荧光显微技术在细胞生物学中的应用

1、图21 BNPTU的合成过程以及与汞离子反应以后结构的变化。23汞离子荧光探针BNPTU (3)用氮烯丙基取代原来的氮丁基，使得BNPTU比原来的荧光探针具有更好的溶解度。BNPTU在乙腈中的溶解度是9x10-4 M，在水和乙腈的混合溶液(vv=l9)中的溶解度是510-5M，而原来化合物的溶解度只有现在的10。同时，BNPTU在水中的溶解速度也大大的得到了提高，使得它更适用于生物环境中的应用。 (4)灵敏度比其他同类探针有大大提高，可以探测到ppb的水平。 (5)具有很高的离子选择性。 (6)具有很小的生物毒性。 在本文中，为了书写方便，将BNPTU定义为l，当它与汞离子发生反应后，其结构我

2、们把它定义为2。我们将在下面章节中详细讨论l和2的一些特性以及他们在生物细胞内的应用。 通过激光扫描共焦显微镜，我们首先观察吞噬了1和Hg2+的细胞的荧光图像。因为1和2的荧光光谱峰值分别在550 nm和495nm附近，所以我们选用505550nm的滤色片来滤去激发光和680nm左右的叶绿素的荧光。通过光谱分析(见图33)可知，细胞内的荧光分布主要是2产生的(可能含有少量未反应的1)，2在细胞内的三维分布如图32(A)所示，其中主图展示的是细胞内X-Y平面的荧光分布，主图右侧和下面显示的则是X-Z与Y-Z的剖面图。我们可以看到2在细胞中的分布是比较均匀的。同时我们测量了细胞的DIC (diff

3、erential interference contrast)图像，来观察其形态图32(C)则是(A)和(B)的合并。通过观察荧光像可以确实证明细胞吞噬了探针和Hg2+。我们同时观察了用来做对比的只吞噬了1的细胞，得到了相似的荧光像。图32(A)细胞内2的荧光图像。主要的那副图像展示的是细胞内XY平面的分布，右侧和下面的则是XZ与Y的剖面 (B)DIC图像 (c)图像A和B的合并33单光子激发和双光子激发的比较。 研究可知，l和2的双光子吸收截面分别为41士04和134士18，而riboflavin和FAD的双光子吸收截面分别为123和0035，探针的双光子吸收截面远大于细胞内主要荧光物质黄素

4、的双光子吸收截面。因此，使用双光子激发，必定可以得到更好的信噪比，从而来提高探测的灵敏度。为此我们将探针的单光子、双光子光谱和细胞自体荧光的光谱进行了对比，我们通过前面得到的细胞荧光像。选择某一微区测量得到的荧光光谱如图33所示。其中。曲线1表示未经汞离子孵化的细胞中的1的光谱，曲线2表示用汞离子孵化后的细胞中的2的光谱，曲线3为细胞的自体荧光光谱。图33细胞中探针的单光子激发(A)和双光子激发(B)的荧光光谱。其中曲线1表示1(110-7M)孵化的细胞中的探针荧光光谱，曲线2表示用1(110-7M)和Hg2+(210-6M)孵化的细胞中的探针荧光光谱，曲线3是细胞的自体荧光光谱。 我们可以从

5、图33(A)中看到，1和2发出的荧光只比其自体荧光大5倍左右。也就是说，如果我们继续降低1或者在细胞内的浓度，那么它所发出的荧光就会被生物体的自体荧光所干扰，这就是单光子激发所带来的局限性。反观双光子荧光(图33(B)，对于只吞噬了l(1x10-7 M)的细胞，其荧光光谱的峰值在538士3 nm；而同时吞噬了1(1x10-7M)和Hg2+(2x10-6M)的细胞，其荧光光谱的峰值在503士2 nm。两者的荧光会有大约35m的蓝移，与单光子激发类似。但是，从图中可以很清晰的看到，双光子激发的探针荧光比自体荧光大15倍左右。也就是说,如果用双光子激发可以大大提高信噪比，对探测生物体中的汞是非常有利

6、的。 因此可见，如果探针具有较大的双光子吸收截面，那么它将会在复杂的生物环境中有着更广阔的应用。 34结论 我们首次成功地将一种新的汞离子探针BNPTU，运用于对活体细胞中微量汞离子的检测。在检测汞离子的时候，BNPTU显示的是光谱变化，这可以在很大程度上避免由于复杂的生物环境带来的浓度分布不均匀所产生的测量上的影响。同时它具有很高的双光子吸收截面，双光子激发对于生物探测有很多优越性，能够屏蔽很多其他物质的干扰，具有较大的穿透深度和较小的细胞伤害等。这个探针还有很好的溶解度和溶解速度。使得其更适用于生物环境中的应用。 因为我们需要培育细胞进行汞离子的吞噬。所以取适量裸藻细胞悬浮培养液，在室温下

7、离心3 min(2000 rmin)，洗涤3次去除培养物质。令纯净的细胞沉降物与适量去离子水混合，然后再注入事先设计好浓(CH3CO2)Hg溶液。将样品放在先前的培养环境下,让细胞吞噬汞离子24小时。另外取一批干净的细胞同时培养，以作对比。 将裸藻细胞和含有(CH3CO2)Hg的悬浮液，在室温下离心3 min(2000 rmin)，用PBS洗涤3次来去除溶液中的杂质和残余的汞离子。然后再将洗好的吞噬了汞离子的细胞和作对比的细胞分别放在预先设计好浓度的BNPTU的溶液中在室温下培育05小时。最终离心3 min(2000 rmin)，用PBS洗涤3次来去除溶液中BNPTU。这样，细胞就可以用来做荧光成像和光谱分析的测试了。 我们的最终目标就是利用荧光探针来探测生物细胞中的微量汞离子。因此探针的低毒性显得尤为重要。通过显微镜观察，吞噬了BNPTU的裸藻细胞三天后仍然没有显示出任何形态