生化分析技术总复习

1、生化分析技术第一编 概述第一章 概论一 生化研究技术：从生物材料中分离、纯化生物分子，并对各成分进行检测的一门科学。二 研究内容：生化分离制备、生化分离分析。三 生化技术特点：1. 材料组成非常复杂2. 目标成分在材料中含量极微3. 生物物质的活性易遭到破坏，需要选择适宜条件4. 影响因素很多，实验方法经验性强第二章 生命大分子物质的制备 生命大分子：通常指动物、植物和微生物在进行生长发育、新陈代谢时所形成的蛋白质（包括酶）和核酸等有机化合物的总称。 生命大分子物质制备的基本流程：材料的选择与处理测力方法的确定细胞破碎抽提浓缩纯化方案的设计与评价有效成分纯度和性质的分析及包装第一节 材料的选择

2、与处理一 材料的选择 有效成分：是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。 杂质：有效成分以外的其他物质。 材料选择遵循的原则： 有效成分含量多、稳定性好 来源丰富、保持新鲜 提取容易、工艺简单 杂质有综合利用价值二 材料的处理 动物脏器：1. 冰冻最常用的处理方法从刚宰杀的动物中得到的脏器，若不马上抽提、纯化时，应及时移至-10冰库（可短时间保存），或-70低温冰箱（数月不变质）贮存。2. 干燥制成丙酮粉3. 脱脂方法： 人工剥去脏器外的脂肪组织 浸泡在脂溶性的有机溶剂（如丙酮、乙醚）中脱脂 采用快速加热（50左右）、快速冷却的方法，使熔化的油滴冷却后凝聚成油块而除去 利用油脂分离器使油脂与水溶

3、液得以分离 植物组织：若是叶片，需用清水洗净方可使用，或置-30-4冰箱贮藏，可在10h内使用。若是种子，则需要泡涨或粉碎后才可以使用。（若种子中含油脂较多时，也要进行脱脂处理） 微生物：若要收集胞外酶或某些辅基，则用接种于适当的培养液培养一段时间后，用离心法收集到的上清液即可。（可置低温下短时间贮存）若要收集胞内酶，则用收集到的菌体经破碎细胞后提取其有效成分。（可制成冻干粉，在4保存）第二节 测定方法的确立一 目的与要求1. 目的：跟踪检测有效成分。2. 要求：专一、灵敏和简便快速的测定方法二 常用的测定方法 光谱法使用最多的一种方法包括：紫外光谱法（测定核酸含量、测定蛋白质的含量及纯度）、

4、可见光光谱法、荧光光谱法、浊度法 电化学法有些化学反应过程放出质子氢（H+），可用灵敏的PH计或NaOH溶液滴定等方法追踪其变化，从而计算出欲测物的含量或活性。 生物活性检测法专一性强但速度慢 免疫分析法灵敏度高、专一性强采用抗原与抗体之间发生的特异性反应。 生物传感器可通过显示器反应出有效成分的数量。第三节 细胞破碎一 机械破碎 研磨法原理：利用机械作用力用研磨棒研碎，如在研钵中加入一定量的石英砂（4550m）可提高研磨效果。也可用匀浆器处理，此法较温和，适宜实验室应用。若是大规模生产则用电动研磨法。 组织捣碎器法原理：利用机械作用力这是一种剧烈的破碎细胞的方法。捣碎器（800010000r

5、/min）处理3045s。（动植物细胞皆可，若为酵母或细菌细胞时，需加石英砂才有效。）在捣碎期间，必须保持低温，以防止操作过程温度升高引起有效成分变性，捣碎时间也不易太长。 超声波法原理：利用超声波来破碎细胞（20kHz40kHz）。常用于处理菌体细胞为防止电器长时间运转产生过多的热量，常采用间歇处理和降低温度(冰浴)的方法进行。（噪声用隔音箱处理） 冻融法将细胞置低温下冰冻一定时间后，取出置室温（或40左右）迅速融化。如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、破碎。 压榨法原理：在高压下使细胞快速通过小孔，并撞击在撞击环上，压力突然降低的剪切力及撞击的剪切力使细

