侧链可功能化两亲性葡聚糖的设计与合成

1、苏州大学本科毕业设计目录摘 要1Abstract2内容提要3第一章 设计选题及构思4第二章 背景资料和考察调研52.1 设计背景资料52.2 设计考察调研52.2.1 葡聚糖52.2.2 二茂铁52.2.3 甲基丙烯酸缩水甘油酯62.2.4 半胱胺盐酸盐6第三章 设计目标及可行性分析73.1设计目标73.2 可行性分析7第四章 设计实践讨论84.1 葡聚糖二茂铁（Dex-Fc）的合成84.1.1所需原料与装置84.1.2具体反应操作94.2 甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰葡聚糖二茂铁的合成（Dex-GMA-Fc）104.2.1所需原料与装置114.2.2具体反应操作114.3 半胱胺盐酸盐与Dex

2、-GMA -Fc反应124.3.1所需原料与装置134.3.2具体反应操作144.4 测试与表征15第五章 结果与讨论165.1葡聚糖二茂铁（Dex-Fc）的结构表征165.1.1 Dex-Fc及相关物质的核磁共振波谱表征165.1.2 Dex-Fc及相关物质的紫外光谱表征175.1.3 Dex-Fc及相关物质的红外光谱表征205.2甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰葡聚糖二茂铁（Dex-GMA-Fc）的结构表征205.2.1 Dex-GMA-Fc的核磁共振波谱表征205.2.2 Dex-GMA-Fc的红外光谱表征215.3 半胱胺盐酸盐与Dex-GMA-Fc反应产物（Dex-NH2-Fc）的结构表征2

3、25.3.1 Dex-NH2-Fc的核磁共振波谱表征225.4 两亲性聚合物胶束相关测试235.4.1 胶束粒径及粒径分布的测定235.4.2 Dex-GMA-Fc 和Dex-NH2-Fc的细胞相容性测试24第六章 小结25参考文献26致 谢28苏州大学本科毕业设计摘 要由于葡聚糖（Dextran）具有很好的生物相容性，并且主链上带有许多羟基可以用于后续修饰，所以功能化葡聚糖非常适合用于药物的输送载体。本文主要研究了一种侧基同时含有乙烯基和二茂铁的两亲性葡聚糖药物载体的合成与表征。首先将葡聚糖与二茂铁甲酸反应，合成葡聚糖-二茂铁（Dex-Fc）。此时的葡聚糖主链上已接有少量二茂铁，但仍然含有大

4、量羟基。接着将此Dex-Fc与甲基丙烯酸缩水甘油酯反应，得到侧链具有乙烯基和二茂铁的葡聚糖衍生物（Dex-GMA-Fc），最后将得到的产物与半胱胺盐酸盐反应，可将乙烯基转化成氨基，获得两亲性共聚物Dex-NH2-Fc。通过核磁共振氢谱（1H NMR）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和紫外可见光谱（UV-Vis）分析合成的聚合物结构，结果表明已成功制得目标产物。最后，利用动态光散射仪（DLS）表征了两亲性葡聚糖胶束的粒径和测试了细胞相容性。关键词：葡聚糖；两亲性；二茂铁；乙烯基侧基作 者：贵慧强指导教师：何金林（副教授）AbstractDue to its good biocompatibil

5、ity and many hydroxy groups in the main chain, functionalized dextran is quite suitable for drug delivery carriers. This thesis mainly studied the synthesis and characterization of an amphiphilic dextran drug carrier with both vinyl and ferrocene side chains. Dextran was first reacted with ferrocene

6、carboxylic acid to synthesize dextran-ferrocene (Dex-Fc). A small amount of ferrocene had been grafted onto the dextran backbone, but a large amount of hydroxyl groups remained. This Dex-Fc was then reacted with glycidyl methacrylate to give dextran derivative (Dex-GMA-Fc) with vinyl and ferrocene g

7、roups in the side chains. And finally the Dex-GMA-Fc was reacted with cysteamine hydrochloride to convert the vinyl groups into amino groups, leading to the producd of Dex-NH2-Fc. The synthesized polymers were analyzed by 1H NMR, FT-IR and UV-Vis spectroscopy and the results showed that the target p

8、roduct was successfully prepared. In addition, the DLS analysis indicated that this amphiphilic dextran copolymer can self-assemble into micelles in aqueous solution and this copolymer displayed favorable cytocompatibility.Keywords: Dextran; Amphiphilic copolymer; Ferrocene; Vinyl side chainsWritten

