第三章核酸的分离与检测

1、chapter 3 separate and investigate target gene by nieguangjun e-mail:l从哪儿提取（从哪儿提取（where）？）？l怎么提取（怎么提取（how）？）？l提到什么程度（提到什么程度（what）？）？l会出现什么问题（会出现什么问题（questions）？）？如何解决（如何解决（solution）？）？主要内容主要内容核酸提取的原则和基本要求核酸提取的原则和基本要求principle and steps l principle principle 1.1.保持核酸的完整性；保持核酸的完整性；2.2.提高核酸的质量（纯度和浓度）。提

2、高核酸的质量（纯度和浓度）。l requirements for purificationrequirements for purification1.1.不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；属离子；2.2.其他事物大分子（其他事物大分子（prpr、sugar and lipidsugar and lipid）3.3.其他核酸污染其他核酸污染核酸提取的一般过程核酸提取的一般过程principle and steps l steps steps1.1.样品准备（取材）样品准备（取材）2.2.破细胞（物理法、化学法、破细胞（物理法、化学法

3、、酶法）；酶法）；3.3.除杂质（蛋白质、脂类、糖除杂质（蛋白质、脂类、糖类和不需要的核酸）；类和不需要的核酸）；4.4.沉淀提纯沉淀提纯i. i.材料准备材料准备ii.ii.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放iii.iii.核酸分离、纯化核酸分离、纯化iv.iv.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质 v.v.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中破碎细胞破碎细胞- -方法方法1.1. 机械方法机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；：超声波处理法、研磨法、匀浆法；2.2. 化学试剂法化学试剂法：用：用sdssds或或ctabctab处理细胞；处理细

4、胞； 3.3. 酶解法酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。破碎。 破碎细胞破碎细胞- -来源来源1.1. 动物：动物：小牛胸腺小牛胸腺?动物肝脏、血液和肌肉组织等动物肝脏、血液和肌肉组织等?鱼类精子；鱼类精子；2.2. 植物：植物：种子的胚中都含有丰富的种子的胚中都含有丰富的dnadna。3.3. 微生物：微生物：谷氨酸菌体含谷氨酸菌体含7%10%7%10%，面包酵母含，面包酵母含4%4%，啤酒酵母含啤酒酵母含6%6%，大肠肝菌含，大肠肝菌含9%10%9%10%（培养过夜）。（培养过夜）。 notenote： 从各种材料中提取从各种材料中提取dnad

5、na方法不同，分离提取的难易程度也不同。方法不同，分离提取的难易程度也不同。 对于低等生物。如从病毒中提取对于低等生物。如从病毒中提取dna dna 比较容易，多数病毒比较容易，多数病毒dna dna 分子量较小，分子量较小，提取时易保持其结构完整性。提取时易保持其结构完整性。 从高等动植物中提取从高等动植物中提取dnadna难度大一些。因分子量较大，易被机械张力剪断。难度大一些。因分子量较大，易被机械张力剪断。破碎细胞破碎细胞（来源（来源- -方法）方法）微生物：微生物：溶菌酶、溶菌酶、sdssds裂解。裂解。高等植物：高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如

6、胰蛋白酶，酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。动物动物：液氮处理后用匀浆器破碎。：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器细胞器dnadna：首先纯化细胞器。首先纯化细胞器。 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂抽提核酸除去杂质抽提核酸除去杂质 1 1首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离蛋白与其它成分分离2 2使核酸与蛋白质分离使核酸与蛋白质分离3 3除去脂类除去脂类 4 4多糖的除去多糖的除去how to remove ？核酸的纯化核酸的纯化根据所需

7、核酸的性质和特点除去其它核酸污根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染染, ,并除去提取过程中的系列试剂并除去提取过程中的系列试剂( (盐、有机溶剂盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。等）杂质，最后得到均一的核酸样品。 how to do？核酸样品的保存核酸样品的保存核酸保存的主要条件是核酸保存的主要条件是温度温度和和介质介质温度：温度： 44（55）最佳和最简单）最佳和最简单 -70-70是长期保存的良好温度，为一次性保存是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20-20保存保存保存介质：保存介质： tete缓冲溶液缓冲溶液( (最常用最常用) ) 10mmol/l tris-hcl

8、 ph8.0 10mmol/l tris-hcl ph8.0 1mmol/l edta ph8.0 1mmol/l edta ph8.0关键试剂的作用关键试剂的作用关键试剂的作用关键试剂的作用l核酸酶的抑制和抑制剂核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变降低温度，改变phph及盐的浓度，都利于及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于对于dnadna，抑制，抑制dnasednase活力很容易，但防活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。止机械张力拉断则更重要。 对于

