动物转基因技术

1、动物基因工程发展历程古语有云龙生龙凤生凤，兔子生来会打洞。老祖先么通过长期生活经验总结出的俗谚往往与现代科学发现有着惊人的共同点。现代生物学认为生物的遗传性状由基因决定基因遗传信息的基本单位。一般指位于染色体上编码一个特定功能产物(如蛋白质或RNA分子等)的一段核苷酸序列。 1969年 科学家成功分离出第一个基因1970年，从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶 1972年美国斯坦福大学P.Berg等构建了第一个重组子1973年，S.N.Cohen构建了第一个可以在细胞中表达的重组子1980年 科学家首次培育出世界第一个转基因动物转基因小鼠1983年 科学家首次培育出世界第一个转基因植物转基因烟草

2、1988年 K.Mullis发明了PCR技术加速了基因工程的发展具有里程碑意义1980年，Gordon首次报道用DNA显微注射法获得了转基因小鼠；1982年，美国科学家Palmiter首次将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵的雄性原核中，获得了转基因小鼠，其个体比对照鼠增大一倍，称之为“超级鼠”。转基因动物自1980年代诞生以来，一直是生命科学研究和讨论的热点，随着研究的不断深入和实验技术的不断完善，转基因技术得到了更广泛的应用，几乎每年都有令人瞩目的研究成果报道，有些转基因成果已经进入实用化和商业化的开发阶段。动物基因工程动物基因工程动物转基因主要是将外源基因转移到胚胎细胞内的染色体上，并进行整

3、合、表达和遗传等。动物转基因技术是一项高度综合的技术，它涉及到DNA重组技术、胚胎工程技术和细胞培养技术等，因而这需要多学科的交叉和融合。同时也需要更为严苛的技术手段。动物基因工程简介动物基因工程简介目的基因的分离与克隆表达载体的构建受体细胞的获得基因导入受体动物选择转基因胚胎移植转基因整合表达的检测转基因表达产物的分离与纯化遗传性能研究以及性能选育组建转基因动物新类群等动物基因工程流程物理方法点击穿孔法显微注射法裸露DNA直接注射法化学方法DEAE葡聚糖法磷酸钙DNA共沉淀法脂质体载体包埋法生物学方法病毒转染法胚胎干细胞介导法精子载体法外源基因导入到细胞的方法外源基因导入到细胞的方法这些方法

4、各有自己的特点和优势，但在整个转基因动物生产过程中，其基本原理应该是相同。即将外源基因或体外重组基因经体外增值和修饰转移到动物受精卵或细胞内，或将部分基因剪除或抑制使其在动物体内得以整合和表达，以产生新遗传特征或形状的转基因动物。并能将新的遗传信息稳定地进行世代遗传获得新的转基因系或群体。转基因动物生产基本原理转基因动物生产基本原理将外源基因通过电场作用，导入动物目标组织或器官。由于这种方法能有效导入外源基因，可在多种组织器官上应用,并且效率较高。活体电穿孔法的原理很简单,在直流电场作用的瞬间,细胞膜表面产生疏水或亲水的微小通道105115m ,这种通道能维持几毫秒到几秒,然后自行恢复。在此期

5、间生物大分子如DNA 可通过这种微小的通道进入细胞。电穿孔的法的特点：1理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器官2对导入的外源基因片段的大小没有限制3电穿孔法操作简单快速,电穿孔的时间只有几秒钟,而且DNA片段不需要特殊的纯化操作缺点：首先,外源基因表达持续的时间很短,虽然外源基因导入后最快可在215 小时有表达,但大多12 月后表达量降至很低。外源基因表达的时间主要由于所构建的表达载体和基因导入的靶细胞组织器官不同而存在巨大差异。 电电击穿孔法击穿孔法电电击穿孔法流程图击穿孔法流程图显微注射法是指在显微镜下操作的微量注射技术。可将细胞的某一部分(如细胞核、细胞质或细胞器)或外源物质(