9、 by: Huiqiang GuiSupervised by: Jinlin He (Associate Professor)内容提要化疗是治疗癌症的一种有效的方法，但是肿瘤细胞具有多药耐药性（MDR）1，对癌症治疗领域构成了巨大的挑战。所以需要多种治疗方法同时使用，其中协同化疗-放射疗法2是克服MDR的有效策略。基于此种理念，我们设计合成具有乙烯基和二茂铁侧链的两亲性葡聚糖。并对其进行表征与测试，具体内容如下：1. 葡聚糖-二茂铁（Dex-Fc）的合成与表征：通过葡聚糖（Dex）与二茂铁甲酸（Fc-COOH）酯化反应合成，并通过乙醇沉淀纯化，通过核磁振氢谱（1H NMR）、傅里叶变换红外光谱

10、（FT-IR）和紫外可见光谱（UV-Vis）分析合成的聚合物结构，并计算所接上二茂铁的量。2. 甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）修饰的葡聚糖-二茂铁（Dex-GMA-Fc）的合成与表征：将第一步合成的Dex-Fc与甲基丙烯酸缩水甘油酯反应，并通过核磁振氢谱（1H NMR）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和紫外可见光谱（UV-Vis）分析合成的聚合物结构。3. 半胱胺盐酸盐与Dex-GMA-Fc反应制备Dex-NH2-Fc：在pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液加入Dex-GMA-Fc，待完全溶解后加入半胱胺盐酸盐反应，得到Dex-NH2-Fc, 通过透析纯化。4. 制备Dex-GMA-Fc和Dex-N

11、H2-Fc的胶束，对胶束的粒径和细胞相容性进行表征。在以后的工作中，可以对侧基乙烯基进行修饰，接上各种药物或者靶向基团，探索载体的治疗效果。第一章 设计选题及构思本设计是希望以葡聚糖为载体，通过侧基修饰得到可功能化的具有辐射增敏作用和可修饰乙烯基的聚合物。葡聚糖是主要来源于真菌、酵母和藻类的一种重要的膳食纤维。根据葡聚糖的来源不同，葡聚糖可以分为多个种类，但每种葡聚糖链段中都含有大量的羟基和链末端还有少量的醛基可以作为修饰位点3。多种分子如靶体配体，药物分子，聚合物等都可以通过葡聚糖上的羟基或者醛基反应并作为药物载体使用4。二茂铁（Fc）由一个Fe原子与两个配位环戊二烯组成，具有通过释放/结合

12、活性氢而表现出的可再循环氧化还原性质5。因此，这种分子可以充当电子的一部分，并在被辐射电离后成为俄歇电子的长期稳定供应者。所以二茂铁可以用作放射增敏剂，在肿瘤内部有效集中更大的局部辐射剂量6。甲基丙烯酸缩水甘油酯具有丙烯酸和环氧基团，活性高，能够与多种基团发生反应且来源广7，可作为接药的桥梁。Dex-Fc与甲基丙烯酸缩水甘油酯反应后会形成端基为乙烯基的侧链。该乙烯基能够被多种功能化硫醇8（例如烷基，氨基，PEG）和胺所修饰形成一系列功能性单元，因此具有潜在输送药物或者基因的可能。通过设计合理的化学实验，在葡聚糖高分子链上接二茂铁与甲基丙烯酸缩水甘油酯，用于接载药物后预计可以得到具有化疗与放疗协

13、同作用的抗肿瘤高分子前药。第二章 背景资料和考察调研2.1 设计背景资料癌症是导致人类死亡的首要疾病之一，根据国际癌症研究机构公布的数据，全球每年约800万人死于癌症9。目前，治疗肿瘤主要有放射治疗（放疗）、化学疗法（化疗）、外科疗法（手术）、基因治疗、传统的中医药治疗和生物治疗方法10。虽然人们研究肿瘤治疗已有许久时间，也提出了各种各样的预防和治疗手段 11,12，但是癌症发病率仍然较高，并在我国呈现上升趋势，平均每分钟有6人被诊断为癌症9。肿瘤是机体在相应致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上无法正常调控其生长，导致细胞异常增生并且分化形成新的细胞13，并且肿瘤还会不断演变。随着它们的

14、生长，突变出现并且遗传上不同细胞的群体出现，耐受治疗的细胞存活并扩大。 无论医生使用什么药物，肿瘤似乎都在适应。针对某些干细胞突变的治疗已经存在，并且它们通常首先产生显著的反应14。一个单一的癌细胞将能够避开双管齐下或三管齐下的攻击机会渺茫，因此可以采用多种方法协同治疗。 2.2 设计考察调研2.2.1 葡聚糖葡聚糖（Dextran）为右旋吡喃葡萄糖聚合体，分子式为(C6H10O5)n，其相邻葡萄糖残基的碳1、2、3、4、6的半缩醛氧之间以葡糖苷键连接构成骨架，有和位两种结构形式15。不同葡萄糖聚合度可以形成分子量不同的右旋糖酐，据其大小，可分为三类：高分子右旋糖酐（平均分子量为10万-20万