6、胞破碎。二 溶胀和自溶(渗透压冲击法:是一种较温和的处理方法) 溶胀：在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子连续大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象。 自溶：细胞结构在本身所固有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下，发生破裂、溶解的现象。三 化学处理用脂溶性的溶剂（如丙酮、氯仿、甲苯）或表面活性剂（如十二烷基磺酸钠或十二烷基硫酸钠）处理细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种蛋白质类或DNA等物质，并导致整个细胞破碎。四 生物酶降解生物酶（如溶菌酶）有降解细菌细胞壁的功能。第四节 抽提一. 抽提的含义 抽提：通常是指用适当的溶液（如缓冲液、稀酸、稀碱或有机溶

7、剂（如丙酮、乙醇）进行反复萃取，逐步将原料中有效成分最大限度分离出来的过程。 抽提液应具备的条件： 对有效成分溶解度大、破坏作用小 对杂质不溶解或溶解度很小 来源广泛、价格低廉、操作安全二. 抽提有效成分的影响因子 PH由于生物大分子存在等电点PI，所以，选择溶液应偏离其PI并稳定存在的PH范围，杂质溶解度最小。抽提碱性蛋白质选用低PH的溶液；抽提酸性蛋白质选用高PH的溶液。 溶剂的极性会影响大分子物质的溶解度和稳定性。降低溶剂极性的方法：在水溶液中加入蔗糖或甘油至一定浓度。增加溶剂极性的方法：加入中性盐如KCl、NaCl。 溶液的离子强度会影响不同物质的溶解度。一般来说，离子强度较低的中性盐

8、溶液有促进蛋白质溶解，保护蛋白质活性的作用，离子强度过高则会引起蛋白质发生盐析作用。 水解酶避免水解的措施：在抽提液中加入抑制剂(苯甲基黄酰氟化物，PMSF)，调节抽提液的PH、离子浓度、极性等，以使水解酶活性降到最低。 温度一般认为蛋白质或酶制品在低温（0左右）时最稳定。 搅拌搅拌可促使欲抽提物与抽提液之间相互接触，并能增加溶解度。 氧化一般蛋白质都含有相当数量的巯基，该基团常常是酶和蛋白质的必需基团。若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键导致酶（或蛋白质）失活（或变性）。还原剂：-巯基乙醇（15mmol/L）、半胱氨酸（520mmol/L）、还原谷胱甘肽、巯基乙

9、酸盐（15mmol/L）、二硫苏糖醇、抗坏血酸。 金属离子蛋白质的巯基除易受氧化剂作用外，还能和金属离子如铅、铁或铜结合，产生沉淀复合物。解决办法： 用无离子水或重蒸水配置试剂 在配置的试剂中加入13mmol/L EDTA 抽提液与抽提物的比例在抽提时，抽提液与抽提物的比例要适当，一般以5:1 为宜。第五节 浓缩一 沉淀法多用盐析（较好的方法）。加入适量的中性盐或有机溶剂，使有效成分变为沉淀。盐析离心分离脱盐溶解（透析、凝胶过滤）二 吸附法将干葡聚糖凝胶G25（或吸水棒）加入抽提液中，二者比例为1:5。由于凝胶吸水之故，抽提液的体积可缩小3倍左右，回收蛋白质量约80%。三 超过滤法在充气加压下

10、使小分子物质（包括水分）通过超滤膜，大分子物质被截留得以浓缩。四 透析法把盛抽提液的透析袋（由半透膜制成）埋在吸水力强的聚乙二醇或甘油中，袋内的水分等小分子物质可透过半透膜逐渐移至袋外，有效成分则留在袋内，抽提液（10ml）可以很快（1h）浓缩到几乎无水的程度。五 减压蒸馏法将抽提液装入减压蒸馏器的圆底烧瓶中，在减压真空状态下进行蒸馏。六 冰冻干燥法冷冻抽真空水分升华干燥第六节 纯化方案的设计与评价 纯化方案：是指在纯化某一物质过程中，根据实际情况将几种分离方法（如沉淀法、离子交换层系、葡萄糖凝胶等）有机地优势互补、灵活调节、联合运作的总称。一 纯化方案的设计对纯化方法进行选择，并使其程序化的