6、如外源基因、DNA片段、信使核糖核酸、蛋白质等)通过玻璃毛细管拉成的细针，注射到细胞质或细胞核内。是研究各种生物分子的作用、制作转基因动物、克隆动物等的重要技术。显微注射法转入基因长度可以达到数百kb，并能随机地整合在受体细胞染色体DNA上，并且直接、相对容易控制应用范围广。但是有时会导致转基因动物基因组的重排易位、缺失或者定点突变显微注射法显微注射法显微注射法流程图显微注射法流程图脂质体载体包埋法脂质体载体包埋法流程反转录病毒具有侵入宿主细胞并整合于细胞染色体DNA的能力。将外源基因DNA插入反转录病毒载体，通过辅助细胞包装成高感染度的病毒颗粒，感染胚胎后，将感染的桑椹期胚胎细胞导入子宫，可

7、发育成携带外源基因的子代动物。该法整合率较高，目的基因不易破坏，多是单拷贝、单位点整合，适合于难以观察到原核的禽类受精卵。由于病毒衣壳大小的限制，目的基因不宜超过10kb，否则影响活性和稳定。此外，病毒DNA可能影响外源基因在宿主动物的表达。病毒转染法病毒转染法流程图转基因动物产业的发展也异常迅猛。据统计全球现有以转基因技术为核心的公司超过40家已成为21世纪生物技术领域的支柱产业。1998年全球动物生物技术产品销售额估计为62亿美元。预计到2010年仅在农业领域销售额将达到110亿美元，其中75亿美元来自转基因动物品种：而利用转基因动物制作生物反应器生产药物和功能蛋白的销售额预计可达500亿

8、美元。可见，虽然部分转基因动物还处于研究与开发生产阶段，但该项技术给我们生产和生活所带来的益处已引起国际学术界和产业界的高度关注。转基因动物的应用发育生物学的研究 转基因动物可用于观察目的基因在胚胎不同发育阶段的特异性表达、关闭及调控机制，了解调控顺序(如增强子、启动子)在组织特异性表达中的作用，此外，转基因动物还可用于识别动物发育过程中的基因(包括内源基因)及其活动，也可测出与动物发育相关的未知基因的表达特性。遗传学研究 利用自然突变或人为修饰的基因作为外源基因，构建转基因动物，研究导人的异常基因的表型效应，可以了解基因站构和功能的盖系，还可用于基因组印迹分析、遗传缺陷的矫正等生命现象的基础

9、理论生命现象的基础理论研究研究心血管疾病的研究各种调节心血管功能的因子如转脂蛋白、转纤维蛋白溶酶原等都可通过转基因动物来了解其生理功能及作用，建立如动脉粥样硬化、突发性高血压、静脉闭塞等转基因动物模型。 肿瘤学研究 肿瘤基因的发现是近10年来肿瘤学研究的重大突破，现已发现乳腺癌基因等100多个肿瘤基因。实验证明，各种脊椎动物都携带肿瘤基因，在通常情况下并不引起细胞癌变，只有在某些条件下才能被激活使癌细胞增生而导致癌变。建立带有肿瘤基因的转基因动物可了解哪些组织对肿瘤基因转化活性敏感、肿瘤形成与其基因的关系、肿瘤基因生长分化影响等等。 遗传病研究 通常是将功能正常的外源基因导入动物体的靶细胞内，

10、用来弥补缺陷的基因，改变患病细胞的遗传物质，进行基因治疗。相反的将显性疾病基因或一个、甚至多个外源基因人为地导入动物体内，就可制备遗传性疾病的转基因动物模型，研究和治疗人类遗传性疾病。免疫学研究 巴宾耐特(Babinet)发现虽然转基因小鼠产生HBsAg，但在6个月内没有任何病理变化，表现为一种持续的带病毒状态。这些结果表明：乙型肝炎患者的肝细胞损伤不是由HBV的HBsAg表达直接引起，而是通过对肝细胞膜上的病毒抗原发生免疫反应造成的。因此，可以用转基因小鼠模型来研究免疫耐受与肝细胞损伤的关系以探讨发病机制。此外，转基因小鼠还为研究第l和第类主要组织相容性抗原的功能提供了新手段。医学研究医学研

