基处停顿下来。一些蛋白因子促进RNA聚合酶 II 快速进入停顿位点，而NELF（负延伸因子）和DSIF因子则起到稳定处于停顿状态的聚合酶 II 的作用。快速进入停顿位点慢速逃离停顿位点

18、过程分子生物学RNA聚合酶 II 在近启动子处暂停介导的转录延伸调控机制RNA聚合酶 II 从停顿位点逃离的先决条件是一些能促进其逃离的蛋白因子的出现。这些因子将正转录延伸因子b（P-TEFb）招募至RNA聚合酶 II 处，并使NELF磷酸化。被磷酸化的NELF从RNA聚合酶II上解离，后者得以逃离，新近的果蝇全基因扫描研究表明，三分之一以上的基因在转录起始后能产生短小的RNA序列，表明这种启动子邻近区的RNA聚合酶II停顿是控制转录输出的普遍战略。（Science 327，2010）转录加速；反之转录将缓慢进行。过程分子生物学1B 真核生物多转录因子的协同作用 RNA聚合酶 III 定位于核

19、内，负责转录tRNA和小分子 核内RNA（snRNA）。相应的 III 型启动子有两种类型： tRNA编码基因所属的启动子称为内源型启动子； snRNA编码基因所属的启动子称为外源型启动子；c RNA聚合酶 III 转录启动的程序过程分子生物学高等真核生物 III 型启动子的结构结构基因III 型内源型启动子转录起始位点BOX ABOX CBOX ABOX BPSEOCTPol III 结合区结合区III 型外源型启动子转录起始位点结构基因过程分子生物学III 型启动子介导的tRNA/snRNA基因转录启动过程TFIIIB由TBP和另外两种蛋白因子组成，其功能相当于定位因子；TFIIIA和TF

20、IIIC属于装配因子。boxAboxCboxAboxB（1型） 转录起始位点TFIIIATFIIICTFIIIATFIIICTFIIICTFIIIATFIIICTFIIICTFIIIBTFIIIBRNA Pol IIIRNA Pol IIITFIIIBTFIIIB（2型） 转录起始位点过程分子生物学1B 真核生物多转录因子的协同作用 由此可见，TBP是所有三种类型的RNA聚合酶转录系统所必需的。在含有TATA BOX的启动子中，TBP特异性地结合在DNA的相应区域；在TATA less 型启动子中，TBP与其它蛋白因子协同作用，结合在DNA的特定区域内。 过程分子生物学1C 原核生物的RNA结

21、构调控 RNA的结构调控是一种转录启动后的基因表达调控方式，其主要形式表现为转录的终止与抗终止作用。 a RNA转录的终止作用 原核细菌拥有两种机制终止RNA聚合酶的转录，它们分别称为顺式终止和反式终止。 过程分子生物学介导转录顺式终止的内源性终止子 内源性终止子结构的组成为富含GC碱基的发夹结构以及下游的寡聚U链（通常是6个U）。它们由DNA上的终止子序列编码，出现在转5 A U C G CA UA UU AC GC GC GG CA UA UA UC GA GG CU AU AC UC GG CG CGAGUAG URNA聚合酶U U U U U U 3 录中的RNA结构中。 真核生物的转

22、录终止机制也与顺式终止相似。 AGUA U过程分子生物学介导转录反式终止的Rho因子依赖性终止子 基因转录的反式终止多见于噬菌体中。终止位点为CUU中的某个碱基，其上游 50-90 bp 的序列中无茎环发夹结构，但碱基组成特殊：C 41%，G 14%，A 25%，U 20%。在这种Rho（r）因子专一性识别的终止子结构内，若缺失若干个C，甚至一个C，便会导致不能终止的RNA聚合酶Rho因子识别结合区5 AUCGCUACCUCAUAUCCGCACCUCCUCAAACGCUACCUCGACCAGAAAGGCGUCUCUU 3 现象发生。过程分子生物学反式终止的机制 Rho因子呈六聚体，具有ATPa