11、过程。原理：根据有效成分和杂质之间的理化性质的差异。原则：一是在纯化方案中，切忌一种分离方法重复使用，否则，不但不能提高纯化倍数，反而会降低回收率；二是初期设计的提纯方案，并非一蹴而就、一成不变，而是在试验中，往往需要对整个方案及所属的方法（包括相关细节）进行不断地修正、调节，才能日趋完善。二 纯化方案的评价对纯化方案的评价，实质上是对组成纯化方案的每一种分离方法的评价。比活性=活性单位数/毫克蛋白纯化倍数=每步的比活性/粗抽提液的比活性收得率=每步的总活性/粗抽提液总活性100% 一般收得率100%原因：纯化前有酶抑制剂存在，纯化后消除抑制剂，酶活性增高，收得率升高。 也存在酶活力明显下降的

12、现象。原因：方法不适，纯化过程去掉了酶的辅助因子。 一般符合下列两点说明此方法具有应用价值：1. 纯化倍数2的方法2. 有一定收得率的方法注：一般纯化倍数大，收得率高的方法应用价值大。第七节 有效成分纯度和性质的分析及包装一 分析常用于鉴定生物制品纯度的方法：电泳、免疫分析、薄层层析、薄膜层析常用于检测其含量和性质的方法：光谱法、气相层析、生物芯片常用于测定有效成分分子质量的方法:凝胶过滤、电泳常用于测定核酸序列的方法：化学直读法、酶解直读法常用于测定蛋白质序列的方法：Edman降解法相结合的薄膜层析二 包装根据纯度不同（成本高低）进行分装固体装：克、毫克、微克等液体装：一般以毫升、微升为单位

13、。第八节 应用实例Chloroplast isolation Procedure叶绿体分离程序1. Wash 30 gms of spinach leaves thoroughly first with tap water and then with distill water.将30g菠菜叶先用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净。2. Remove the midrib veins of the leaves and cut into small pieces.取主叶脉两侧的叶片并切成小块。3. Add 120 ml of 1x Chloroplast Isolation Buffer (CIB)

14、with BSA to the cut leaves in a blender. Blend with 2-3 strokes.在切碎的叶片中加入120mL 1叶绿体分离缓冲液（CIB）和牛血清白蛋白并一起放入搅拌机中。搅拌2-3下。4. Filter the blended leaves through 6 layers of muslin cloth.用6层棉布过滤混合后的叶片。5. The filtrate is then evenly divided into four 50 ml centrifuge tubes.将滤液均匀分到4个50mL离心管中。6. Centrifuge the

15、 tubes for 3 minutes at 200xg. A white pellet will be obtained.在200g下离心3min。得到一个白色的沉淀。7. Transfer the supernatant into chilled 50 ml centrifuge tubes and centrifuge at 1000g for 7 minutes. A green pellet will be obtained. 将上清液移至50mL，在1000g下离心7min。得到一个绿色沉淀。8.Discard the supernatant and break the gree

16、n pellet gently by finger tapping. 除去上清液，轻轻用手指敲散绿色沉淀。9. Resuspend the pellet in 2ml of 1 CIB buffer with BSA and mix gently by pipetting up and down.将沉淀在2ml1CIB缓冲与BSA混合后轻弹。10.Pool the suspended pellet into one centrifuge tube.取沉淀放入离心管。Separation of intact and broken chloroplast分离和破碎完整的叶绿体11.Preparat

17、ion of 40% Percoll layer: Mix 4 ml percoll with 6 ml of 1x CIB buffer with BSA.40%Percoll层的制备：将4 mlPercoll和1CIB缓冲与6mL BSA混合。12.Gently overlay 6ml of the chloroplast suspension over this 40% percoll layer.轻轻地将6毫升叶绿体悬浮液覆盖在这个40%的Percoll层上。13.Centrifuge at 1700g for 6 minutes. The intact chloroplast wil