15、），中分子右旋糖酐（平均分子量为6万-8万），小分子右旋糖酐（平均分子量为1万-2万）。市场上能买到多种分子量不同且分子量分布范围较窄的葡聚糖。葡聚糖的水溶性较好，具有良好的生物相容性和生物可降解性，分子结构中含有十分多的羟基，可以实现与基因，药物或蛋白质直接或间接的相连，故化学修饰制备应用于药物载体的葡聚糖衍生物已成为目前该领域研究热点之一16,17。2.2.2 二茂铁二茂铁是在1951年由Kealy和Pauson制备生成，并发现该物质对酸和碱以及其分离非常稳定18。环戊二烯基阴离子的每个碳原子的相等不饱和度表明两个这样的单元可以对称地形成与亚铁离子的共价键。二茂铁衍生物具有氧化还原性、芳香

16、性、低毒性及稳定性，在多个领域例如催化方面，电化学及光电功能材料方面，医药、分析方面，添加剂、敏化剂方面等有着广泛的用途19。二茂铁甲酸与葡聚糖反应后可以用作放射增敏剂，在肿瘤内部集中更大的局部辐射剂量，增强放疗效果6。作为人体内的微量元素之一，Fe是具有较高安全性的生物应用性元素20, 21。2.2.3 甲基丙烯酸缩水甘油酯甲基丙烯酸缩水甘油酯（Glycidyl methacrylate, GMA）又称2, 3-环氧丙烷甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸环，缩水甘油甲基丙烯酸酯。目前其最主要作为交联单体，用于涂料、树脂、橡胶、粘合剂中22。GMA与葡聚糖反应后，可为其主链上加上有效乙烯基侧链，可制成p

17、H敏感的葡聚糖-GMA水凝胶23。碳碳双键可用于点击化学24，利用其可靠的，模块化的反应为葡聚糖链上加上各种药物或者基因25。2.2.4 半胱胺盐酸盐半胱胺盐酸盐（Cysteamine hydrochloride, CSH）是一种白色结晶体，溶于乙醇，水。其一头带有氨基，另一头带有硫醇，是一种很好的修饰桥梁药物。可以利用硫醇与双键的反应，为葡聚糖加上含有氨基的侧链。环氧化物和胺之间的反应一直用于合成用于基因递送的脂质和聚合物基纳米颗粒26。第三章 设计目标及可行性分析3.1设计目标通过设计方便有效的化学实验合成具有化疗与可功能化的抗肿瘤聚合物前药，其具体内容是，在药物载体葡聚糖链上辐射增敏剂甲

18、酸二茂铁和易修饰的乙烯基侧链，得到可制备具有协同治疗效果的聚合物前药。3.2 可行性分析本设计所选用的原料：葡聚糖、GMA、甲酸二茂铁与其他原料与试剂均属于正常的实验药品，价格便宜，方便得到。葡聚糖与甲酸二茂铁反应为酯化反应27，其机理明确，反应条件温和。而甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生的葡聚糖（Dex-GMA） 通过使用DMSO作为非质子溶剂在4-(N, N-二甲基氨基)吡啶存在下将GMA偶联到葡聚糖上反应28已有人研究过，课题组也有师兄做过，均可成功。单独的这两步反应均有较高的反应效率，连续反应预期也可得到较理想的产物。并且产物也容易纯化，通过核磁共振波谱、红外光谱、紫外可见光谱等仪器表征。第四

19、章 设计实践讨论4.1 葡聚糖二茂铁（Dex-Fc）的合成葡聚糖二茂铁（Dex-Fc）的合成路线如图4.1 所示。利用葡聚糖（Dex）与二茂铁甲酸发生酯化反应，制备侧链含二茂铁的葡聚糖（Dex-Fc）。图4.1 葡聚糖二茂铁（Dex-Fc）的合成路线Figure 4.1 Synthesis route of Dex-Fc.4.1.1所需原料与装置所需原料见表4.1，其中二甲亚砜需要蒸馏后使用，其他原料可以直接使用。表4.1 合成 Dex-Fc所需原料Table 4.1 The chemicals used for synthesis of Dex-Fc.试剂中文名英文名称纯度来源二茂铁甲酸fe

20、rrocenecarboxylic acid98%上海阿达玛斯试剂有限公司葡聚糖（w = 5 000 g/mol）dextran分析纯上海麦克林生化科技有限公司二甲亚砜（DMSO）dimethyl sulfoxide分析纯江苏强盛功能化学有限公司无水硫酸钠sodium sulfate anhydrous分析纯上海凌峰化学试剂有限公司无水乙醇ethanol分析纯江苏强盛功能化学有限公司N, N-二异丙基碳二亚胺 (DIC)N,N-diisopropylcarbodiimide99%阿法埃莎(天津)化学有限公司4-二甲氨基吡啶(DMAP)4-dimethylaminopyridine99%上海九鼎

