《半薄超薄切片技术》ppt课件

1、半薄半薄/超薄切片技术超薄切片技术背景：背景：肉眼肉眼光学显微镜光学显微镜透射电镜透射电镜分分辨辨率率0.2mm0.2m0.2nm运运用用范范围围可察看可察看头发丝、头发丝、双面刀双面刀刀刃的刀刃的厚度厚度可察看细胞可察看细胞的构造的构造(最大有效最大有效倍数倍数:1000)可察看细胞内的可察看细胞内的构造构造,分辨分辨DNA、蛋白质等生物大蛋白质等生物大分子、单个金属分子、单个金属原子放大倍数原子放大倍数可达百万倍可达百万倍察看半薄切片察看半薄切片察看超薄切片察看超薄切片半薄切片超薄切片？一、超薄切片技术引见一、超薄切片技术引见固定地好固定地好浸透包埋地好浸透包埋地好切地好切地好载网膜做地好

2、载网膜做地好染地好染地好 超薄切片的根本要求超薄切片的根本要求:超薄切片主要步骤超薄切片主要步骤取材取材固定固定漂洗、脱水漂洗、脱水浸透、包埋浸透、包埋超薄切片超薄切片超薄切片染色超薄切片染色每一步都是关每一步都是关键键,任何环节的任何环节的忽略都会导致忽略都会导致制片的失败制片的失败1 取材取材 1.1 取材的根本要求取材的根本要求 (1)动作迅速，取材后快速放入固定液中；动作迅速，取材后快速放入固定液中；(2)体积要小，普通体积要小，普通13，假设来不及，例如野外取，假设来不及，例如野外取材，也可将组织修成材，也可将组织修成112mm大小长条形，大小长条形，之后再进展分割。之后再进展分割。

3、 (3)减小损伤，切割器械锋利，操作轻，防止牵拉、减小损伤，切割器械锋利，操作轻，防止牵拉、挫伤与挤压组织。挫伤与挤压组织。(4)低温操作，最好在低温低温操作，最好在低温(04)下进展，降低下进展，降低酶的活性。所用器具和固定液都应预冷。酶的活性。所用器具和固定液都应预冷。 (5)取材部位要准确。取材部位要准确。1.2 取材方法取材方法 资料放在干净的韧性较大的纸上资料放在干净的韧性较大的纸上 滴上预冷的固定液滴上预冷的固定液 用刀片将组织切下并修小用刀片将组织切下并修小 用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。的固定液的小瓶中。植物资料的取材可以先切

4、成薄片，经适植物资料的取材可以先切成薄片，经适当固定后再切成小方块继续固定。当固定后再切成小方块继续固定。 2 固定固定 (抽气抽气)2.1 固定的目的固定的目的 采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的过采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的过程称之为固定。程称之为固定。 目的是尽能够使细胞中的各种细胞器以及目的是尽能够使细胞中的各种细胞器以及大分子构造坚持生活形状，结实地固定在大分子构造坚持生活形状，结实地固定在它们原来所在的位置上，不发生位移。它们原来所在的位置上，不发生位移。 良好的固定是获得精细构造的形状学图象良好的固定是获得精细构造的形状学图象的关键。的关键。2.2 常用固定剂常用固定剂 (

5、1)四氧化锇四氧化锇 (OsO4)- OSMIUM TETRAOXIDE 强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，可较好的固定脂肪、强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，可较好的固定脂肪、蛋白质、磷酸脂蛋白；蛋白质、磷酸脂蛋白；固定变性固定变性DNA及核蛋白，不能固定天然及核蛋白，不能固定天然DNA、RNA及糖原；及糖原；具有固定和电子染色双重作用，样品图象反差较好；具有固定和电子染色双重作用，样品图象反差较好；酶的钝化剂，不适宜细胞化学的固定；酶的钝化剂，不适宜细胞化学的固定；与乙醇与乙醇/醛类反响消费沉淀漂洗醛类反响消费沉淀漂洗分子较大分子较大,浸透速度缓慢浸透速度缓慢,但反响迅速但反响迅速,均匀固