18、l sediment to the bottom of the tube as a green pellet and the broken chloroplast will form the upper layer.在1700 g下离心6 min。绿色颗粒状的完整的叶绿体会沉积到管底而破碎的叶绿体将在上层。14.Carefully remove the upper layer of the chloroplast suspension leaving only the pellet containing the intact chloroplast.小心地移除叶绿体悬浮液，只留下含有完整颗粒状

19、的上层叶绿体。15.Mix the pellet with 500 L of 1CIB buffer without BSA.将完整的叶绿体颗粒与不含BSA的500L 1CIB的缓冲液混合。第二编 分离技术第三章 离心技术第一节 基本原理及常用术语一 基本原理：1.定义：离心技术是利用离心机旋转时产生的强大离心力对大小、形状和密度不同的混合物进行分离的一种方法。2.描述参数：离心力： 当一个粒子在高速旋转下受到的离心作用力“Fc”由下式定义： Fc = ma = m2 r a：粒子旋转的加速度， m：沉降粒子的有效质量， ：粒子旋转的角速度， r：粒子的旋转半径( cm )。 2 r：单位质量

20、的粒子受到的离心力，称单位离心力，单位离心力用相对离心力来表示。相对离心力：(relative centrifugal foce RCF)：颗粒所受离心力相当于地球重力的倍数 。RCF表示方法：数字g转速（N）注意：r平均=（r最小+r最大）/2 一般在低速离心时（转速小于5000 r/min），离心力的大小常用r/min来表示，而超速离心时则用g或g来表示。3. 粒子的沉降速度t:沉降时间 :悬浮介质的黏度 rp:颗粒半径 p:颗粒密度 ：介质密度 rt:旋转中心到液面的距离 rb:旋转中心到管底的距离 w：角速度w由公式可知，在一定离心场中，颗粒的沉降速度不仅与离心力有关，而且与颗粒大小、

21、密度以及介质黏度有关。一组不同的颗粒在同一条件下离心时则可以根据它们的密度和颗粒大小而分离。4.沉降系数：颗粒在单位离心力场作用下的沉降速度，用s表示，是为了纪念Svedberg对离心技术的贡献，单位为S。沉降系数在生物科学中用来表示生物分子或细胞器的大小，如s=2.510-12秒，规定1S=10-13秒，则大小为25S.第二节 离心机 一 离心机的分类1. 根据其最大转速可以分为以下几种： 普通离心机：最大转速 6 000r/min， 最大相对离心力6 000g 型号很多，容量不同，转速不同，控制不精密用途：固液沉淀分离 高速离心机：最大转速 25 000r/min， 最大相对离心力90 0

22、00g 型号较多，转速不同，有控温装置，控制精密（时间、转速）用途：菌体、细胞碎片、细胞器等的分离 超速离心机：最大转速 80 000r/min， 最大相对离心力500 000g控制精密：时间控制、温度控制、转速控制、真空系统用途：细胞器分级分离、病毒、DNA、RNA、蛋白质分离提纯等2. 根据转头类型可以分为以下几种：垂直管转头3.离心机的正确操作与注意事项 检查 插好电源：设置离心温度，使其预冷 平衡：普通离心机差值的最高限度：0.25g，超速离心机：0.1g 放置：对称 开机设置 计时运转 停机 取样第三节 常用离心技术一 离心方法1.沉淀离心 选定一定的时间、速度进行离心，使样品液中的

23、大的固型物与液体分离，从而获得沉淀或上清液。又称为固液分离法。使用普通离心机。2. 差速离心 在均匀介质中，利用各种物质粒子沉降速度的不同而分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。这是从细胞匀浆中制备各种亚细胞成分最常用的方法。3.密度梯度离心速率区带离心：是根据大小、形状不同的颗粒在梯度液中沉降速度不同建立起来的分离方法。等密度梯度离心：等密度离心法也叫沉降平衡法。所谓等密度（平衡）是指最终样品密度与介质的密度相等，实际上是在梯度介质中进行的。速率区带离心法等密度梯度离心法原理沉降速度粒子本身的密度平衡介质密度梯度范围介质密度样品密度时间效应长时间离心，各粒子均沉于管底长时间