9、对于rnarna，因分子较小，不易被机械张力，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制拉断，但抑制rnasernase活力较难，故在活力较难，故在rnarna提取提取中设法抑制中设法抑制rnasernase更重要。更重要。关键试剂的作用关键试剂的作用l核酸酶的抑制和抑制剂核酸酶的抑制和抑制剂 rnasernase抑制抑制 操作要带手套。操作要带手套。 所有器皿要严格消毒，所有器皿要严格消毒， 试剂处理试剂处理 低温操作低温操作 在分离过程中要加入一定的在分离过程中要加入一定的rnasernase抑制剂。抑制剂。 关键试剂的作用关键试剂的作用l核酸制备中常用的去垢剂核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身

10、带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：去垢剂，去垢剂的作用： 1 1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2 2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；将核酸释放出来； 3 3对对rnasernase、dnasednase有一定的抑制作用。有一定的抑制作用。关键试剂的作用关键试剂的作用l核酸制备中常用的蛋白质变性剂核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白质变性剂的作用：蛋白质变性剂的作用： 1. 1.使

11、蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。去，以防造成蛋白污染。 2.2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.3.某些蛋白质变性剂也有抑制某些蛋白质变性剂也有抑制rnasernase活性和破裂活性和破裂细胞的作用。细胞的作用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍、如：苯酚、氯仿、盐酸胍、depcdepc关键试剂的作用关键试剂的作用l核酸制备中常用的酶核酸制备中常用的酶 dnasednase rnase rnase 蛋白酶蛋白酶k k 溶菌酶溶菌酶 核酸的部分特征核酸的部分特征核酸的部分特征核酸的部

12、分特征1.1.存在形式存在形式2.2.phph值影响值影响3.3.盐影响盐影响4.4.温度影响温度影响1. 1.存在形式存在形式l rna rna和核苷酸的纯品都呈和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶白色粉末或结晶，dnadna则为则为白色类似石棉样白色类似石棉样的纤维状物。的纤维状物。l dnadna、rnarna和核苷酸都是和核苷酸都是极性化合物极性化合物，一般都溶于水，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，易溶于水，rnarna钠盐在水中溶解度可达钠盐在水中溶解度可达40g/l40g/l。l 天然状态的天然状态的d

13、na dna 是以脱氧核糖核蛋白是以脱氧核糖核蛋白(dnp)(dnp)形式存形式存在于细胞核中。要从细胞中提取在于细胞核中。要从细胞中提取dna dna 时，先把时，先把dnpdnp抽抽提出来，再把提出来，再把p p除去，再除去细胞中的糖，除去，再除去细胞中的糖，rna rna 及无及无机离子等，从中分离机离子等，从中分离dna dna 。 removal of pr removal of pr2.ph2.ph值的影响值的影响 dnadna在水中为在水中为10g/l10g/l，呈黏性胶体溶液。在酸性，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，溶液中，dnadna、rnarna易水解，在中性或弱碱性溶易水解

14、，在中性或弱碱性溶液中较稳定。液中较稳定。 在在phph值高达值高达12.612.6的碱性条件下，双螺旋结构解的碱性条件下，双螺旋结构解开而变性。质粒开而变性。质粒dnadna两条互补链不会完全分离，两条互补链不会完全分离，当以当以ph 4.8ph 4.8的的naacnaac高盐缓冲液去调节其高盐缓冲液去调节其phph值至值至中性时，变性的质粒中性时，变性的质粒dnadna完全复性，而染色体完全复性，而染色体dnadna不能复性而形成缠连的网状结构不能复性而形成缠连的网状结构碱变性法（碱变性法（for plasmid dnafor plasmid dna）3. 3.盐影响盐影响ldnpdnp在

15、在低浓度盐溶液低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在中，几乎不溶解，如在0.14 0.14 mol/lmol/l的氯化钠溶解度最低的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度，仅为在水中溶解度的的1%1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/l1mol/l氯化钠中的溶解度很大，比纯水高氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2 2倍。倍。lrnprnp在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在在0.14mol/l0.14mol/l氯化钠中溶解度较大氯化钠中溶解度较大。因此，在提。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。盐溶液中取时，常用此法

16、分离这两种核蛋白。盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。的溶解度受盐浓度的影响而不同。浓盐法浓盐法4. 4.温度影响温度影响l高温变性高温变性l低温复性低温复性沸水浴法（沸水浴法（for plasmid dnafor plasmid dna）核酸的常用提取方法核酸的常用提取方法常用的常用的dnadna提取方法提取方法l浓盐法浓盐法l阴离子去污剂法阴离子去污剂法l苯酚抽提法苯酚抽提法l水抽提法水抽提法l沸水浴法沸水浴法l碱变性法碱变性法1. 1. 浓盐法浓盐法原理：原理： 利用利用rnprnp和和dnpdnp在电解溶液中溶解度不同，在电解溶液中溶解度不同，将二者分离；将二者分离；常用的方法：常用