21、化学科技有限公司装置：50 mL支管烧瓶、搅拌子、油浴锅、布氏漏斗、耳朵塞、100 mL烧杯、保干器、圆底烧瓶、空心塞、漏斗、针筒、电子天平。玻璃仪器需先放到120 C烘箱中烘干，反应前取出放置于保干器中，等其冷却至室温后方可使用。4.1.2具体反应操作步骤一：蒸馏无水二甲亚砜 在250 mL圆底烧瓶中加入150 mL二甲亚砜，加入合适的搅拌子，加入适量的无水硫酸钠，盖上塞子，放到搅拌器上搅拌。12小时后，将上层清液倒入另一个250 mL圆底烧瓶中，通过油泵进行减压蒸馏。收集35 C左右馏分至接液瓶中。步骤二：葡聚糖与二茂铁甲酸酯化反应 往50 mL支管瓶中充放N2三次，除去瓶中空气，并在充气

22、的条件下加入葡聚糖（0.6482 g, 4 mmol重复单元，12 mmol -OH）, 用10 mL针筒加入20 mL新蒸馏的二甲亚砜，在磁力搅拌器上溶解后依次加入二茂铁甲酸（0.4141 g, 1.8 mmol）、DMAP (0.2199 g, 1.8 mmol) 和DIC (0.2272 g, 1.8 mmol)。完全溶解后充放N2，放置于25 C油浴中反应48小时。步骤三：葡聚糖-二茂铁（Dex-Fc）后处理 反应结束后，将反应装置改为油泵减压抽滤装置，并将油浴温度缓慢升到60 C，除去大部分DMSO至溶液成浓稠状。用滴管将剩下溶液逐滴加入正在搅拌的100 mL乙醇中。其中原料均会溶解

23、在乙醇中，而Dex-Fc在乙醇中沉淀，形成浑浊液，这样就可除去多余的原料及催化剂。沉淀1小时后，将乙醇浑浊液通过布氏漏斗减压过滤，并用乙醇洗涤3次。洗涤干净后将滤纸上的葡聚糖-二茂铁小心得刮到干净的100 mL小烧杯中，加入23 mL DMSO重新溶解，重复沉淀操作。第二次将产物收集到5 mL试管中，用PE膜封口，在膜上用针尖扎一些小孔，先后放入利用水泵和油泵减压的保干器中，除去溶剂。产物质量为0.6492 g，产率为60.7%。表4.2 合成Dex-Fc实验小结Table 4.2 The chemicals and solvents used for synthesis of Dex-Fc.

24、编号mDex (g)nDex (mmol)mFc-COOH (g)nFc-COOH (mmol)VDMSO (mL)产物质量 (g)产率（%）1804120.349120.22191100.229140.21804160.649640.41521.817.50.649260.71804251.9638121.25895.5202.127566.14.2 甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰葡聚糖二茂铁的合成（Dex- GMA-Fc）甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生的葡聚糖二茂铁分子的合成路线如图4.2所示。利用葡聚糖-二茂铁与GMA反应，制备带有乙烯基侧基的葡聚糖-二茂铁分子（Dex- GMA-Fc）。图4.2

25、葡聚糖-甲基丙烯酸缩水甘油酯-二茂铁（Dex-GMA-Fc）的合成路线Figure 4.2 Synthesis route of Dex-GMA-Fc.4.2.1所需原料与装置所需原料见表4. 3。二甲亚砜蒸馏后使用，其他原料均可直接使用。装置：50 mL支管烧瓶、搅拌子、油浴锅、离心机、5 mL试管、耳朵塞、移液枪、100 mL烧杯、保干器、圆底烧瓶、空心塞、漏斗、针筒、电子天平。玻璃仪器需需先放到120 C烘箱中烘干，反应前取出放置于保干器中，等其冷却至室温后方可使用。表4.3 合成Dex-GMA-Fc所需原料Table 4.3 The chemicals used for synthes

26、is of Dex-GMA-Fc.试剂中文名英文名称纯度来源葡聚糖-二茂铁（Dex- Fc）Dextran-Ferrocene-上一步合成甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）Glycidyl methacrylate97%上海阿拉丁生化科技股份有限公司二甲亚砜（DMSO）Dimethyl sulfoxide分析纯江苏强盛功能化学有限公司无水乙醇Ethanol分析纯江苏强盛功能化学有限公司4-二甲氨基吡啶（DMAP）4-Dimethylaminopyridine99%上海九鼎化学科技有限公司4.2.2具体反应操作步骤一：合成Dex-GMA-Fc 往50 mL支管瓶中充放N2三次，除去瓶中空气，并在充气