24、离心，形成区带转速相对较低高速或超速分离样品密度差异不大，分子量差异大密度差异大，分子量差异不大 密度梯度离心后的收集穿刺法：用一根金属空心针从离心管底刺入管内，不同区带内的组分自下而上地先后从针管内分别流出，然后用部分收集器分别收集。取代法：往离心管中注入高密度的离心介质（其密度高于离心管中所形成的最大密度）。当取代液不断注入时，离心管中的溶液逐渐上升，并不断从收集导管中流出，然后用部分收集器分别收集。切片法 密度梯度材料 糖类：蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、右旋糖酐Dextran）、聚蔗糖（Ficoll）、PEG。 主要用于细胞、细胞器和病毒的分离 盐类：氯化铯、氯化铷、溴化钾、碘化钠、溴化

25、钠、溴化锂、溴化铷和柠檬酸钾等 主要用于核酸、蛋白质和病毒的分离纯化。 有机碘化物 典型的是三碘苯甲酰葡萄糖胺，它是一种优良的梯度材料。差速分级离心：只能分离沉降系数相差10倍以上的颗粒。密度梯度离心：用于沉降系数相差10-20%的颗粒，或者颗粒密度差小于0.01%的组分。第三编 纯化方法第四章 沉淀法 沉淀法：是纯化生命大分子物质常用的一种经典方法.该法操作简单、成本低廉，一般包括盐析沉淀、有机溶剂沉淀和选择性沉淀等类型。第一节 基本原理沉淀法也称溶解度法。其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异（如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团之间比例的差异等）来改变溶液的某些性质（如PH

26、、极性、离子强度、金属离子等），就能使抽提液中有效成分的溶解度发生变化。第二节 制备蛋白质盐析法、有机溶剂沉淀法、蛋白质沉淀法、聚乙二醇沉淀法、选择性沉淀法、结晶沉淀法一 盐析法 盐析法的根据是：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时。其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。 盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。1. 盐分及沉淀： 盐的选择：一般进行蛋白质沉淀时，常选用的盐是硫酸铵。 硫酸铵与其他盐相比具有的优点： 溶解度大，对温

27、度不敏感 分级效果好 有稳定蛋白结构的作用 价格低廉、废液可以肥田盐分及沉淀的共同缺点：得到的样品欲继续纯化时，需要花费一定时间脱盐。 硫酸铵盐析： 固体法：在大体积的粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵，当加入到一定饱和度时，蛋白质便可沉淀出来。（通常需搅拌） 饱和溶液法：这是一种使蛋白质脱水沉淀比较温和的方法。此法对加入固体硫酸铵沉淀法温和，但是对于大体积样品不适用，将导致样品溶液体积增加。 透析法：将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积盐溶液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度。适用于较精确、样品体积小的试验中使用。2.盐析曲线制作3.盐析的影响因子Y 盐析常数Y 盐析分级范围的差异

28、性Y PH和盐浓度Y 蛋白质的纯度和浓度：在混合蛋白质溶液中，不同分子间的相互作用会发生共沉淀现象。Y 其他：在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加1mmol/L的EDTA-Na2盐，以除去沉淀剂中带入的金属离子。再者，加硫酸铵沉淀的时间要控制在2h左右，过长过短都不适宜。4.脱盐常用的脱盐方法是凝胶过滤法和透析法。二. 有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一，与盐溶液一样具有脱水作用。其二，有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂极性变小。需要注意：低温下操作、中性盐作用、多价阳离子作用。 常用溶剂：甲醇、乙醇、丙酮 优点：有机溶剂沉淀法分辨能力比盐析法高，沉淀不用脱盐，过滤比较容易