17、的方法：用用1m 1m 氯化钠氯化钠提取氯化钠抽提提取氯化钠抽提, ,得到的得到的dnpdnp粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡, ,使乳化使乳化, ,再再离心除去蛋白质离心除去蛋白质, ,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间相中间，而，而dnadna位于上层水相中位于上层水相中, ,用用2 2倍体积倍体积95%95%乙醇乙醇可将可将dna dna 钠盐沉淀出来（钠盐沉淀出来（ 也可用也可用0.15 mnacl0.15 mnacl液反复液反复洗涤细胞破碎液除去洗涤细胞破碎液除去rnp,rnp,再以再以1mnacl1mnacl提取脱氧核

18、糖提取脱氧核糖蛋白蛋白, ,再按氯仿再按氯仿-异醇法除去蛋白）。异醇法除去蛋白）。1. 1. 浓盐法浓盐法注意注意以稀盐酸溶液提取以稀盐酸溶液提取dna dna 时时, ,加入适量加入适量去污剂去污剂, ,如如sdssds可有助于蛋白质与可有助于蛋白质与dna dna 的分离。的分离。在提取过程中为抑制组织中的在提取过程中为抑制组织中的dnasednase对对dna dna 的降的降解作用解作用, ,在氯化钠溶液中加入在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠柠檬酸钠作为金属离作为金属离子的烙合剂子的烙合剂. .通常用通常用0.15mnacl,0.015m0.15mnacl,0.015m柠檬钠柠檬钠, ,并并

19、称称sscssc溶液溶液, ,提取提取dna. dna. 2. 2. 阴离子去污剂法阴离子去污剂法用用sdssds或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性性, ,可以直接从生物材料中提取可以直接从生物材料中提取dnadna。由于细由于细胞中胞中dnadna与蛋白质之间常借静电引力或配位键与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合结合, ,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键因为阴离子去污剂能够破坏这种价键, ,所以常用阴离子去污剂提取所以常用阴离子去污剂提取dna. dna. 3. 3. 苯酚抽提法苯酚抽提法苯酚作为蛋白变性剂苯酚作为蛋白变性剂, ,同时抑制了同时抑制了dnased

20、nase的降解作用。的降解作用。用苯酚处理匀浆液时用苯酚处理匀浆液时, ,由于蛋白与由于蛋白与dna dna 联结键已断联结键已断, ,蛋蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而蛋白分子溶于酚相，而dnadna溶于水相。离心分层后取溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含出水层，多次重复操作，再合并含dna dna 的水相。的水相。利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀dna dna 。此时。此时dnadna是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一

21、团，取出。此法的特点是使提取的出。此法的特点是使提取的dnadna保持天然状态。保持天然状态。 4. 4. 水抽提法水抽提法利用核酸溶解于水的性质利用核酸溶解于水的性质, ,将组织细胞破碎后将组织细胞破碎后, ,用用低盐溶液除去低盐溶液除去rnarna，然后将沉淀溶于水中，使，然后将沉淀溶于水中，使dnadna充分溶解于水中充分溶解于水中, ,离心后收集上清液；离心后收集上清液；在上清中加入在上清中加入固体氯化钠固体氯化钠调节至调节至2.6m2.6m。加入。加入2 2倍倍体积体积95%95%乙醇乙醇, ,立即用搅拌法搅出；立即用搅拌法搅出；然后分别用然后分别用66% 66% ?80%80%和和

22、95%95%乙醇以及丙酮洗涤；乙醇以及丙酮洗涤；最后在空气中干燥最后在空气中干燥, ,既得既得dnadna样品。样品。此法提取的此法提取的dnadna中蛋白质含量较高中蛋白质含量较高, ,故一般不用。故一般不用。5. 5. 沸水浴法（提取大肠沸水浴法（提取大肠杆菌质粒杆菌质粒dnadna）1. 1. 在在eppendorfeppendorf管中加入管中加入110 ml110 ml的的stetstet（使用前加（使用前加入溶菌酶至终浓度为入溶菌酶至终浓度为5 mg/ml5 mg/ml）（蔗糖）（蔗糖 8 8 ，triton x-100triton x-100 5 5，tris-hcl (ph8.

23、0)tris-hcl (ph8.0) 50 mm 50 mm， edta (ph8.0)edta (ph8.0) 50 mm 50 mm）溶液，挑入米粒大小的菌团，）溶液，挑入米粒大小的菌团，充分悬浮并混匀。充分悬浮并混匀。 2. 2. 上述菌体悬浮液上述菌体悬浮液沸水煮沸水煮3030秒秒。3. 3. 迅速放置于迅速放置于常温常温下下15000 rpm15000 rpm离心离心1515分钟。分钟。5. 5. 沸水浴法（提取大肠沸水浴法（提取大肠杆菌质粒杆菌质粒dnadna）4. 4. 用牙签挑去菌体碎片（白色沉淀），在上清液用牙签挑去菌体碎片（白色沉淀），在上清液中加入中加入100 ml100