27、的条件下加入上一步合成的Dex-Fc（0.2926 g, 相当于1.706 mmol Dex-Fc结构单元数）, 用10 mL针筒加入20 mL新蒸馏的DMSO，在磁力搅拌器上溶解后依次加入甲基丙烯酸缩水甘油酯（0.3323 g, 2.56 mmol）和DMAP (0.3128 g, 2.56 mmol)。完全溶解后充放N2三次，确保反应在N2环境下反应，放置于50 C油浴中反应48小时。步骤二：Dex-GMA-Fc的沉淀处理 在反应结束后，将装置改为油泵减压抽滤装置，并将油浴温度升到60 C，除去大部分DMSO溶剂至溶液成浓稠状。用滴管将剩下溶液逐滴加入正在搅拌的100 mL乙醇中。其中原料

28、与催化剂会溶解在乙醇中，而Dex-GMA-Fc在乙醇中沉淀，形成浑浊液，这样就可除去多余的原料及催化剂。 步骤三：离心收集Dex-GMA-Fc 沉淀1小时后，用5 mL移液枪将乙醇浑浊液装入6个7 mL离心管中。称量各管重量，保证质量相近，放入离心机中。离心速度调为8 000 r/min, 离心1 min。离心后倒掉上清液，继续加入剩下的溶液离心。全部离心完后，加入少量 DMSO重新溶解，重复沉淀离心操作。第二次将Dex-GMA-Fc收集到5 mL试管中，用PE膜封口，在膜上用针尖扎一些小孔，先后放入利用水泵和油泵减压的保干器中，除去溶剂。最终得到产物0.2382 g，产率为38.4%。表4.

29、4 合成Dex-GMA-Fc实验汇总Table 4.4 The chemicals and solvents used for synthesis of Dex-GMA-Fc.反应编号Dex-Fc编号mDex-Fc (g)nDex-Fc (mmol)mGMA (g)nGMA (mmol)葡聚糖单元与GMA摩尔比产量 (g)产率 （%）1804181804120.14690.7830.19991.411:1.80.02617.381804211804160.29261.380.33232.341:1.70.238238.391805021804250.90064.20.77595.461:1.3

30、0.88552.794.3 半胱胺盐酸盐与Dex-GMA-Fc反应甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生的葡聚糖二茂铁与半胱胺盐酸盐的反应式如图4.3所示。利用硫醇与甲基丙烯酸酯上的乙烯基进行迈克尔加成反应，可以证明Dex-GMA-Fc上的乙烯基具有很好的活性，可以用来修饰。图4.3 半胱胺盐酸盐与Dex-GMA-Fc反应式Figure 4.3 Synthesis route of Dex-NH2-Fc.4.3.1所需原料与装置所需原料见表4.5。所有原料均可直接使用。装置：50 mL支管烧瓶、搅拌子、透析袋、油浴锅、10 mL试管、烧杯、保干器、圆底烧瓶、空心塞、针筒、电子天平、pH计。玻璃仪器需需先放到

31、120 C烘箱中烘干，反应前取出放置于保干器中，等其冷却至室温后方可使用。表4.5 半胱胺盐酸盐与Dex-GMA-Fc反应所需原料Table 4.5 Materials for the reaction of cysteamine hydrochloride with Dex-GMA-Fc.试剂中文名英文名称纯度来源葡聚糖-甲基丙烯酸缩水甘油酯-二茂铁（Dex-GMA-Fc）Dex-GMA-Fc-上一步合成半胱胺盐酸盐Cysteamine hydrochloride98%Sigma-Aldrich氢氧化钠Sodium hydroxide优级纯永华化学科技（江苏）有限公司二水合磷酸二氢钠Sodi

32、um dihydrogen phosphate dihydrate分析纯国药集团化学试剂有限公司十二水合磷酸氢二钠Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate分析纯国药集团化学试剂有限公司4.3.2具体反应操作步骤一：配制pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液 先配制pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液：称取2.9 g十二水合磷酸氢二钠和0.2966 g二水合磷酸二氢钠倒入1 000 mL容量瓶中，加入超纯水至刻度线。取出20 mL用pH计测量，缓慢加入NaOH至pH读数为8.0。步骤二：半胱胺盐酸盐与Dex-GMA-Fc反应 往50 mL支管瓶中充放N2三次，除去瓶中空气

33、，并在充气的条件下加入上一步合成的Dex-GMA-Fc（31.0 mg）, 加入10 mL pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液，在磁力搅拌器上溶解后加入半胱胺盐酸盐（0.024 g，0.2 mmol，比GMA完全过量）。完全溶解后充放N2三次，确保反应在N2环境下反应，放置于30 C油浴中反应2小时。步骤三：半胱胺盐酸盐与Dex-GMA-Fc反应后处理 将反应完的溶液全部倒入MWCO为3500规格的透析袋中，用少量pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液润洗后也倒入透析袋中，封口。在长筒状玻璃罐中加足量的超纯水与长形搅拌子，放入透析袋，开启搅拌，每2-3小时换一次水。两天后，将透析袋内溶液装入50 mL烧瓶中放