23、se活性。当RNA聚合酶转录出富含C的Rho因子识别位点时，Rho因子便与转录出的RNA链结合； Rho因子沿RNA链向RNA聚合酶方向移动，由于其移动速度快于RNA聚合酶，因此当RNA聚合酶转录出终止位点CUU时，Rho因子正好赶上； Rho因子水解ATP释放能量，拆开DNA-RNA杂合链，转录遂终止。但若在Rho因子与RNA聚合酶之间存在着核糖体，则Rho因子不能终止转录CUURho因子过程分子生物学1C 原核生物的RNA结构调控b RNA转录的抗终止作用 在某些特殊条件下，由RNA聚合酶引导的转录并不能在终止子处顺利终止，这种现象称为“转录过头”，其发生 RNA的结构调控是一种转录启动后

24、的基因表达调控方式，其主要形式表现为转录的终止与抗终止作用。 机制是细胞内的转录抗终止作用。过程分子生物学细菌衰减子依赖性的转录抗终止作用UGGUGGCGCACUUCCUGAACC5 ACUAUGUGACGGGUCAAU GC GU A AAGCAAUCAGAUACCCAGCCCGCCUCGGGCGGAUUA AU U U U U U U 3 UGGUGGCGCACUUCC5 U G A AACAUGUGACGGUGGAUACCCAGCCCGCCUU ACGAAAGCAAUCAUCCAGCU A A U GAGUCGGGU U U U U U UC 3 另一个则位于正常的基因编码区下游。细胞内

25、条件的变化，可使基因的转录在两个顺式终止子结构的某一个处终止。这种结构称某些细菌的结构基因含有两个顺式终止子，其中一个位于基因上游的编码 区 内 ，为衰减子。相互转换过程分子生物学细菌衰减子的转录抗终止机制大肠杆菌的色氨酸操纵子中含有一个衰减子结构。在基因的5端编码区有两个连续排列的色氨酸密码子。当细胞内色氨酸匮乏时核糖体在色氨酸密码子处暂停翻译，衰减子的2链和3链形成双链结构，第一个终止子结构不能形成，转录继续进行；当细胞内色氨酸充足时，翻译不在色氨酸密码子处停止，结果产生终止子结构，转录遂终止。过程分子生物学噬菌体抗终止因子依赖性的转录抗终止作用 大肠杆菌 l 噬菌体早早期基因和早期基因的

26、表达产物往往是晚期基因表达的调控因子。早早期基因表达产物的调控机制有两种： 一是作为 s 因子识别早期基因和晚期基因启动子，启动表达这两组基因；二是作为转录抗终止因子，使宿主细胞的RNA聚合酶转录过头，导致早期基因和晚期基因的表达。这两种方式均为正调控作用。过程分子生物学噬菌体抗终止因子的作用 大肠杆菌l噬菌体感染大肠杆菌后，在PL启动子的介导下表达出抗终止因子N蛋白，它以一种独特的方式使阻止Rho因子的转录终止作用，使早早期基因转录过头并转录出早期基因的mRNA N蛋白的半衰期只有五分钟，它决定了早期基因表达周期的长短。tL1tR1PLPRNcro左向转录单位右向转录单位抗终止因子 NtL1

27、tR1过程分子生物学抗终止因子的工作原理 大肠杆菌 l 噬菌体的抗终止因子N特异性识别早早期基因内部的nut位点，并且在RNA聚合酶到达这里时与之结合，形成复合物。这种复合物能有效抑制Rho因子的结合作用，从而干扰Rho因子介导的转录终止效应，导致早早期基因的转录过头 Q因子以类似的机制使得早期基因转录过头。启动子终止子RNA聚合酶nut 位点r 因子NusB / NusENusA NusGNCGCTCTTANNNNNNNNNAGCCCTGAAPuAAGGGCAGCGAGAATNNNNNNNNNTCGGGACTTPyTTCCCGT过程分子生物学1D 真核生物的RNA剪切调控 真核生物大多数的分