24、 ml的的异丙醇异丙醇，充分混匀后，充分混匀后44，15000 15000 rpmrpm离心离心2020分钟。分钟。 5. 5. 弃上清液，加入弃上清液，加入70%70%冰乙醇冰乙醇400 ml400 ml，44，15000 rpm15000 rpm离心离心5 5分钟。分钟。 6. 6. 沉淀凉干后用沉淀凉干后用50 ml50 ml无菌重蒸水溶解。无菌重蒸水溶解。 7. 7. 取取5 ml5 ml电泳检测。电泳检测。 6. 6. 碱变性法碱变性法原理：原理：碱变性抽提质粒碱变性抽提质粒dnadna是基于染色体是基于染色体dnadna与质粒与质粒dnadna的变性与复性的差异而达到分离目的。的变

25、性与复性的差异而达到分离目的。在在高高phph值值条件下，染色体条件下，染色体dnadna的氢键断裂，双螺旋结构的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒解开而变性。质粒dnadna的大部分氢键也断裂，但超螺旋共的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离；价闭合环状的两条互补链不会完全分离；当当phph值调至至中性值调至至中性时，变性的质粒时，变性的质粒dnadna又恢复原来的构又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体型，保存在溶液中，而染色体dnadna不能复性而形成缠连的不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体网状结构，通过离心，染色体dnadna与不稳定的大分子与

26、不稳定的大分子rnarna、蛋白质蛋白质sdssds复合物等一起沉淀下来而被除去。复合物等一起沉淀下来而被除去。 核酸提取的经典案例核酸提取的经典案例主要案例主要案例u 碱变性法制备大肠杆菌质粒碱变性法制备大肠杆菌质粒dna dna u 大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体dnadna的抽提的抽提u ctabctab法提取植物基因组法提取植物基因组dna dna 6. 6. 碱变性法（制备大肠碱变性法（制备大肠杆菌质粒杆菌质粒dnadna） 1. 1.5 ml1. 1.5 ml培养物培养物6000 rpm6000 rpm，44离心离心1010分钟，弃去分钟，弃去上清液。上清液。2. 2. 加入加入10

27、0 ml100 ml溶液溶液i i悬浮菌体，室温放置悬浮菌体，室温放置5 5分钟。分钟。3. 3. 加入加入200 ml200 ml溶液溶液iiii，立即轻轻混匀，室温放置至，立即轻轻混匀，室温放置至溶液几乎澄清。溶液几乎澄清。4. 4. 加入加入150 ml150 ml溶液溶液iiiiii，轻轻混匀，冰浴，轻轻混匀，冰浴3030分钟。分钟。 5. 45. 4，15000 rpm15000 rpm离心离心2020分钟，收集上清液。分钟，收集上清液。 6. 6. 上清液中加入等体积的上清液中加入等体积的苯酚苯酚饱和溶液（饱和溶液（400 ml400 ml）氯仿氯仿，充分混匀，充分混匀，44，15

28、000 rpm15000 rpm离心离心2020分钟，将分钟，将上清液转移至另一离心管。上清液转移至另一离心管。6. 6. 碱变性法（制备大肠碱变性法（制备大肠杆菌质粒杆菌质粒dnadna） 7. 7. 在上清液中加入在上清液中加入400 ml400 ml氯仿氯仿溶液，混匀，溶液，混匀，10000 10000 rpmrpm离心离心1010分钟，将上清液转移至另一离心管。分钟，将上清液转移至另一离心管。 8. 8. 在上清液中加入在上清液中加入400 ml400 ml异丙醇异丙醇，2020放置放置3030分钟，分钟，44，15000 rpm15000 rpm离心离心2020分钟。分钟。 9. 9

29、. 用用400 ml 75%400 ml 75%的的冰乙醇冰乙醇洗涤一次，凉干。洗涤一次，凉干。 10. 10. 加入加入50 ml50 ml无菌重蒸水溶解质粒无菌重蒸水溶解质粒dnadna。 11. 11. 取取2 ml2 ml作酶切电泳检查。作酶切电泳检查。6. 6. 碱变性法碱变性法- -试剂试剂溶液溶液i i：d-glucosed-glucose 50 mmol/l 50 mmol/l，tris-hcltris-hcl（ph 8.0ph 8.0）50mmol/l50mmol/l ，edtaedta（ph 8.0ph 8.0） 10mmol/l10mmol/l 121121消毒消毒202

30、0分钟，使用时加入溶菌酶，终分钟，使用时加入溶菌酶，终浓为浓为 5mg/ml 5mg/ml 溶液溶液iiii ：sdssds 1%1% naoh naoh 0.2 mol/l0.2 mol/l 溶液溶液iiiiii：kackac（ph5.5ph5.5） 3 mol/l3 mol/l溶液溶液-溶菌液溶菌液1 1溶菌酶：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1-1，4 4糖苷键，糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中因而具有溶菌的作用。当溶液中phph小于小于8 8时，溶菌时，溶菌酶作用受到抑制。（保持碱性和较低的离