29、。 缺点：对某些具有生物活性的大分子，容易引起变性失活，操作常在低温下进行；分离效果差，共沉作用大；离子强度及离子种类对其也有影响。三 蛋白质沉淀法(特异性强)蛋白质沉淀法所用的试剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用。1. 碱性蛋白质多价阳离子的碱性蛋白质，如鱼精蛋白，能有效地沉淀核酸物质外，还能沉淀某些蛋白质。2. 凝集素是一种特殊的蛋白质，该物质对糖蛋白中糖链的末端序列具有明显、特异的凝集力。该沉淀法的优点是反应条件温和，专一性强。3. 重金属重金属盐（如铅盐、汞盐）作为蛋白质沉淀剂，也能将蛋白质或酶得到纯化。由于重金属会使蛋白质变质，因此应用时要控制在较温和的条件下进行，并要及时通过透析法把

30、蛋白质与重金属尽快分开。四 聚乙二醇沉淀法（机理复杂）聚乙二醇（PEG）和右旋糖苷硫酸钠等用水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。这种沉淀的条件温和，不易引起蛋白质变性，而且沉淀较完全，因此应用范围颇广。机理： 可能通过空间位置排斥，使液体中的微粒（包括生物大分子、病毒和细菌等）被迫挤聚在一起而引起沉淀发生。 与有机溶剂相似，降低水的活度。五 选择性沉淀法（是一种思路）根据各种蛋白质在不同物理、化学因子（如温度、酸碱度和有机溶剂等）作用下稳定性不同的特点，用选择性沉淀法，即可使蛋白质变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中（或者发生可逆性沉淀），从而达到纯化有效成分的目的。六 结晶沉淀

31、法需反复结晶提纯：重结晶、复结晶。是分离纯化蛋白质、酶等生化产品的一种有效手段。 结晶沉淀法的影响因素 纯度：各种物质在溶液中均需达到一定的纯度才能析出结晶，这样就可以使结晶和母液分开，以达到进一步分离纯化的目的。 浓度：结晶液一定要有合适的浓度，结晶的大小、均匀度和结晶的饱和度有很大关系。 PH：PH的变化，可以改变溶质分子的带电性质，是影响溶质分子溶解度的一个重要因素。一般结晶液所选用的PH与沉淀大致相同。 温度：冷却的速度及冷却的温度直接影响结晶效果。 时间：结晶的形成和生长需要一定时间，不同化合物结晶时间长短不同。 晶种：不易结晶的生化物质常需加晶种，有时用玻璃棒摩擦容器壁也能促进晶体

32、析出。第三节 制备核酸 沉淀核酸应注意： 细胞或组织的有效破碎。 尽量保持核酸结构的完整。 有效地使蛋白质复合体变性。 尽量排除其他大分子成分的污染（蛋白质、多糖、及RNA或DNA）。 保证提取的核酸中不含有对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。一. DNP、RNP的解聚、除蛋白质1.去污剂法：作用：溶解膜蛋白和脂肪。将DNP/RNP复合物解聚、释放出核酸。操作：DNP/RNP + SDSSDS-蛋白质+DNA（RNA） +乙酸甲PDS-蛋白质+PDS+DNA（RNA） 离心除沉淀 上清=DNA（RNA）2.有机溶剂法：种类：饱和酚、氯仿、酚/氯仿 均为蛋白质变性剂。酚的变性作用强于氯仿

33、。 但由于酚与水一定的互溶：因此酚抽提后可能损失部分核酸，水相中还会残留酚，而酚的存在会对酶产生强烈的抑制。 由于氯仿可除去酚类，因此操作中可单用氯仿、用酚/氯仿混合液或先用酚作变性剂再用氯仿抽提。3.蛋白水解酶作用：破菌和除去蛋白质同时完成。温和、可防止破坏核酸分子。用酶解法除去DNP/RNP复合物中的蛋白质组分的操作比较温和，并可避免剪切和破坏核酸的现象发生。常用的水解酶有溶菌酶、蛋白酶K和蛋白酶E。注：市售的蛋白酶E中会含有DNase，因此在使用前应采用80处理5min或37温育0.51.0h的方法，将其失活，而蛋白酶E活性不受影响。二. 多糖等杂质的消除动物材料：宰杀前饥饿12h植物材