34、入冰箱冷冻层。待完全冷冻成冰后放入真空冷冻干燥箱干燥，两天后取出，得到0.0174产物。表 4.3 半胱胺盐酸盐与Dex-GMA-Fc实验汇总Table 4.3 The chemicals used for synthesis of Dex-GMA-Fc with CSH. 反应编号Dex-GMA-Fc样品编号mDex-GMA-Fc (g)nDex-GMA -Fc (mmol)mCSH (g)nCSH(mmol)pH 8.0缓冲液(mL)产量 (g)1805031804210.03100.1460.02460.217100.01741805071805020.30181.4550.19972.

35、165150.07294.4 测试与表征(1) 核磁共振波谱（1H NMR）使用核磁共振波谱仪（INOVA-400, Varian）对产物进行结构分析。一般取10-15 mg产物，根据溶解性溶解于0.6 mL氘代氯仿（CDCl3）或氘代二甲亚砜（DMSO-d6），使用四甲基硅烷（TMS）作为内标。本实验产物在DMSO中溶解性好，因此都采用氘代二甲亚砜（DMSO-d6）作为溶剂。(2) 紫外可见光分光光度计（UV-Vis） 采用紫外可见光分光光度计（U-3900, Hitachi）对葡聚糖-二茂铁进行结构分析，使用二甲亚砜为溶剂。(3) 红外光谱（FT-IR）使用红外光谱仪（TENSOR-27,

36、 Bruker）对产物进行结构分析。固体样品烘干后与KBr研磨，压片后进行测试。(4) 动态激光光散射（DLS）使用激光粒度仪（Zetasizer Nano-ZS, Malvern）对所得胶束的粒径、粒径分布进行分析。产物胶束直接在水中溶解制得，并在水相测试。第五章 结果与讨论5.1葡聚糖二茂铁（Dex-Fc）的结构表征5.1.1 Dex-Fc及相关物质的核磁共振波谱表征葡聚糖与二茂铁甲酸在25 C下发生酯化反应，得到葡聚糖二茂铁（Dex-Fc），利用核磁共振氢谱可以证明已经成功制备了Dex-Fc。图5.1是葡聚糖的1H NMR谱图，图5.2是Dex-Fc的1H NMR谱图。d 3.2-d 3

37、.7 ppm之间的峰属于葡聚糖环上的质子，d 3.3 ppm 属于水的质子峰，d 2.5 ppm归属于溶DMSO上的质子峰，而d 6.3和d 6.7 ppm属于葡聚糖顶端醛基的质子峰。图5.2对比图5.1，d 4.2 ppm、d 4.4 ppm和d 4.7 ppm分别属于甲酸二茂铁五元环上的质子峰，由此三个质子峰可以说明葡聚糖链上已经接上了二茂铁分子。图5.1 葡聚糖的1H NMR谱图Figure 5.1 1H NMR spectrum of dextran.图5.2 葡聚糖二茂铁分子的1H NMR谱图Figure 5.2 1H NMR spectrum of Dex-Fc.5.1.2 Dex

38、-Fc及相关物质的紫外光谱表征已知甲酸二茂铁分子（Fc-COOH）具有紫外吸收峰，因此我们通过紫外光谱对葡聚糖-二茂铁（Dex-Fc）进行进一步表征。首先我们测试了一系列不同浓度的纯二茂铁甲酸在DMSO中的紫外光谱。另外测试了三个不同浓度的Dex-Fc在二甲亚砜溶剂中的紫外光谱。其中选取两相近浓度得到如图 5.3 所示的紫外光谱图。发现Fc-COOH在270 nm处有一个尖峰，而在Dex-Fc中该峰已经转移到300 nm处，说明甲酸二茂铁分子的化学环境发生了变化，表明Dex-Fc已成功制备。 根据吸光度的计算公式朗伯-比尔定律:=I0Abs=-lgT=klC 其中Abs是吸光度，k是吸收系数，

39、由物质本身性质决定，在相同的测试物质和环境下为一个定值。l是光在样本中经过的距离，由材料容器的长度决定，在同一次测量时使用同一个容量皿，所以也是定值。C为二茂铁的浓度。因此可知，在一定的浓度范围内，其他条件不变情况下，二茂铁的紫外吸光度与浓度成正比。所以我们采用标准曲线法对Dex-Fc中二茂铁含量进行定量分析。 分别准确量取5-6 mg纯二茂铁甲酸和葡聚糖-二茂铁分子，配制一系列一定浓度梯度的溶液。表5.1为二茂铁甲酸标准溶液在吸收波长303 nm处的吸光度与对应的浓度。表5.1 二茂铁甲酸标准溶液的吸光度及浓度Table 5.1 Absorbance and Concentration of