31、子强度酶作用受到抑制。（保持碱性和较低的离子强度环境）环境） 葡萄糖：葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止增加溶液的粘度，维持渗透压，防止dnadna受机械切力作用降解。受机械切力作用降解。溶液溶液-溶菌液溶菌液2.edta的作用的作用：（1） 螯合螯合mg2、ca2等金属离子，抑制脱氧核等金属离子，抑制脱氧核酸酶对酸酶对dna的降解作用（的降解作用（dnase作用时一定的金作用时一定的金属离子作辅基）。属离子作辅基）。 （2）edta的存在，有利于溶菌酶的作用，因为的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 溶液溶液-

32、naoh-sds液液 naoh：核酸在核酸在ph大于大于5，小于，小于9的溶液中，是稳的溶液中，是稳定的定的。但当。但当ph12或或ph3时，就会引起双链之间时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液氢键的解离而变性。在溶液中的中的naoh浓度为浓度为0.2mol/l,加抽提液时，该系统的加抽提液时，该系统的ph就高达就高达12.6,因因而促使染色体而促使染色体dna与质粒与质粒dna的变性的变性. 溶液溶液-naoh-sds液液 sds：sdssds是离子型表面活性剂。它主要功能有：是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1 1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋）溶解细胞膜上的脂质与蛋白

33、，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。白而破坏细胞膜。（2 2）解聚细胞中的核蛋白。）解聚细胞中的核蛋白。（3 3）sdssds能与蛋白质结合成为能与蛋白质结合成为r-o-so3r+-r-o-so3r+-蛋白蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是sdssds能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用（用rnasernase去除去除rnarna时）受到干扰。时）受到干扰。 溶液溶液-3mol/l naac(ph4.8)溶液溶液na

34、ac的水溶液呈碱性，为了调节的水溶液呈碱性，为了调节ph至至4.8,必必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是naac-hac的缓冲液。用的缓冲液。用ph4.8的的naac溶液溶液是是为为了将了将ph12.6的抽提液调回的抽提液调回ph至中性至中性,使变性的质使变性的质粒粒dna能够复性能够复性,并能稳定存在。而高盐的并能稳定存在。而高盐的3mol/l naac有利于变性的大分子染色体有利于变性的大分子染色体dna, rna,以及以及sds-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互

35、相聚合减少相斥力而互相聚合,后者是因为钠盐与后者是因为钠盐与sds-蛋白复合物作用后蛋白复合物作用后,能形能形成较小的钠盐形式复合物成较小的钠盐形式复合物,使沉淀更完全。使沉淀更完全。 大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体dnadna的抽提的抽提 大肠杆菌传一代后大肠杆菌传一代后30ml液体液体lb培养基以培养基以10%接种量接种量培养培养6小小时时，6000rpm，4，离心，离心10分钟收获菌体沉淀。分钟收获菌体沉淀。 沉淀中加入沉淀中加入3.6 ml buffer a（含溶菌酶（含溶菌酶5 mg/ml），旋涡振），旋涡振荡混匀，荡混匀，37保温保温30分钟。分钟。 加入加入400 ml 10% s

36、ds使最终浓度为使最终浓度为1%，混匀，混匀，37保温保温30分钟或澄清即可。分钟或澄清即可。 加入加入10 ml 20 mg/ml的的prok至最终浓度为至最终浓度为1 mg/ml，60保保温温60分钟。分钟。 加入加入1 ml预先冷冻的预先冷冻的5 mol/l nacl至最终浓度为至最终浓度为1 mol/l，充，充分混匀后冰浴分混匀后冰浴30分钟。分钟。 4，15 000 rpm，离心，离心30min。大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体dnadna的抽提的抽提 取上清加入等体积（取上清加入等体积（5 ml）的）的苯酚苯酚饱和溶液，充分混匀后饱和溶液，充分混匀后4，15000 rpm，离心，离心3

37、0分钟。分钟。 取上清加入等体积的取上清加入等体积的氯仿氯仿充分混匀后充分混匀后13000 rpm，4，离心，离心10分钟。分钟。 取上清加入取上清加入0.8 v（4 ml）异丙醇异丙醇充分混匀后充分混匀后 -20放置放置30分分钟以上，钟以上，4，15000 rpm，离心，离心30分钟。分钟。 弃上清，沉淀用弃上清，沉淀用3ml 70%的的冰乙醇冰乙醇洗涤，洗涤，4，15000 rpm，离心离心5分钟。分钟。 弃上清，沉淀于弃上清，沉淀于37凉干后，用凉干后，用1 ml ddh2o 溶解并移入溶解并移入eppendorf管中。管中。 取取5 ml电泳。电泳。ctab法提取植物法提取植物基因组