6、定深度均匀固定深度0.25；固定时间普通为固定时间普通为1-2小时小时,时间太长易使组织变脆时间太长易使组织变脆,切片困难；切片困难；锇酸固定液常用浓度：锇酸固定液常用浓度：12; 极易挥发，对粘膜、角膜毒性极大极易挥发，对粘膜、角膜毒性极大,操作要非常小心操作要非常小心!(2)戊二醛戊二醛 ( C5H8O2)-glutaraldehyde 有效保管组织细微构造有效保管组织细微构造,对蛋白质的固定效果好；对蛋白质的固定效果好；浸透力强浸透力强,浸透速度快浸透速度快,较好的固定糖原、核蛋白、微管、较好的固定糖原、核蛋白、微管、内质网和细胞基质、有丝分裂的纺锤丝及胞饮小泡等；内质网和细胞基质、有丝

7、分裂的纺锤丝及胞饮小泡等；保管某些酶的活力保管某些酶的活力,较好保管抗原较好保管抗原,适于细胞化学研讨；适于细胞化学研讨；对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，均匀固定深对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，均匀固定深度度:0.51mm ,04可长时间固定可长时间固定(几周甚至几周甚至12个月个月)不会使组织变脆，可用于远离实验室的取材不会使组织变脆，可用于远离实验室的取材;缺陷缺陷:不能保管脂肪，磷脂固定效果差，对细胞膜的显示不能保管脂肪，磷脂固定效果差，对细胞膜的显示较差，没有电子染色作用。较差，没有电子染色作用。 (3)甲醛甲醛-Formaldehyde 浸透组织的才干比戊二醛强，对于致密组织浸

8、透组织的才干比戊二醛强，对于致密组织种子固定作用好；种子固定作用好；细胞精细构造保管质量不如戊二醛，但酶活细胞精细构造保管质量不如戊二醛，但酶活性的保管优于戊二醛；性的保管优于戊二醛；缺陷：不能较好的固定细胞基质，脱水后大缺陷：不能较好的固定细胞基质，脱水后大部分细胞基质将丧失；部分细胞基质将丧失；常用多聚甲醛戊二醛的混合固定液。常用多聚甲醛戊二醛的混合固定液。(4)高锰酸钾高锰酸钾强氧化剂，较好固定脂蛋白强氧化剂，较好固定脂蛋白;对神经髓鞘、叶绿体及其他各种膜构对神经髓鞘、叶绿体及其他各种膜构造的研讨均可作为固定剂；造的研讨均可作为固定剂；只用于某些常用固定剂难以固定的植只用于某些常用固定剂

9、难以固定的植物和酵母样品，且普通不需求用锇酸物和酵母样品，且普通不需求用锇酸后固定后固定.3漂洗、脱水漂洗、脱水3.1漂洗漂洗漂洗的目的漂洗的目的:组织固定后脱水前的漂洗组织固定后脱水前的漂洗: 去除残留固定剂去除残留固定剂,减小固定剂和脱水剂之间减小固定剂和脱水剂之间的反响，防止沉淀物干扰超微构造的察看的反响，防止沉淀物干扰超微构造的察看.双重固定中双重固定中,在锇酸固定前的漂洗在锇酸固定前的漂洗: 防止锇酸与戊二醛反响生成细小而致密的防止锇酸与戊二醛反响生成细小而致密的饿沉淀，破坏细胞构造饿沉淀，破坏细胞构造.常常 用用 缓冲液缓冲液优优 点点缺缺 点点 pH磷酸盐磷酸盐缓冲液缓冲液对细胞

10、无毒性作用对细胞无毒性作用,缓冲才干强缓冲才干强固定时易产生固定时易产生沉淀沉淀,易长细菌易长细菌植物资植物资料普通料普通6.87.2二甲砷二甲砷酸盐缓酸盐缓冲液冲液不易长细菌不易长细菌,与低与低浓度钙质浓度钙质1-3mM不发生沉淀反响不发生沉淀反响有毒有毒(通风橱通风橱)醋酸醋酸巴比妥巴比妥缓冲液缓冲液固定时不产生沉淀固定时不产生沉淀易长细菌易长细菌,只适只适于配锇酸固定于配锇酸固定液液,不适宜配醛不适宜配醛类类(缓冲失效缓冲失效)3.2 脱水脱水目的目的 将组织内的游离水彻底去除将组织内的游离水彻底去除,保证保证包埋介质完全渗入组织内部。包埋介质完全渗入组织内部。方法方法 用一种和水及包埋

