纸层析法分别氨基酸

1、纸层析法分离氨基酸姓名：敖礼贤学号： 5602212013班级：生物工程121一、前言1、研究意义与前景层析法 是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等） ，使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。【1】纸层析法 （ paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作

2、为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。【 2】分配层析法 分配色谱系色谱法之一种，利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。分配色谱过程本质上是组分分子在固定相和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。 【 3】2、实验目的（ 1）掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术（包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量）（ 2）学习未知样品的氨基酸成分（水解、层析及鉴定）分析的方法。3、实验原理层析法也称色谱法，是1906 年俄国植物学家Michae

3、l Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法 ”（ Chromatography)。 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。1944 年出现纸层析。以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等） ，使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。按层析过程的机理分类：吸附层析：利用吸

4、附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同纸层析 法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相（固定相） ，有机溶剂称为流动相。展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相，另一

5、相是以有机溶剂饱和了的水相。分配系数 ( )溶质在固定相的浓度(CS)/ 溶质在流动相的浓度(CL)当用滤纸进行分配层析时,流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。分配层析的原理可用一个模式解释（英国Martin 等）：把滤纸看成是一个层析柱，可以分成若干层板，设层板的物质为A、 B；且 A 和 B 的分配系数（）分别为 1 和 1/3 ；又设固定相为 S，流动相为 L，两相互相接触但不相混溶。当第一层流动相中加入一定量的A、 B 两项物质后，溶质根据各自的分配系数在第一层的两相中分配，流动相继续在流动，此时第一层固定相与新流到的流动相之间以及原来第一层流

6、动相与第二层固定相之间进行第二次分配，以此类推三次分配即可看出A 与 B 最浓部分以分开， A 在第二层最浓， B 在第三层最浓，如果继续抽提下去，经过若干此后，A、两物质便可完全分开。显然，分配系数越大的,则越易分开。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf 值（比移值）来表示的：Rf=原点到层析点中心的距离/ 原点到溶剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的 Rf 值是常数。 Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。无色物质的层析图谱可用光谱法或显色法鉴定。本实验采用茚三酮为显色剂。茚三酮显色反应受温度、ph、时间影响较大。

7、如果要使结果重复，必须严格控制上述条件。二、实验材料与方法Rf 值。1、实验试剂1. 氨基酸标准液（ 1mg/ml ）四种氨基酸是甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、混合氨酸分别配置成一定浓度的溶液2. 80%甲酸3. 0.5%茚三酮溶液4. 氨基酸混合液5. 正丁醇2、实验器材1. 新华滤纸2. 培养皿3. 电热鼓风干燥箱4. 点样管及点样架5. 针、线、尺6. 烧杯7. 钟罩3、实验操作（一）标准氨基酸纸上层析1、单向上行层析（ 1）氨基酸Rf 值的测定A、 滤纸：选用国产新华 1 号滤纸， 28cmX28cm ，在距纸边 2cm 处，用铅笔轻轻划一条线，于线上每隔 3cm 处画一小圆圈作为点样处，圈

8、直径不超过 0.5cm。B、 点样：点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清，氨基酸的点样量以每种氨基酸含 520ug 为宜，将准备好的滤纸悬挂在点样架上，滤纸垂直桌面，用点样管吸取氨基酸样品 10ug，在滤纸垂直方向轻轻碰触点样中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.5cm 之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。C、 将点好的样品的滤纸俩侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处的纸的俩边不要接触，避免由于毛细管现象使溶剂沿俩边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响D、 酸溶剂系统：正丁醇：80%甲酸：水 =15:3:2 ，茚三酮2ml，温度 25*C，时间 1h

9、。注意：使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。展层溶剂每张约需25ml 。E、 显色：待展层基本结束后，置65.C 鼓风箱中10 20min, 鼓风保温，滤纸上即显出紫红色 黄色斑点。F、 Rf 值的计算：用尺测量显色斑点的中点与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出此值，即得氨基酸的Rf 值，计算出4 种氨基酸在酸系统中的Rf 值。三、实验数据与分析甘氨酸亮氨酸脯氨酸混合氨酸原点到层析点中点的距离（ mm ）原点到溶剂前沿的距离（mm ）146036707070Rf0.2000.8570.514四、讨论1、注意事项 .点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面(即展层时样品可能达到的部分)。

10、.点样斑点不能太大，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且点样后吹风温度不宜过高，以免样品变性 (斑点发黄 )。 .展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。 .展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果。2、思考题( 1）、纸层析法分离氨基酸为什么在展层时使用一种溶剂系统,有时使用俩种溶剂系统？这是根据 Nernst 在 1891 年提出的分配定律：一种溶质在两种给定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数，即分配系数 (Kd)。Kd=Ca/CbCa 和 Cb 是互不相溶的两相，即A 相和 B 相的浓度。这里的两相可以使固相、液相和气相。意思就是溶质在A 和 B 两种溶剂组成的混合溶剂里分配时，分配比是恒定的。(2)、酸性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离有何影响？酸性溶液中，有利于氨基酸