三酶促反应动力学

1、第三节 酶促反应动力学内容一、引言二、反应级数和速度常数三、单底物酶促反应动力学四、多底物酶促反应动力学五、酶催化反应的抑制动力学六、影响酶催化反应的因素一、引言n酶催化动力学主要是研究各种因素对酶促反应速度的影响、酶促反应的规律及反应历程。n影响酶促反应速度的因素包括S、E、P、I、A、pH和温度等。 n阐明反应机理n计算反应时间、最佳反应浓度，设计合理反应器二、反应级数和速度常数n反应级数反应级数V=AmBn m+n2. 零级反应: 反应速度与底物的浓度无关。当S大大高于E时，可认为是零级反应。 0ktdPdtdSdVtdkSdPd0ttSStdkSd000tkSSt00tkP03. 一级

2、反应 n反应速度与底物浓度成正比（单底物反应）,当E S时为一级反应。 1SktdSdVtdkSSd1ttSStdkSSd010tkSSt10lnlntkSSt303. 2lg104. 二级反应 n反应速度与两个反应物的浓度成正比n两个相同的反应物反应生成产物（2S P）n两个不同的反应物反应生成产物（AB P）。2S P 222SkSSktdSdVtdkSSd220211StkStAB P nA = B，与第一种情况的推导和结果相同。nA B，反应速度只与B成正比，其动力学方程式与一级反应的相同。n这种反应表面看起来是一级反应，但实际上是二级反应，故称为假一级反应。2BAktdBdtdAdV

3、三、单底物酶促反应动力学n反应初速度的测定n中间产物学说n米氏方程n米氏方程的讨论1.反应初速度的测定n随着酶反应的进行，酶反应速度会逐渐变小。n为了排除底物和产物浓度变化对酶反应速度的影响，采用酶反应的初速度作为衡量的指标。n从理论上来说，作出反应时间对反应物变化量的曲线，从近0处作曲线的切线，则切线的斜率代表初速度。但实际上切线无法作准确。实际使用的初速度测定方法1.1.高底物浓度测定法, 零级反应近似法。必须在无高底物浓度抑制时才适用。1.2.低底物浓度测定法, 一级反应近似法。在不同S时测定V，以V对S作图，直线部分的斜率为 。在直线部分，S乘以 得V。 mmKVmmKV1.3.使用不

4、同酶量的测定法 n在直线范围的酶量和反应时间对应的反应速度可看作初速度。2.1 问题引出问题引出 1903年Herry研究反应 蔗糖 葡萄糖+果糖 时发现如下现象：以酸为催化剂 以蔗糖酶为催化剂 vvss2. 中间产物学说中间产物学说2.2 中间产物学说中间产物学说 ESP 12-1kkkESESEP 1913年Michaelis和MentenVmax SKs + Sv =3. 米氏方程米氏方程 Michaelis-Menten equation3.1 推导推导 假设假设：a；反应过程中酶浓度恒定，Eo=ES+E;b 底物浓度远大于E浓度，所以S-ESS；c在反应初速度条件下，产物P浓度低，不

5、考虑第二步反应 的逆反应。 PEESkp 快速平衡法快速平衡法(k2Km，直线基本上是水平的, -1/Km则难以测得。S在3.320 Km的范围的实验结果而作出的双倒数图。SKm，则直线与两轴的交点都接近原点，使-1/Km 和1/Vmax ，都难以测准。S在0.033 0.2Km的范围的实验结果而作出的双倒数图。n点分布不均匀，集中于1/v轴，不过，此缺点可通过适当选择 S克服。n误差放大。在低S时，v很小，本身容易产生误差；而化成1/v与1/S后，误差显著放大。V1S1Km1Vmax12、其它线性作图法、其它线性作图法1).Hanes-Woolf作图法n优点：点分布均匀；n缺点：由取1/v，

6、使误差放大，但比较一致 2).Woolf-Augustinsson-Hofstee作图法作图法3).Eadie-Scatchard作图法作图法无误差放大，可信度高3.3米氏方程的积分形式n一般：n零级：n一级：应用：n建立tX关系n求Km、Vm011ln1KmtS XVmXVm1ln1KmtVmX0S XtVm4. 米氏方程的讨论米氏方程的讨论 4.1 米氏常数的意义米氏常数的意义 a.当时 ，Km=S Km是酶催化反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。b. 不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。测定酶的Km值可以作为鉴别酶的一种手段。c.同一种酶有几种底物就有几个Km值

7、。d.Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。max21V4.2反应规律反应规律 a. 当当SKm时时， Vmax，零级反应零级反应，反应速度与底物浓度无关，表明酶的活性中心已全部被底物占据；b. 当当SKm时时， ，一级反一级反应应，反应速度与底物浓度成正比；c. 当当S处于两者之间处于两者之间，为混合级反应为混合级反应。maxSKmSVmaxSKmSVmaxSKmV4.3 米氏方程的实际用途米氏方程的实际用途 n计算V达到Vm的百分率，要达到一定的 ，需要的Sn确定一定X时的反应时间n寻找天然底物 n判断在细胞内酶