11、剂均能相混溶用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水的液体来取代水,常用的脱水剂是常用的脱水剂是乙醇和丙酮。乙醇和丙酮。本卷须知本卷须知脱水梯度逐级进展脱水梯度逐级进展, 急剧脱水会引起细急剧脱水会引起细胞收缩。胞收缩。 30% 50%70%80%95%100%100%;改换溶液动作要快。长时间暴露空气中改换溶液动作要快。长时间暴露空气中会在组织内外产生微小气泡，影响浸会在组织内外产生微小气泡，影响浸透；透；脱水过程中应在脱水过程中应在70%脱水剂中脱水剂中4停留停留或过夜或过夜,过度脱水不仅引起更多物质的过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而且会使样品发脆，呵斥切片抽提，而且会使样品发脆，呵斥

12、切片困难困难;置换用脱水剂：环氧丙烷置换用脱水剂：环氧丙烷Epon812、二甲苯石蜡。二甲苯石蜡。4 浸透和包埋、聚合浸透和包埋、聚合4.1浸透浸透浸透就是利用包埋剂渗入到组织内部浸透就是利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂的过程。取代脱水剂的过程。 包埋剂在单体形状时包埋剂在单体形状时(聚合前聚合前)为液体，为液体，可以渗入组织内，当参与某些催化剂，可以渗入组织内，当参与某些催化剂，经加温或其他条件，能聚合成固体，经加温或其他条件，能聚合成固体，以便进展超薄切片。以便进展超薄切片。4.2 包埋、聚合包埋、聚合 包埋操作：包埋操作： 将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中或胶囊将组织块包埋在多孔橡胶包

13、埋模板中或胶囊中，一定条件下可聚合硬化，构成包埋块。中，一定条件下可聚合硬化，构成包埋块。包埋板包埋板1包埋管包埋管胶囊胶囊常用的包埋剂常用的包埋剂Epon812浸透效果好，切片的图像对比度强，浸透效果好，切片的图像对比度强，电子束照射下稳定电子束照射下稳定吸潮性很强，吸潮性很强，潮湿和炎热的潮湿和炎热的环境下，树脂环境下，树脂会变软会变软Spurr黏度低，可较好地浸透具有硬的木黏度低，可较好地浸透具有硬的木质化细胞壁的植物细胞、脂肪含量质化细胞壁的植物细胞、脂肪含量很高的内胚乳、高度液泡化的成熟很高的内胚乳、高度液泡化的成熟果实果实,电子束照射下稳定电子束照射下稳定图像对比度较图像对比度较弱

14、弱Araldite聚合均匀，收缩量很小，超薄切片聚合均匀，收缩量很小，超薄切片可直接沾在没有支持膜的载网上，可直接沾在没有支持膜的载网上，电子束照射下非常稳定，用重金属电子束照射下非常稳定，用重金属染色时易着色。染色时易着色。环氧树脂环氧树脂(epoxy resin)水溶性树脂丙烯酸类树脂水溶性树脂丙烯酸类树脂 LR White、 Lowicryls、GMA、PEG 等，适于进展组织化学和细胞化学研等，适于进展组织化学和细胞化学研讨的样品制备。讨的样品制备。 适于低温包埋，通常用于免疫电镜样适于低温包埋，通常用于免疫电镜样品的制备。品的制备。 包埋操作中的本卷须知包埋操作中的本卷须知一切试剂要

15、防潮，最好存放在枯燥器中；一切试剂要防潮，最好存放在枯燥器中；所用器皿应烘干；所用器皿应烘干；配包埋剂时，每参与一种试剂要搅拌均匀；配包埋剂时，每参与一种试剂要搅拌均匀；包埋时动作要轻巧，防止产生气泡；包埋时动作要轻巧，防止产生气泡；盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净.皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；5 超薄切片超薄切片5.1修块修块削去外表的包埋剂，显露组织，然后在组削去外表的包埋剂，显露组织，然后在组织的周围以和程度面成织的周围以和程度面成45度的角度削去包度的角度削去包埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或