40、 Ferrocene Acid Standard Solution.组数吸光度浓度100.0335970.00307690.0196880.00615280.0358410.01230570.0728860.02460960.1433320.04921950.2730430.09843840.5049660.19687530.9265170.3937521.6713470.787513.4504381.575对此以303 nm处的紫外吸光度为纵坐标，以二茂铁浓度为横坐标，线性拟合得出紫外吸光度Abs与浓度C的标准曲线如图5.4所示，其方程式为： Abs=2.1608*C+0.02374 (R2

41、=0.999)将待测样品用DMSO配置成已知浓度的溶液，测出其在 303 nm 处的吸光度后带入上述方程式中即可求得待测样品中二茂铁的浓度，再通过已知的溶液浓度可以得到产物中二茂铁的含量。表5.2 为经紫外定量分析后测定的葡聚糖分子链上接上的二茂铁含量。并且可以利用二茂铁的含量求出Dex重复单元与Fc的摩尔比，每条链所接Fc数及平均分子量。表5.2 Dex-Fc中二茂铁的含量Table 5.2 Ferrocene content in Dex-Fc.编号理论 Fc含量（%）实际 Fc含量（%）Mn (g/mol)平均每根Dex链上Fc数18041238.8613.3557003.4180416

42、38.9926.4266007.818042539.0624.5365007.1图 5.3 Dex-Fc和Fc-COOH的紫外光谱图Figure 5.3 UV-Vis spectra of Dex-Fc and Fc-COOH.图 5.4 Fc-COOH溶液的标准曲线Figure 5.4 Standard curve of Fc-COOH solution with different concentrations.5.1.3 Dex-Fc及相关物质的红外光谱表征 为了验证葡聚糖有接上二茂铁甲酸，我们使用FT-IR对Dex和Dex-Fc的结构进行了表征。如图5.5所示，相比于纯的葡聚糖，Dex

43、-Fc的红外峰在1745 cm-1处出现了明显羰基特征峰，表明Dex-Fc已经成功合成。图5.5 Dex和Dex-Fc的红外光谱图Figure 5.5 FT-IR spectra of Dex and Dex-Fc.5.2甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰葡聚糖二茂铁（Dex-GMA-Fc）的结构表征5.2.1 Dex-GMA-Fc的核磁共振波谱表征 甲基丙烯酸缩水甘油酯与葡聚糖-二茂铁甲酸在50 C下反应，得到甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生的葡聚糖二茂铁（Dex-GMA-Fc），可以利用核磁共振氢谱证明已经成功制备了Dex-GMA-Fc。图5.6 是Dex-GMA-Fc的1H NMR谱图，在图中可见，d 3

44、.2 ppm到d 3.7 ppm之间的峰属于葡聚糖环上的质子，d 3.3 ppm 属于水的质子峰，d 2.5 ppm归属于溶剂DMSO上的质子峰，d 4.2 ppm、d 4.4 ppm和d 4.7 ppm分别属于甲酸二茂铁五元环上的质子峰，对比Dex-Fc的核磁图5.2，新出现了d 1.9 ppm甲基峰，d 6.0 ppm和d 5.7 ppm左右的双键峰，由此三个质子峰可以说明葡聚糖链上已经接上了甲基丙烯酸酯基团。图5.6 甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰葡聚糖-二茂铁的1H NMR谱图Figure 5.6 1H NMR spectrum of Dex-GMA-Fc.5.2.2 Dex-GMA-Fc的

45、红外光谱表征为了进一步验证甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰葡聚糖-二茂铁的合成，我们使用FT-IR对Dex-Fc, Dex-GMA-Fc和Dex-NH2-Fc的结构进行了表征。如图5.7所示，相比于Dex-Fc，Dex-GMA-Fc的红外峰在1630 cm-1处出现了明显碳碳双键的伸缩振动峰和1430 cm-1处碳碳双键上碳氢的弯曲振动峰，表明Dex-GMA-Fc已经成功合成。并且在Dex-NH2-Fc的红外图中可以看到这这个峰均已消失，既从侧面验证了Dex-GMA-Fc的成功合成，又证明了该乙烯键具有可修饰性。图5.7 Dex-Fc, Dex-GMA-Fc和Dex-NH2-Fc的红外光谱图Figur

46、e 5.7 FT-IR spectra of Dex-Fc, Dex-GMA-Fc and Dex-NH2-Fc.5.3 半胱胺盐酸盐与Dex-GMA-Fc反应产物（Dex-NH2-Fc）的结构表征5.3.1 Dex-NH2-Fc的核磁共振波谱表征半胱胺盐酸盐与Dex-GMA-Fc在25 C，pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液下，得到葡聚糖-甲基丙烯酸缩水甘油酯-半胱胺二茂铁（Dex-NH2-Fc），通过核磁共振氢谱可以证明已经成功制备了该产物。图 5.8是Dex-NH2-Fc的1H NMR谱图：d 3.2 ppm到d 3.7 ppm之间的峰属于葡聚糖环和半胱胺上的质子，d 3.5 ppm 属于水的