28、裂基因（即含有内含子的基因）在转录后必须切除内含子序列。正常剪切时，外显子的序列和个数是恒定不变的；但有些基因的转录产物会出现剪切多样性（另类剪切模式），即一种基因转录物产生多种不同的mRNA，其中包括外显子的缺失或内含子的保留。甚至在某些细胞内，这些由于剪切多样性而产生的不同蛋白质会同时出现，并且均为细胞正常生物功能所必需。据统计，哺乳动物体内表达的基因90%以上是被另类剪切的。过程分子生物学1D 真核生物的RNA剪切调控a RNA前体的正常剪切与另类剪切内含子保留5另类剪切3另类剪切外显子跳越外显子相互排除外显子组合选择启动子另类剪切多聚尾另类剪切pApA过程分子生物学1D 真核生物的RN

29、A剪切调控b RNA前体的另类剪切导致蛋白质功能的多样化CaMKIId 基因E13E14E15E16E17dA 蛋白dB 蛋白dC 蛋白过程分子生物学1D 真核生物的RNA剪切调控c 黑腹果蝇性别决定与剪切多样性的关系 黑腹果蝇的性别决定过程由三个性别特异性的RNA剪切程序支配，涉及到三个与性别决定有关的基因：Sxltradsx过程分子生物学果蝇胚胎性别决定的最初机制 （PRINCIPLES OF GENETICS，2010）Sxl-RNAXXX 染色体基因常染色体基因XYX 染色体基因常染色体基因XX型胚胎XY型胚胎Sex-lethal gene Sxl X-linked拮抗作用过程分子生物

30、学Sxl 基因转录产物的另类剪切导致雌性细胞产生SXL蛋白XX型胚胎XY型胚胎Sxl genePMPEE2E3E4 - E8PMPEE2E3E4 - E8含终止密码子含终止密码子Pre-mRNASxl-mRNASXL proteinPre-mRNASxl-mRNASXL proteinNo function由最初机制控制另类剪切随后由自身控制另类剪切过程分子生物学tra 基因转录产物的另类剪切导致雌性细胞产生Tra蛋白tra 基因雄性细胞 正常剪切雌性细胞 另类剪切E1E2E4E3TRA 200 aaSXL蛋白在XX型胚胎（即未来的雌性个体）中的特异性产生，巩固了果蝇胚胎发育性别决定的基础。最

31、新的体外实验结果（2011）也证实：SXL过量表达导致原始生殖细胞分化为卵细胞；而SXL表达抑制则使原始生殖细胞分化为精细胞。Sxl蛋白含有高比例的Arg和Ser残基，类似于其它的RNA结合蛋白，是tra基因转录产物另类剪切的调控因子：No functionSXL终止密码子过程分子生物学dsx 基因转录产物的多样性剪切导致细胞产生Dsx两性蛋白与tra不同，另一个tra基因（tra2）的转录物只有一种剪切模式，因而在XX和XY两种类型的胚胎中，TRA2蛋白均存在。TRA和TRA2蛋白均含有剪切所必需的Arg-Ser型RNA结合结构域，它们共同调控位于常色体上的两性基因dsx（doublesex

32、）转录物的剪切模式：dsx 基因雌性特异性蛋白雄性特异性蛋白E1E5E4E2E3E6TRA2TRA + TRA2终止密码子过程分子生物学dsx 基因转录产物的多样性剪切导致细胞产生Dsx两性蛋白Sxltratra2dsxSxl RNAtra RNAtra2 RNAdsx RNASxl mRNAtra mRNAtra2 mRNAdsx mRNA转录剪切翻译XXXYSXLDSXTRATRA2雌性蛋白雄性蛋白雌性蛋白阻遏雄性发育基因表达；雄性蛋白阻遏雌性发育基因表达过程分子生物学1E 原核生物反义RNA的调控 反义RNA是指能与mRNA、DNA片段、RNA引物互补的RNA分子。通过与RNA引物、基因