11、究经典的遗传育种方法要在同种或亲源关系很近的种经典的遗传育种方法要在同种或亲源关系很近的种间才能进行，并且受到变异或突变的限制，而使用间才能进行，并且受到变异或突变的限制，而使用重组重组DNADNA技术在短时间内就可使技术在短时间内就可使亲缘关系很远的种亲缘关系很远的种间遗传信息进行交换和重组间遗传信息进行交换和重组。另外由于转基因动物。另外由于转基因动物可以稳定地整合外源基因，并在合适的组织表达，可以稳定地整合外源基因，并在合适的组织表达，还能将这种性状遗传给后代，这样就可以生产出生还能将这种性状遗传给后代，这样就可以生产出生长快、产肉、产毛、产奶更多而耗料极少的转基因长快、产肉、产毛、产奶

12、更多而耗料极少的转基因家畜，为家畜改良提供一条重要的途径。家畜，为家畜改良提供一条重要的途径。改良和培育动物新品种改良和培育动物新品种一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器（bioreactor），几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液、腹水等，由此发展了动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。为医药、食品及畜牧业的发展开辟了极为广阔的天地。动物生物反应器动物乳腺动物乳腺生物反应器简介生物反应器简介动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性

13、表达的启动子元件构建转基因动物, 指导外源基因在乳腺中表达, 并从转基因动物的乳液中获取重组蛋白。动物乳腺有广泛表达外源基因的能力，可以生产各种蛋白质和多肽，从小分子肽到大分子蛋白质，从分泌型蛋白到内膜蛋白、多聚蛋白、二价抗体等，显示动物乳腺是一种很好的生物反应器，在生产高附加值蛋白质方面有广泛用途。用动物乳腺生产重组蛋白质产品还有产品活性高、产量高、产品易于纯化、生产成本低等优势。据专家估计，用细胞培养方法生产1药物蛋白，成本8005000美元，而乳腺生物反应器方法只需0.020.50美元；传统药物的研制生产周期是1520年，乳腺生物反应器方法一般为5年。生物反应器技术已成为当今生物工程技术

14、的制高点和市场竞争热点。我国是从1984年开始转基因动物研究的，并于同年获得了含人-珠蛋白基因的转基因小鼠。利用显微注射法，1985年和1986年又分别获得了含人生长激素（MT-hGH）基因的转基因泥鳅和小鼠。1987年获得含有大肠杆菌galk和gpt基因的转基因小鼠。以后又相继获得了含HbgAg乙型肝炎表面抗原基因的转基因兔、转基因猪、含促红细胞生成素（EPO）和HbgAg 2种基因乳腺特异性表达的转基因山羊、含人凝血因子IX的转基因山羊、含人血清白蛋白基因的转基因奶牛、乳腺表达“生物钢”蛋白基因的转基因老鼠30。2003年3月，中国农业大学取得我国首例转基因体细胞克隆牛成功31。同年10月，第二头转有人岩藻糖转移酶基因的体细胞克隆牛出生，这标志着我国已经成熟掌握了转基因体细胞克隆牛的技术体系，在该领域的研究跻身世界前列（人民网）。2004年，利用精子载体法制备乳腺生物反应器的转基因兔模型获得成功，该项目由中国军事医学科学院主持，获得F代转基因兔184只，通过鉴定发现，转基因阳性后代89只，阳性率48.4%动物基因工程研究现状尽管转基因动物发展迅速，对人们的健康生活起了巨大作用，但是目前仍存在一些问题。首先，转基因技术支撑体系不够完善主要表现为目前转基因动物的成功率不高，体细胞克隆等技术环节还有待完善。并且有些技术会对动物健康产生危害，这就需要研究者在转基因技术