第三章 生物细胞培养基灭菌设备

1、发酵机械与设备发酵机械与设备n徐徐 明明 芳芳 博博 士士n教教 授授n暨暨 南南 大大 学学 生生 科科 院院n2015-09-25目录绪论绪论第一篇第一篇 生物质原料处理设备生物质原料处理设备第二篇第二篇 生物反应设备生物反应设备第三篇第三篇 产物分离设备产物分离设备第四篇第四篇 其他设备其他设备第一篇第一篇 生物质原料处理设备生物质原料处理设备n第一章第一章 生物质原料预处理设备生物质原料预处理设备n第二章 生物细胞培养基制备设备本章内容本章内容生物反应器生物反应器检测控检测控制仪表制仪表培养基培养基（）经加工经加工原料原料酶酶细胞细胞生物催化剂生物催化剂（游离或固定化）（游离或固定化）

2、机械能机械能除除菌菌空气空气产品提取纯化产品提取纯化副产品副产品产品产品废物废物热能热能营养物营养物典型工业生物技术过程典型工业生物技术过程培养基制备工艺过程：培养基制备工艺过程： 思考题n1.工业上防止杂菌污染的措施有哪些？n2.如何计算灭菌时间如何计算灭菌时间？n3.某发酵罐内装某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为1310C，原污染程度为每，原污染程度为每1ml含有含有2105个杂菌，已知个杂菌，已知1310C时灭时灭菌速度常数为菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间，求灭菌所需的维持时间。n4、板式换热器的结构域工作原理、板式换热

3、器的结构域工作原理n5、喷淋冷却连续灭菌主要设备与灭菌流程喷淋冷却连续灭菌主要设备与灭菌流程6、喷射加热连续灭菌喷射加热连续灭菌主要设备与灭菌流程主要设备与灭菌流程7、薄板式换热器连续灭菌、薄板式换热器连续灭菌主要设备与灭菌流程主要设备与灭菌流程8、n9、发酵罐实罐灭菌操作要点？、发酵罐实罐灭菌操作要点？n10、发酵罐的灭菌操作步骤1、概述：染菌的危害染菌的危害3 3、实验室灭菌的常规设备、实验室灭菌的常规设备4、湿热灭菌原理与计算1、概述染菌的危害：染菌的危害：。灭菌的定义灭菌的定义n定义： 灭菌与消毒的区别： 是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有所有 微生物微生物，包括营养细胞、细菌芽孢

4、和孢子。用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物病源微生物。 1n目的：n要求：n达到要求的达到要求的(杂菌污染降低到被处理的每杂菌污染降低到被处理的每1000罐中只残留罐中只残留1个活菌的程度个活菌的程度, ,）；n尽量减少营养成分的破坏。尽量减少营养成分的破坏。3、实验室灭菌的常规设备、实验室灭菌的常规设备 主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质，如蛋白质，如酶等，发生凝固、变性，酶等，发生凝固、变性，从而导致微生物无法生存而死亡。n致死温度与致死时间致死温度与致死时间：n 蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；n蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻

5、底；蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；n蒸汽有很大的潜热；蒸汽有很大的潜热；n操作方便，易管理。操作方便，易管理。n微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即： N-任一时刻的活细菌浓度，个/L； t-时间，min； K-比热死速率常数，min-1，越小越耐热 NkdtdN微生物的热力致死动力学方程微生物的热力致死动力学方程：取边界条件取边界条件t0=0，N=N0，对上式积分得，对上式积分得 或或 为理论灭菌时间的对数残留规律公式为理论灭菌时间的对数残留规律公式。0012.303lnlgttNNtKNKN0kttNeN问题：能不能做到绝对无菌？ n升温、冷却两阶段也有一升温

6、、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到定的灭菌效果，考虑到，故可以简单地利，故可以简单地利用式用式n (N/N0) =-kt 来粗略估算灭菌所需时间。来粗略估算灭菌所需时间。http:/ 解解：N0=401062105=81012(个) Nt=0.001(个) k=1.8(min-1) (Nt/N0)=-kt t=2.303/klg(N0/Nt)=2.303/1.8lg(81015) =20.34(min) 由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培 养基加热至养基加热至1000C以上，这个作用较为显著，以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值

7、要短。故实际保温阶段时间比计算值要短。n n1、板式换热器灭菌、板式换热器灭菌n2、管道式换热器灭菌、管道式换热器灭菌一、板式换热器灭菌一、板式换热器灭菌 2009.09郑裕国 王远山 汪钊 陈小龙 朱勍 徐建妙1、板式换热器的组成灭菌灭菌三类连续灭菌（连消）三类连续灭菌（连消）n1.喷淋冷却连续灭菌流程喷淋冷却连续灭菌流程n2.喷射加热连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程 n3.薄板式换热器连续灭菌流程薄板式换热器连续灭菌流程 (Ct/C0)=kt t=2.303/klg(C0/Ct) 式中：式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。的含菌数。 n例