38、基因组dna ctab(十六烷基三乙基溴化铵十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（在高盐溶液中（0.7 mol/l nacl）是可溶的，当）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/l nacl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将时，从溶液中沉淀，通过离心就可将ctab-核核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀最后通过乙醇或异丙醇沉淀dna，而，而ctab溶于乙醇或异丙醇而除去。溶于乙醇或异丙醇而除去。实验

39、程序实验程序1.在在2ml离心管中，加入离心管中，加入500l的的2ctab和和20 l-巯基乙醇巯基乙醇, 65预热。预热。2嫩的组织材料嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddh2o冲洗冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到末到预热的离心管中，总体积达到1ml混匀后置混匀后置65水浴中保温水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。，并不时轻轻转动试管。注：注：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。而且粉末

40、冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移否则内源性应在化冻前转移否则内源性dnase有可能降解有可能降解基因组基因组dna。实验程序实验程序3加等体积的加等体积的氯仿氯仿/异戊醇异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温，轻轻地颠倒混匀，室温下下10 000rpm离心离心10 min，移上清至另一新管中。，移上清至另一新管中。4向管中加入向管中加入1/100体积的体积的rnase a溶液，置溶液，置3720-30min。5加入加入2倍体积的倍体积的100%乙醇乙醇或或0.7倍体积异丙醇，会倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，出现絮状沉淀，-20放置放置30 min或或-80放置放置10min，12

41、000rpm离心离心10-15min回收回收dna沉淀。沉淀。6 用用70%乙醇乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌菌ddh2o中。中。7 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测基因组基因组dna的完整性。的完整性。 核酸提取的注意事项核酸提取的注意事项注意事项注意事项 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融要反复冻融 提取血液基因组提取血液基因组dnadna时，要选择有核细胞时，要选择有核细胞（白细胞）（白细胞） 组培细胞培养时间不能过长，否则会造成组培细胞培养时间不能过长，否则会造成dnadna降解降解

42、 含病毒的液体材料含病毒的液体材料dnadna含量较少，提取前先含量较少，提取前先富集富集注意事项（细胞破碎）注意事项（细胞破碎） 材料应适量材料应适量，过多会影响裂解，导致，过多会影响裂解，导致dnadna量量少，纯度低少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶k k细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡注意事项（分离与纯化）注意事项（分离与纯化） 采用吸附材料吸附的

43、方式分离采用吸附材料吸附的方式分离dnadna时，应提时，应提供相应的缓冲体系供相应的缓冲体系 采用有机（酚采用有机（酚/ /氯仿）抽提时应充分混匀，但氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法应的去杂质的方法注意事项（沉淀、溶解）注意事项（沉淀、溶解） 当沉淀时间有限时，用当沉淀时间有限时，用预冷的预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分淀会更充分 沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的naac（ph

44、5.2，3m），有利于），有利于充分沉淀充分沉淀 沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干晾干dna，让乙醇充分挥发（不要过分干燥），让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用若长期储存建议使用te缓冲液溶解缓冲液溶解te中的中的edta能螯和能螯和mg2+或或mn2+离子，抑制离子，抑制dnaseph值为值为8.0，可防止，可防止dna发生酸解发生酸解 核酸提取的常见问题与对策核酸提取的常见问题与对策常见问题与对策常见问题与对策1. 1.dnadna中含有蛋白、中含有蛋白、多糖、多酚类杂质多糖、多酚类杂质2.2.dnadna在溶解前，有在溶解

45、前，有酒精残留，酒精抑酒精残留，酒精抑制后续酶解反应制后续酶解反应3.3.dnadna中残留有金属中残留有金属离子离子1. 1.重新纯化重新纯化dnadna，去，去除蛋白、多糖、多酚除蛋白、多糖、多酚等杂质等杂质2.2.重新沉淀重新沉淀dnadna，让，让酒精充分挥发酒精充分挥发3.3.增加增加7070乙醇洗涤乙醇洗涤的次数（的次数（2-32-3次）次）q问题一：问题一：dnadna样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和pcrpcr反应。反应。 原原因因对对策策问题与对策问题与对策1. 1.材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融2.2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶

46、的活性3.3.提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈，烈，dnadna被机械打断被机械打断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融1. 1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融免反复冻融2.2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液前加入裂解缓冲液3.3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料在提取内源核酸酶含量丰富的材料的的dnadna时，可增加裂解液中螯合剂时，可增加裂解液中螯合剂的含量的含量4.4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高所有试剂用

47、无菌水配制，耗材经高温灭菌温灭菌6.6.将将dnadna分装保存于缓冲液中，避免分装保存于缓冲液中，避免反复冻融反复冻融q问题二：问题二：dnadna降解降解对对策策 原原因因问题与对策问题与对策1. 1.实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗涤时洗涤时dnadna丢失丢失1. 1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材尽量选用新鲜（幼嫩）的材料料2.2.动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；g g菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁或机械方式破壁3.3.高温裂解时，时间适当延长高温裂解时，时间适当延