33、DNA片段、mRNA链的互补配对，分别抑制基因的复制、转录、翻译过程。原核生物的反义RNA由反义基因编码，其本身的转录可为蛋白因子启动转录而正调控；亦可由蛋白因子降解反义RNA而负调控。 反义RNA在原核生物中广泛存在，是一种较为普遍的基因表达调控方式。目前，根据反义RNA原理设计的各类反义核酸，在实验生物学领域已被广泛用于基因表达的特异性阻遏剂；在医学药学领域也被用来治疗恶性肿瘤及病毒感染等疾病，即反义技术。过程分子生物学1E 原核生物反义RNA的调控a 反义RNA抑制DNA复制 直接抑制机理：反义RNA直接与DNA的复制起始位点结合，阻 间接抑制机理：反义RNA与RNA引物结合，使之不能与

34、DNA复制模板互补，从而间接影响DNA的复制。如大肠杆菌ColE1质粒的复碍复制起始蛋白的识别与结合，导致DNA复制不能启动。制、金黄色葡萄球pT181质粒的复制均采用这种机制。过程分子生物学控制复制引物与模板的结合oriE.coli ColE1 plasmid复制方向rop（+）RopRNA IIRNA I3553反义RNA间接抑制ColEI质粒的复制启动引物型RNA调控型RNA过程分子生物学1E 原核生物反义RNA的调控b 反义RNA抑制基因转录P 1P 2反义RNA能以两种不同的方式改变编码在相反链上的基因的转录；即转录干扰和转录衰减转录干扰发生在从一个启动子反义RNA介导的转录干扰效应

35、处起始的转录阻遏第二个启动子启动转录。例如，丙酮丁醇梭菌从S-box反义RNA的启动子处转录出的反义RNA能阻断相反DNA链上编码的操纵子ubiG-mccBA的转录启动。转录干扰过程分子生物学1E 原核生物反义RNA的调控b 反义RNA抑制基因转录P 1P 2反义RNA也可与靶mRNA的5-端序列互补从而阻止靶mRNA的继续转录，使之产生非成熟性的转录物（即转录衰减效反义RNA介导的转录衰减效应应）。例如：大肠杆菌中的tic-RNA（转录抑制互补性RNA）可与cAMP受体蛋白的5端mRNA区域互补结合，形成特殊的空间结构迫使其转录停止。转录衰减过程分子生物学1E 原核生物反义RNA的调控c 反

36、义RNA抑制mRNA翻译 反义RNA主要的调控功能表现在翻译水平上。原核生物的研究已经确定，反义RNA抑制翻译有下列三种作用方式：与mRNA的5端非编码区（5-UTR）结合，阻碍其在核糖体上的准确定位；与mRNA的5端编码区（主要是起始密码子AUG）结合，抑制翻译的起始；与mRNA全编码区结合，抑制其翻译模板的功能。过程分子生物学大肠杆菌利用反义基大肠杆菌的ompC和ompF基因编码外膜蛋白，OmpC使胞内渗透压提高；OmpF使胞内渗透压降低。当环境渗透压增加时，膜蛋白EnvE激活胞内的OmpR蛋白，后者诱导ompC和micF两个基因转录。micF转录物是ompF-mRNA的反义RNA，它能灭

37、活ompF-mRNA，从而降低胞内OmpF的浓度。因调节细胞的渗透压UUUUUU CUUUAUCCC-CAUUUGUCUGUAAGUCUUUACUUACUGCAUUAUUUAUUACUGACGGGCAGUGG-CAGGUG-UCAUAAA AUGAGGUAAUAAAUAAUGAUUGACAGAACUUAACACAAAUU AAG CG CC GU GU AA UC GG CG CUUUU CAGAGG：SD序列AAUG：起始密码子EnvEOmpRmicFompFompF mRNAmicF RNA过程分子生物学大肠杆菌利用反义基大肠杆菌的R1质粒上含有hok和sok基因。hok编码由52个氨基酸