8、例2某发酵罐内装某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，灭菌温培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为度为1310C，原污染程度为每，原污染程度为每1ml含有含有2105个杂菌，已知个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为时灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。，求灭菌所需的维持时间。1、连续灭菌时间的估算、连续灭菌时间的估算解：解：C0=2105(个/ml) Ct=0.001/(40106)=2.510-11(个/ml) t=2.303/klg(C0/Ct)=2.303/15lg(2105)/(2.510-11) =2.37 min 配料罐 连消泵 连消塔 维持罐 冷却罐 蒸汽 蒸汽

9、放汽 冷却水 无菌培养基 进发酵罐 加热保温冷却2、连消塔连消塔-喷淋冷却连续灭菌流程喷淋冷却连续灭菌流程（1）连消塔）连消塔设备构造 。 图2-8 连 消 器 的 构 造出 料 口排 液 口蒸 汽 进 口进 料 口图2-7 连 消 塔 的 构 造 培 养 液蒸 汽培 养 液 图2-9 维 持 罐 的 外 形出 料人 孔放 汽测 温 口进 料（2）维持罐）维持罐体积计算：V-维持罐容积，m3；v-料液体积流量，m3/h；- 维持时间，825min；充满系数60vV（3 3）冷却设备）冷却设备 图2-4 连续灭菌设备流程示意图1-配料罐（拌料罐）2-蒸汽入口 3-连消塔 4-维持罐 5-培养基出

10、口 6-喷淋冷却 7-冷却水1234567 配料罐 连消泵 连消塔 维持罐 冷却罐 蒸汽 蒸汽 放汽 冷却水 无菌培养基 进发酵罐 （4）连消塔）连消塔-喷淋冷却连续灭菌流程喷淋冷却连续灭菌流程加热保温冷却连消塔连消塔- -喷淋冷却连续灭菌流程喷淋冷却连续灭菌流程（1 1）配料预热罐配料预热罐，将配好的料液预热预热到6070，以避免灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，是使高温蒸汽与料液高温蒸汽与料液迅速接触混合，并使料液的温度很快升高到灭菌温度（126126132132）；）；（3 3）维持罐维持罐，维持料液温度，延长灭菌时间（4）冷却管，生产上一般采用冷水喷淋冷却

11、，冷水喷淋冷却，冷却到冷却到40405050后后，输送到预先已经灭菌过的罐内。 图2-5 加热-真空冷却连续灭菌流程生培养液蒸汽喷射加热器维持管膨胀阀急聚蒸发室灭菌好的培养液真空 。 图2-10 喷射加热器示意图1-喷嘴 2-吸入口 3-吸入室 4-混合喷嘴 5-混合段 6-扩大管料液已加热料液 2 3 4 5 6 优点：（2 2）、喷射加热）、喷射加热- -真空冷却流程真空冷却流程4、板式换热器灭菌流程、板式换热器灭菌流程。 图2-6 薄板换热器连续灭菌流程维持段蒸汽加热段热回收段水冷却段生培养液冷却水灭菌好的培养液1、板式换热器的组成n在中进行实罐灭菌实罐灭菌，是典型的分批灭菌。n全过程包

12、括升温、保温、升温、保温、降温三个过程降温三个过程NkdtdNtKNN0lnNNNNNNNNNNNNNN22110221100lnlnlnlnln：n n n Kh-保温阶段的孢子比热死亡速度常数1100/lntRTENNdteA1221lnttKhNNdteAttRTENN322/ln温度随灭菌时间的变化温度随灭菌时间的变化 培养基的间歇灭菌就培养基的间歇灭菌就是将配制好的培养基是将配制好的培养基放在发酵罐或其他装放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起养基和所用设备一起进行加热灭菌的过进行加热灭菌的过 程，程，通常也称为实罐灭菌。通常也称为实罐灭菌。 间歇灭

13、菌过程包括间歇灭菌过程包括升温升温、保温保温和和冷却等冷却等三个阶段三个阶段，图，图57为为培养基间歇灭菌过程培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况。中的温度变化情况。某发酵罐内装培养基某发酵罐内装培养基40m3,在在121下进下进行分批灭菌，设每毫升培养基中含耐热行分批灭菌，设每毫升培养基中含耐热的芽孢为的芽孢为107个，求理论灭菌时间？个，求理论灭菌时间？（分批灭菌的灭菌常数（分批灭菌的灭菌常数 lgk=-14845/T + 36.127） 解：N0= 40106107=41014 N=0.001 lgk=-14845/T + 36.127 =-14845/(273+121)+36.127 =