48、长（对于动物细胞、细菌可增（对于动物细胞、细菌可增加加pkpk的用量）的用量）4.4.低温沉淀，延长沉淀时间低温沉淀，延长沉淀时间5.5.加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀6.6.洗涤时，最好用枪头将洗涤洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒液吸出，勿倾倒q问题三：问题三：dnadna提取量少提取量少对对策策 原因原因核酸提取的相关说明核酸提取的相关说明为什么用无水乙醇沉淀为什么用无水乙醇沉淀dna?在用无水乙醇沉淀在用无水乙醇沉淀dna时，为什么加时，为什么加naac或或nacl?加核糖核酸酶降解核糖核酸后加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再用为什么再用sds与与kac来处理来处理?为什么

49、在保存或抽提为什么在保存或抽提dna过程中，一般采用过程中，一般采用te缓冲缓冲液？液？如何选择聚乙二醇如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀的浓度来沉淀dna?抽提抽提dna去除蛋白质时去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好怎样使用酚与氯仿较好?为什么用酚与氯仿抽提为什么用酚与氯仿抽提dna时时,还要加少量的异戌醇还要加少量的异戌醇?为什么要用为什么要用ph8的的tris水溶液饱和酚水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可呈粉红色的酚可否使用否使用?如何保存酚不被空气氧化如何保存酚不被空气氧化?为什么用无水乙为什么用无水乙醇沉淀醇沉淀dna?dna?乙醇的优点乙醇的优点：可以任意比和水相混溶：可以任意比和

50、水相混溶, ,乙醇与核乙醇与核酸不会起任何化学反应酸不会起任何化学反应, ,对对dnadna很安全很安全, ,因此是理因此是理想的沉淀剂。想的沉淀剂。原理：原理：dnadna溶液是溶液是dnadna以水合状态稳定存在以水合状态稳定存在, ,当加当加入乙醇时入乙醇时, ,乙醇会夺乙醇会夺dnadna周围的水分子周围的水分子, ,使使dnadna失水失水而易于聚合。而易于聚合。在用无水乙醇沉淀在用无水乙醇沉淀dna时，时，为什么要加为什么要加naac或或nacl在在ph为为8左右的左右的dna溶液中溶液中,dna分子是带分子是带负电荷的负电荷的,加一定浓度的加一定浓度的naac或或nacl,使使n

51、a+中中和和dna分子上的负电荷分子上的负电荷,减少减少dna分子之间的同分子之间的同性电荷相斥力性电荷相斥力,易于互相聚合而形成易于互相聚合而形成dna钠盐沉钠盐沉淀淀,当加入的盐溶液浓度太低时当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分只有部分dna形成形成dna钠盐而聚合钠盐而聚合,这样就造成这样就造成dna沉淀不完沉淀不完全全,当加入的盐溶液浓度太高时当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好其效果也不好.在沉淀的在沉淀的dna中中,由于过多的盐杂质存在由于过多的盐杂质存在,影响影响dna的酶切等反应的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀必须要进行洗涤或重沉淀. 加核糖核酸酶降解核糖核酸后加核糖核酸酶

52、降解核糖核酸后,为什么再要用为什么再要用sds与与kac来处理来处理? 加进去的加进去的rnase本身是一种蛋白质本身是一种蛋白质,为了纯为了纯化化dna,又必须去除之又必须去除之,加加sds可使它们成为可使它们成为sds-蛋白复合物沉淀蛋白复合物沉淀,再加再加kac使这些复合物使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的转变为溶解度更小的钾盐形式的sds-蛋白质蛋白质复合物复合物,使沉淀更加完全。也可用饱和酚，氯使沉淀更加完全。也可用饱和酚，氯仿抽提再沉淀，去除仿抽提再沉淀，去除rnase。在溶液中，有人。在溶液中，有人以以kac代替代替naac，也可以收到较好的效果。，也可以收到较好的效果。为

53、什么在保存或抽提为什么在保存或抽提dnadna过过程中，一般采用程中，一般采用tete缓冲液？缓冲液？在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑则是考虑dnadna的稳定性及缓冲液成分不产生干的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用扰作用。在在dnadna反应时反应时, ,不同的酶对辅助因子的种类不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同及数量要求不同, ,有的要求高离子浓度有的要求高离子浓度, ,有的有的则要求低盐浓度则要求低盐浓度, ,采用采用tris-hcl(pka=8.0)tris-hcl(pka=8.0)的的缓冲系统缓冲系统, ,由于缓冲液是由于缓冲液是t