38、组成的稳定的毒素蛋白，能使细胞膜去极化而杀死细胞。Sok编码hok的反义RNA。当细胞分裂时，如果子细胞没有分配到R1质粒，HoK蛋白就会杀死子细因维持质粒的稳定性细胞，因为亲本细胞中Sok转录出来的反义RNA不稳定而被降解；如果子细胞分配到R1质粒，则Sok基因就能源源不断地为子细胞提供反义RNA，以阻断半衰期较长的hok mRNA翻译出HoK毒素蛋白，细胞得以存活。该hok/sok系统保证了细菌品系的稳定性过程分子生物学1E 原核生物反义RNA的调控d 反义技术在实验生物学和医学中的应用策略 受反义RNA特异性阻断基因表达的原理启发，人们利用生物合成甚至化学合成的方法，制备了一系列针对特定

39、病变基因（如癌基因）或病原体基因的反义试剂或反义药物，一方面期望通过这些特异性的基因表达阻断试剂，体内探查特定基因的功能（即所谓的loss-of-function战略）；另一方面也希望能利用这些反义药物对付日趋严重的基因分子疾病和病毒感染疾病。过程分子生物学由靶基因的反向表达体内生成相应的反义RNA将靶基因的编码序列反向接在转录起始位点的下游，转录出来的RNA即为靶基因53535353启动子终止子target GENEtarget GENEmRNAantisense RNA会降解RNA。这种战略缺点在于：反义RNA分子量大，容易引起体内免疫攻击另外，核酸酶也的反义RNA。过程分子生物学人工设计

40、合成修饰型的小分子反义RNA锁核酸 LNA肽核酸 PNAOCH2OOHB核糖核酸 RNA过程分子生物学人工设计合成修饰型的小分子反义RNAPOOOOPOOOOCH2OOHNNNNNH2ACH2OOHGNNONH2CPOOOOCH2OOHNNNNH2NOHPOOOOCH2OOHUOH35NNOOHOOOOCH2OOHNNNNNH2ACH2OOHGNNONH2CCH2OOHNNNNH2NOHCH2OOHUOH35NNOOHSOOOSOOOOSOOOOSORNASNA过程分子生物学反义吗啉寡聚核苷酸 anti-MO oligoPOOOOPOOOOCH2OOHNNNNNH2ACH2OOHGNNONH2

41、CPOOOOCH2OOHNNNNH2NOHPOOOOCH2OOHUOH35NONOHTNNOCH3OGNNNNH2NOH3OPONNONNNNNH2ANNONH2C5ONONOPONOPONNORNA靶分子人工设计合成修饰型的小分子反义RNA过程分子生物学1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰 RNA分子在遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程中扮演着重要的角色，但几十年来有关RNA的消息只能听到微弱的声音。近十几年来接连不断的发现表明，一类被称为小RNA（small RNAs）的物质操纵着很多生命过程。它们能改变基因的表达水平甚至关闭基因、编辑基因组、哄骗细胞形成特定的组织。因此该领域的研究成果

42、被Science杂志连续两年（2001-2002）评为年度十大科成就之一。过程分子生物学1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰a RNA干扰作用的发现 1993年，康奈尔大学的Su Guo在用人工合成的反义RNA阻断线虫基因表达的实验中偶然发现，反义RNA和正义RNA都能阻断靶基因的表达，他对这个结果百思不得其解。直到1998年，美国卡内基研究所的Andrew Fire用确凿的实验结果证明，在正义RNA阻断基因表达的实验中，真正起作用的是小分子的双链RNA，它们是体外转录正义RNA时生成的。上述双链RNA对基因表达的阻断作用称为RNA干扰（RNAi）。随后大量的研究发现，RNAi 现象广泛存在