14、-1.55 k=0.0281 s -1 t= 1/k lnN0/N = 1/0.0281 ln41014/0.001 =1442.6 s =24 min 分空气过滤器灭菌分空气过滤器灭菌并用空气吹干并用空气吹干夹套或蛇管排冷水，开启夹套或蛇管排冷水，开启，也，也可夹套内通蒸汽可夹套内通蒸汽达达70左右左右取样管取样管放料管放料管汽汽120，1105pa保温保温保温阶段，凡液面以下各管保温阶段，凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面上其余道都应通蒸汽，液面上其余各管道则应排蒸汽，不留死各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定角，维持压力、温度恒定罐压接近空气压力罐压接近空气压力向罐内通无菌空气向

15、罐内通无菌空气保温结束，依次关闭保温结束，依次关闭各排汽、进汽阀门各排汽、进汽阀门夹套或蛇管中通冷水夹套或蛇管中通冷水 培养基降温到所需温度培养基降温到所需温度灭菌流程（三路进气、四路出气）灭菌流程（三路进气、四路出气）三路进汽三路进汽：直接蒸直接蒸汽从汽从进入罐内直接加进入罐内直接加热，直到所规定的温热，直到所规定的温度，并维持一定的时度，并维持一定的时间。这就是所谓的间。这就是所谓的“三路进气三路进气”。* ：直接蒸汽直接蒸汽从从排气排气分批灭菌设备示意图分批灭菌设备示意图 n总蒸汽管道压力要求不低于0.3-0.35Mpa，使用压力不低于0.2Mpa。n空消空消：n一般维持罐压0.150.

16、2Mpa，图2-11 实罐灭菌设备示意图冷凝水冷却水进口排料管进汽取样管进汽进汽冷却水出口排气排气排气排气消沫剂管出气口接种管进料口进汽进气管三路进气三路进气n保温阶段保温阶段， 间歇灭菌间歇灭菌n是在所用的发酵罐或其他培养装置中进行的，它是是在所用的发酵罐或其他培养装置中进行的，它是在配制罐中配好培养基后，通过专用管道输入发酵在配制罐中配好培养基后，通过专用管道输入发酵罐等培养设备中，然后开始灭菌。罐等培养设备中，然后开始灭菌。n在进行培养基的间歇灭菌之前，通常先将发酵罐等在进行培养基的间歇灭菌之前，通常先将发酵罐等培养装置的分空气过滤器进行灭菌，并且用培养装置的分空气过滤器进行灭菌，并且用

17、 开始灭菌时，应先放去夹套或蛇管中的冷水，开启开始灭菌时，应先放去夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，通过空气管向发酵罐内的培养基通人蒸排气管阀，通过空气管向发酵罐内的培养基通人蒸汽进行加热，同时，也可在夹套内通蒸汽进行间接汽进行加热，同时，也可在夹套内通蒸汽进行间接加热。加热。n当培养基温度升到当培养基温度升到70左右时，从取样管和放料管左右时，从取样管和放料管向罐内通人蒸汽进一步加热，当温度升至向罐内通人蒸汽进一步加热，当温度升至120C，罐压为罐压为1100Pa(表压表压)时，打开时，打开接种、补料、消泡接种、补料、消泡剂、酸、碱等管道阀门进行排汽，剂、酸、碱等管道阀门进行排汽，并调节好各

18、进汽并调节好各进汽和排汽阀门的排汽量，使罐压和温度保持在一定水和排汽阀门的排汽量，使罐压和温度保持在一定水平上进行保温。当然在保温过程中，应注意凡在培平上进行保温。当然在保温过程中，应注意凡在培养基液面下的各种进口管道都应通人蒸汽，而在液养基液面下的各种进口管道都应通人蒸汽，而在液面以上的其余各管道则应排放蒸汽，这样才能不留面以上的其余各管道则应排放蒸汽，这样才能不留死角，从而保证灭菌彻底。死角，从而保证灭菌彻底。n保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或

19、蛇管中通冷水降温，使培养基的温度降到所需套或蛇管中通冷水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。的温度，进行下一步的发酵和培养。n 培养基间歇灭菌过程中应注意的问题培养基间歇灭菌过程中应注意的问题分批灭菌的优缺点n优点n缺点：缺点：n对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；n蒸汽波动时灭菌不彻底；蒸汽波动时灭菌不彻底；n当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。 分批灭菌与连续灭菌的比较分批灭菌与连续灭菌的比较 分批灭菌与连续灭菌的比较分批灭菌与连续灭菌的比较 n连续灭菌的优点：（适