54、rish+/tris,trish+/tris,不存在不存在金属离子的干扰作用金属离子的干扰作用, ,故在提取或保存故在提取或保存dnadna时时, ,大都采用大都采用tris-hcltris-hcl系统系统, ,而而tete缓冲液中的缓冲液中的edtaedta更能稳定更能稳定dnadna的活性的活性. . 如何选择聚乙二醇如何选择聚乙二醇(6000)的的浓度来沉淀浓度来沉淀dna?采用采用peg(6000)沉淀沉淀dna，大小不同的，大小不同的dna分子所用的分子所用的peg的浓度也不同的浓度也不同,peg的浓度低的浓度低,选择选择性沉淀性沉淀dna分子量大分子量大,大分子所需大分子所需peg

55、的浓度只需的浓度只需1%左右左右,小分子所需小分子所需peg浓度高达浓度高达20%. 选择性沉淀选择性沉淀4.3kb的的pbr322质粒质粒dna,每毫升每毫升加入加入0.4毫升的毫升的30%peg,其最终其最终peg浓度为浓度为12%.peg选择性沉淀选择性沉淀dna的分辩率大约的分辩率大约100bp. 抽提抽提dnadna去除蛋白质时去除蛋白质时, ,怎怎样使用酚与氯仿较好样使用酚与氯仿较好? ?苯酚：苯酚：使蛋白质变性，同时抑制了使蛋白质变性，同时抑制了dnasednase的降解作的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与dna dna 联结联结键已断，

56、蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而dnadna溶于水相。溶于水相。氯仿：氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与水相分层。克服酚的缺点；加速有机相与水相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的痕量酚。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的痕量酚。（酚易溶于氯仿中）（酚易溶于氯仿中）经过离心经过离心, ,变性蛋白质的密度比水的密度为大变性蛋白质的密度比水的密度为大, ,因因而与水相分离而与水相分离, ,沉淀在水相下面沉淀在水相下面, ,从而与溶解在水从而与溶解在水相中的相中的dnadna分开。而酚与氯仿有机

57、溶剂比重更大分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大, ,保留在最下层保留在最下层。 在去除蛋白质的作用中在去除蛋白质的作用中, ,各有利弊各有利弊, ,酚的变性作酚的变性作用大用大, ,但酚与水相有一定程度的互溶但酚与水相有一定程度的互溶, ,大约大约10%-15%10%-15%的水溶解在酚相中的水溶解在酚相中, ,因而损失了这部分水相中的因而损失了这部分水相中的dna,dna,而氯仿的变性作用不如酚效果好而氯仿的变性作用不如酚效果好, ,但氯仿与水但氯仿与水不相混溶不相混溶, ,不会带走不会带走dnadna。所以在抽提过程中。所以在抽提过程中, ,混合混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水

58、使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚相中有残留的酚, ,由于酚与氯仿是互溶的由于酚与氯仿是互溶的, ,可用氯可用氯仿第二次变性蛋白质仿第二次变性蛋白质, ,此时一起将酚带走。也可以此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时在第二次抽提时, ,将酚与氯仿混合将酚与氯仿混合(1:1)(1:1)使用。使用。（利用氯仿除酚）（利用氯仿除酚）为什么用酚与氯仿抽提为什么用酚与氯仿抽提dnadna时时, ,还要加少量的异戌醇还要加少量的异戌醇? ?在抽提在抽提dnadna时时, ,为了混合均匀为了混合均匀, ,必须剧烈振荡数必须剧烈振荡数次次, ,这时在混合液内易产生气泡这时在混合液内易产生

59、气泡, ,气泡会阻止气泡会阻止相互间的充分作用。相互间的充分作用。加入异戌醇能降低分子表面张力加入异戌醇能降低分子表面张力, ,所以能减少所以能减少抽提过程中的泡沫产生抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戌醇为一般采用氯仿与异戌醇为24:124:1之比。也可以之比。也可以采用酚采用酚, ,氯仿与异戌醇之比为氯仿与异戌醇之比为25:24:1(25:24:1(不必先不必先配制配制, ,可在临用前把一份酚加入一份可在临用前把一份酚加入一份24:124:1的氯的氯仿互异戌醇即成仿互异戌醇即成,),)，同时异戌醇有助于分相，同时异戌醇有助于分相, ,使离心后的上层水相使离心后的上层水相, ,中层变性蛋

60、白相以及下中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。层有机溶剂相维持稳定。 为什么要用为什么要用ph8ph8的的tristris水溶液水溶液饱和酚饱和酚? ?呈粉红色的酚可否呈粉红色的酚可否使用使用? ?如何保存酚不被空气如何保存酚不被空气氧化氧化? ?因为酚与水有一定的互溶。苯酚用水饱和的目的是使其因为酚与水有一定的互溶。苯酚用水饱和的目的是使其抽提抽提dnadna过程中过程中, ,不致吸收样品中含有不致吸收样品中含有dnadna的水分的水分, ,减少减少dnadna的损失。的损失。用用tristris调节至调节至phph为为8 8是因为是因为dnadna在此条件下比较稳定在此条件下比较稳定