16、长埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度为方形，每边的长度为0.2mm0.3mm。5.2 超薄切片超薄切片 超薄切片机：超薄切片机：LEICA ULTRACUT R超薄切片厚度超薄切片厚度: 100nm,普通普通 50-70nm5.3 载网和支持膜载网和支持膜载网载网(超薄超薄) 载网载网铜网铜网(常用常用)不锈钢网不锈钢网镍网镍网(免疫电镜免疫电镜)直径：2-3mm，厚度：0.03-0.02mm 5.3 载网和支持膜载网和支持膜 (2) 载网支持膜载网支持膜膜的要求膜的要求:透明无构造透明无构造,并能接受电子束的轰击并能接受电子束的轰击.支持膜的种类支持膜的种类: 火棉胶膜火棉

17、胶膜 聚乙烯醇缩甲醛膜聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar膜膜) 碳膜碳膜膜的厚度膜的厚度:10nm20nm6 超薄切片的染色超薄切片的染色目的目的: 加强样品的反差加强样品的反差,提高图象的明晰度提高图象的明晰度.常用染色剂常用染色剂: 重金属盐重金属盐 各种染料各种染料常用的染色剂常用的染色剂: 醋酸铀和柠檬酸铅。醋酸铀和柠檬酸铅。染色方法：染色方法：(1) 组织块染色组织块染色 在脱水至在脱水至70%乙醇时，将组织块放在用乙醇时，将组织块放在用70%乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中，染色乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中，染色时间时间2小时以上，或在冰箱中过夜。小时以上，或在冰箱中过夜。 超薄切片染色超薄

18、切片染色(2)超薄切片后染色超薄切片后染色醋酸双氧铀醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染柠檬酸铅双染铀染铀染:细胞核及结缔组织染色细胞核及结缔组织染色铅染铅染:提高细胞质成分的反差提高细胞质成分的反差1前固定固定液体积是固定资料的十倍以上，资料不堆前固定固定液体积是固定资料的十倍以上，资料不堆积积3%戊二醛戊二醛 in 0.1M PBS ,ph7.2，室温，室温5-6h，后，后4C保管保管2漂洗：漂洗： 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗充分漂洗3-4次，次，20-30Min/次次3后固定后固定1%锇酸固定锇酸固定 in 0.1M PBS，4C overnight4漂洗：漂洗： 0.1M PBS Ph

19、7.2 充分漂洗充分漂洗3-4次，次，20-30Min/次次5系列脱水：系列脱水：30%-50%-70%4C, overnight,可以停下可以停下-80%-95%-100%-100%用丙酮置换乙醇：用丙酮置换乙醇：乙醇乙醇:丙酮丙酮=1:1，纯丙酮，纯丙酮2次，次， 每级每级20-30分钟分钟6浸透浸透丙酮丙酮:树脂树脂=2:1， 1:1可以停下了，可以停下了，overnight ，1:2 2-3h/级级纯树脂纯树脂12h，换纯树脂换纯树脂12h 从进入树脂开场更要严厉防潮！从进入树脂开场更要严厉防潮！7包埋聚合包埋聚合 60C 24hr留意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成留意：免疫电镜时

20、不用锇酸固定，树脂换成LRWhite等水溶等水溶性树脂，固定液可以是性树脂，固定液可以是1.25%戊二醛戊二醛+1.25%多聚甲醛多聚甲醛 in 0.1M PBS Ph 7.2超薄切片图片超薄切片图片二、半薄切片技术引见二、半薄切片技术引见半薄切片主要步骤半薄切片主要步骤取材取材固定固定漂洗、脱水漂洗、脱水浸透、包埋浸透、包埋半薄切片半薄切片半薄切片染色半薄切片染色每一步都是关每一步都是关键键,任何环节的任何环节的忽略都会导致忽略都会导致制片的失败制片的失败FAA固定液固定液福尔马林福尔马林5-冰醋酸冰醋酸5-70%酒精酒精90半半薄薄/石蜡切片石蜡切片普通固定根、茎、叶、花药、子房组普通固定根、茎、叶、花药、子房组织切片。织切片。幼嫩资料用幼嫩资料用50%酒精替代酒精替代70%酒精，酒精，防止资料收缩；防止资料收缩；参与参与5%甘油可防固定液蒸发和资料变甘油可防固定液蒸发和资料变硬。硬。卡诺固定液卡诺固定液 12纯酒精15ml30ml氯仿5ml 冰醋酸5ml