43、于线虫、果蝇、斑马鱼、真菌、植物、哺乳动物乃至人体内，它们借助于RNAi 抵御病毒的感染，阻断转座子的转座作用，以维持其基因组的相对稳定性。过程分子生物学1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰a RNA干扰作用的发现RNA干扰与先前所说的转录后基因沉默、转基因沉默等术语都是一回事，但常与基因表达的反义抑制相混淆。反义抑制过程并不涉及mRNA的催化降解，只是单链反义RNA物理上与mRNA结合并阻断其翻译。Andrew Fire 和 Craig Mello因他们关于线虫RNA干扰的研究（1998）而分享2006年的诺贝尔生理学或医学奖。过程分子生物学b RNA干扰的作用机理 外源性的双链RNA，不

44、管来自病毒RNA基因组的感染还是人工的导入，均在细胞质中被Dicer酶裁剪成22-24bp的短小双链片段，即 small interfering RNA（siRNA），其3端含有两个凸出的碱基，负责siRNA的迁移和对靶序列的识别。在RISC复合物的协助下，双链siRNA拆成单链，然后再与具有互补序列的靶mRNA分子结合，形成局部双链。后者或遭RNase的降解，或直接阻断靶mRNA的翻译。AGO 复合物AGO 复合物过程分子生物学1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰c 细胞内固有的miRNA 前已述及，siRNA是由体外来源的双链RNA经细胞内的Dicer酶加工的sRNA被命名为：micro

45、RNA（miRNA）。 进一步的探索发现：在动物、植物、真菌的细胞核内，从结构致密的异染色质中心粒区域的DNA重复序列上会转录出一些特殊的RNA前体大分子，它们同样在类似蛋白因子的作用下，形成长度为21-23个碱基的单链sRNA分子，并发挥特殊的生物学功能。这种细胞内编码的固有而成的。那么细胞内是否也存在着固有的RNA类似物呢？过程分子生物学miRNA的形成首先从异染色质中心粒区域的DNA重复序列上转录出大分子的非编码型RNA前体（pri-miRNA），后者在核内被微加工器复合物（由RNaseIII组成）先切成大约70个核苷酸的茎环结构（pre-miRNA），然后再被运输到细胞质中由Dicer

46、进一步裁剪，形成成熟的miRNA分子，最后再由几种因子装配而成。过程分子生物学Science 319, 1787, 2008miRNA的生物功能异染色质装配外成性修饰转录调控转录物剪切调控转录物稳定调控翻译抑制结构域构成过程分子生物学（Lewins GENES X 2010）miRNA介导的翻译抑制模式AAAAAAAAAAAAAAAAGORISC：AGO + GW182核糖体抑制翻译延伸AAAAAAAAGOAA降解翻译产物竞争帽子结构Cap抑制核糖体装配抑制mRNA环化AGOGW182mRNA触发剪尾脱帽DCP2miRNA过程分子生物学1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰d RNA干扰原理的

47、应用 如果将外源的双链RNA导入细胞中，则双链RNA分子一方面在Dicer的作用下裂解成siRNA；另一方面在以RNA为模板的RNA聚合酶RdRP的作用下自身扩增，其扩增产物再被Dicer裂解成siRNA。后者解链并与RISC复合物一起作用于靶mRNA上，一方面使其降解，另一方面又以siRNA作为引物，mRNA为模板，在RdRP催化下合成出mRNA的互补链，结果mRNA也变成了双链RNA。它在Dicer的作用下也同样被裂解成siRNA。通过这种体内的RNA聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。相关研究结果表明，从21-23个碱基的siRNA到几百碱基对的双链RNA都能诱发RNA干扰作用，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显优于短的双链RNA。需要指出的是，人类和果蝇体内不存在RdRP，故无法进行上述siRNA扩增。过程分子生物学1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰d RNA干预原理的应用上述RNA干扰原理在分子生物学研究领域中的用途包括：通过基因表达的特异性阻断作用，确定基因的功能通过基因表达的特异性阻断作用，实施基因治疗然而，如何将特定的双链RNA分子高效导入活细胞、活组织、活生物个体中，并维持其稳定性，目前还是一个技术难题。过程分子生物学1F 真核生物sRNA介导的RNA干扰