8、是否受S的调控 mVVn判断在细胞中酶催化反应的主要方向 n寻找限速步骤 米氏方程的应用范围n单底物单结合位点酶催化反应n酶具有多个结合位点，且相互之间不发生相互作用n多底物反应中，只有一种底物浓度发生变化，其它底物浓度保持不变适用范围n多中间步骤的催化反应E+S ES1 ES2 E+Pn较复杂反应历程的催化反应n稳态前动力学n存在逆反应的酶催化反应n高底物浓度抑制与活化n高酶浓度四多底物酶促反应稳态动力学四多底物酶促反应稳态动力学n按底物数分类的酶促反应底物数酶分类催化反应酶种类占总酶%说明1.单底物异构酶AB5%真正单底物2.单向单底物 裂合酶AB+C12%逆向反应是双底物反应3.假单底物

9、水解酶A-B+H2OA-OH+BH26% H2O可视为常数4.双底物氧化还原酶基团转移酶AH2+BA+BH2A2+B3+A3+B2+A+BXAX+B27%24%5.三底物连接酶A+B+ATPAB+ADP+PiA+B+ATPAB+AMP+PPi5%1.Cleland 命名和表示法命名和表示法n1963年建立的多底物、多产物酶促反应动力学统一命名方法和表示反应历程的原则。2. 双底物酶促反应类型双底物酶促反应类型 通常情况下，酶催化反应涉及两个(少数情况下三个)底物。 AB PQ E反应过程是否形成三元复合物连续机制乒乓机制2. 双底物酶促反应类型双底物酶促反应类型2.1 连续机制：反应过程中形成

10、三元配合物，分为n序列有序机制n依赖NAD或NADP的脱氢酶的反应就属于这种类型。n序列随机机制：某些激酶例如肌酸激酶等就服从随机反应机理。A B P Q E EA EQ EB (EAB-EPQ) EP E B A Q P2.2 乒乓机制：不形成三元配合物转氨酶、某些黄素酶在内的许多酶都具乒乓反应机制 AP B Q E (EAEP) F (EBEQ)E3. 双底物反应的动力学n双底物连续反应动力学n按快速平衡法，如果k4、k5 1时，Km升高；当1 ，直线的交点位于第二象限；当0 Km 时，酶浓度与反应速度成正比关系。两个保证条件：必须是初速度必须用高底物浓度，S100Km。4、温度对酶反应速

11、度的影响n酶反应的最适温度:反应速度达到最大值时的温度。动物酶：3750；植物酶：4560 ；微生物酶差别较大。最适温度不是酶的特征常数，当温度升高时，除了V提高外，酶失活的速度也加快。所以短时间测定时，最适温度较高，长时间测定时，最适温度较低。 n温度对酶的影响：提高温度可以增加反应速度提高温度会使酶蛋白逐步变性而失活n酶的热稳定性大多数蛋白质在5070出现可逆变性（但也与处理时间有关），7080出现不可逆变性。5、PH 对酶反应速度的影响对酶反应速度的影响n酶反应的最适pH：酶表现最大反应速度的某一pH范围。最适最适pH的解释的解释 n在最适pH时，酶分子中各基团的解离状态处于使构象正常及

12、活性中心处于结合底物和催化反应的最佳状态。n当pH偏离最适pH时，活性中心基团的解离状态发生变化，使酶与底物的结合能力（亲和力）下降，催化能力也下降，致使酶活性下降。n底物的解离状态也受pH的影响，从而影响到底物与酶的结合及被催化反应。酶的酸碱稳定性n酶反应的最适pH也是使酶最稳定的pHn偏离的pH会使酶分子的构象发生变化。n若pH偏离不多，或处理时间较短，回复到最稳定pH后，酶活性可得到恢复。若pH偏离较多或处理的时间较长，则酶发生不可逆失活。酶的最适pH与稳定pHn最适pH为6.8。n将酶在不同pH条件下预保温，然后在pH6.8下测酶反应速度，得到稳定pH为58。酶的最适pH和等电点 酶底

13、物等电点最适反应pH淀粉酶（猪胰）淀粉5.25.66.9淀粉酶（麦芽）淀粉6.05.2蔗糖酶蔗糖5.04.5乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱5.08.4核糖核酸酶（牛胰）核糖核酸7.87.8胃蛋白酶各种蛋白质3.81.52.5胰蛋白酶各种蛋白质7.87.5胰凝乳蛋白酶各种蛋白质8.18.689木瓜蛋白酶各种蛋白质9.05.05.5菠萝蛋白酶各种蛋白质9.510.06.06.5脲酶尿素5.05.16.47.6脱羧酶（酵母）丙酮酸5.16.0过氧化氢酶H2O25.65.7酶的最适pH和等电点n与等电点相比，最适pH偏酸的说明要在带正电荷的情况下工作，最适pH偏碱的说明要在带负电荷的情况下工作。 6、 激活剂对酶反应的影响 凡是能提高酶活性