47、质子峰，d 2.5 ppm归属于溶剂DMSO上的质子峰，d 4.2 ppm到d 4.7 ppm分别属于甲酸二茂铁五元环上的质子峰，对比Dex-GMA-Fc的核磁图5.6，d 1.9 ppm的甲基峰，d 6.0 ppm和d 5.7 ppm左右的双键峰已经消失，由此可以说明葡聚糖链上已经接上了半胱胺。图5.8 葡聚糖-甲基丙烯酸缩水甘油酯-半胱胺-二茂铁的1H NMR谱图Figure 5.8 1H NMR spectrum of Dex-NH2-Fc.5.4 两亲性聚合物胶束相关测试5.4.1 胶束粒径及粒径分布的测定通过DLS分别测试Dex-GMA-Fc和Dex-NH2-Fc在水中形成的胶束的粒

48、径以及粒径分布。Dex-GMA-Fc和Dex-NH2-Fc均为两亲性分子，在水溶液中会发生自组装形成纳米颗粒。疏水段聚集成核，亲水段则伸展在核周围，可以达到稳定的目的。如图5.9 (A) 和 (B) 分别是Dex-GMA-Fc和Dex-NH2-Fc的动态光散射（DLS）的粒径分布图。由图可知这两种产物均可形成良好的胶束，具有潜在药物载体的可能性。(A)(B)图5.9 Dex-GMA-Fc和Dex-NH2-Fc组装胶束的粒径分布图Figure 5.9 Intensity distribution of micelles self-assembled from (A) Dex-GMA-Fc and

49、 (B) Dex-NH2-Fc.5.4.2 Dex-GMA-Fc和Dex-NH2-Fc的细胞相容性测试细胞相容性是决定药物能否用于生物的一个非常重要的指标，我们初步对Dex-GMA-Fc 和Dex-NH2-Fc进行细胞相容性测试。采用MTT法测试产物对小鼠成纤维细胞 (L929) 和人宫颈癌细胞 (HeLa) 的毒性，将两种产物配成胶束，与L929和HeLa共同培养48 h。计算细胞存活率，结果如图5.10所示。可以看到Dex-GMA-Fc 和Dex-NH2-Fc的细胞存活率有80% 左右及以上，说明两者均有良好的生物相容性。(A)(B)图5.10 L929细胞和HeLa细胞在不同浓度(A)

50、Dex-GMA-Fc和(B) Dex-NH2-Fc胶束下的成活率Figure 5.10 Cell viability of L929 cells and HeLa cells at different concentrations of (A) Dex-GMA-Fc and (B) Dex-GMA-CSH-Fc micelles.第六章 小结本论文利用具有良好生物相容性与生物可降解性的葡聚糖作为药物载体，与具有辐射增敏作用的甲酸二茂铁和可引入不饱和双键的甲基丙烯酸缩水甘油酯反应，并将合成的可修饰产物与半胱胺盐酸盐反应。通过合成实验和一系列对产物的测试与表征，可以得到以下的小结： 1. 葡聚糖与

51、二茂铁甲酸可以发生酯化反应，Dex-Fc的核磁谱图中出现相应的峰，紫外谱图中相对于纯甲酸二茂铁的峰位置发生偏移证明了Dex-Fc 的成功合成。通过改变溶剂的量得到高转化率，并且在扩大实验中也有高产率和可观的转化率，可以用来批量生产。2. Dex-Fc剩余的羟基可以继续与甲基丙烯酸缩水甘油酯反应，在核磁谱图中均可找到相应峰的归属可以改变证明了Dex-GMA-Fc已成功合成。并且发现Dex-GMA- Fc具有良好的水溶性，应该会有较好生物应用性。3. 甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的葡聚糖-二茂铁分子可以通过快速简单的反应与半胱胺盐酸盐发生硫醇与烯烃的点击反应。通过反应后产物双键核磁峰的消失以及找到相应

52、峰的归属可以证明已经发生反应。4. 将Dex-GMA-Fc 和Dex-NH2-Fc制成胶束，并通过动态激光光散射（DLS）测定胶束的粒径。并利用MTT法表征了两种产物的细胞相容性，结果表明它们均具有较低的细胞毒性。参考文献1 R Krishna, LD Mayer. Multidrug resistance (MDR) in cancer: Mechanisms, reversal using modulators of MDR and the role of MDR modulators in influencing the pharmacokinetics of anticancer dr

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