34、料：收割前置暗示培养数天。混杂于核酸提取液的多糖类物质，可用选择性沉淀剂，如异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，适用于酸性多糖）即可达到目的。CTAB/NaCl溶液含10%CTAB，0.7MNaCl有机溶剂沉淀核算时用丙醇和5MNaCl作为沉淀剂，NaCl:用量1/51/2倍体积，异丙醇：0.61.0倍体积。三. DNA与RNA的分离 盐析法 酶水解法： 在提取DNA时，可用RNase水解RNA杂质。有时RNase中会混有DNase，采用100热处理15min。DNase失活，而RNase活性不受影响。 在提取RNA时，可用DNase水解DNA杂质。有时DNase中会混有RNase，当有钙

35、离子存在下，加蛋白酶K作用或加碘乙酸钠（使RNase得活性中心组氨酸残基烷基化）处理，RNase会失活，而DNase活性不受影响。四. 核酸沉淀有机溶剂（乙醇-盐溶液、异丙醇）、聚乙二醇、十六烷基胺甲基溴化铵（CTAB）。1. 有机溶剂沉淀法乙醇：优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含痕量乙醇易挥发除去。不影响以后实验。缺点：需要量大，一般要求低温操作。异丙醇：优点：需体积小，速度快，适于浓度低，体积大的DNA样品沉淀，一般不需低温长时间放置。缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀，异丙醇难以挥发除去，所以，最后用70%乙醇漂洗数次。注：DNA沉淀中可能会有盐和其他小分子物质混杂，可用70%乙醇洗涤，除去

36、杂质，真空干燥即为核酸样品。 复溶：用0.5-1ml TE缓冲液分装成小体积，-20保存。第五章 层析总论层析方法可根据不同的标准分成若干类型：按流动相分类，有：液相层析和气相层析。按固定相“床”的类型，有:柱层析、薄板层析、薄膜层析等。第一节 层析方法的类型名称原理固定相流动相基质或载体吸附柱层析疏水力和静电引力固体液体吸附剂：硅胶、氧化铝、羟基磷灰石、活性炭等薄层层析具体分析固体/液体液体硅胶、氧化铝、纤维素、交联葡聚糖等疏水层析疏水力和静电引力载体和配体液体载体：交联琼脂糖 配体：苯基 载体：硅胶、树脂 配体：苯基、辛基、烷基离子交换层析离子间结合力离子交换剂液体树脂、葡聚糖凝胶、离子型

37、纤维素分子筛层析排阻效应固体液体交联琼脂糖、交联葡聚糖亲和层析亲和力聚焦层析电荷效应及离子间的结合力第二节 常用术语应用实例血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定为了初步掌握蛋白质的分离纯化技术，选择了从家畜血清中分离纯化免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，简称IgG）的实验。血清中的蛋白质有数十种之多，IgG是球蛋白的一种。分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质（如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等）的不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳和超速离心等。在分离纯化时，要根据情况选用几种方法互相配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。本

38、实验采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换及凝胶过滤等方法，提取家畜血清中IgG。其原理及操作如下：（一）硫酸铵盐析1.试剂饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取（NH4）2SO4 760g,加蒸馏水至1000mL，加热至50，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。磷酸盐缓冲溶液（0.01mol/L，pH7.0）（内含0.15mol/L NaCl，简称PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液30.5mL，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4mL，加NaCl8.5g，加蒸馏水至1000mL。 磷酸缓冲溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaC

39、l，简称PB）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5mL，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6mL混合，用蒸馏水稀释至1000mL。2.操作 取家畜血清5mL，加PBS（0.1mol/L，pH7.0）5mL，混匀（取250L至1.5mL离心管中，加PBS 250L，混匀，这500L用于本课程的第三个实验，注意编号后冷冻保存）。用250L PBS重新补齐10mL，然后，滴加（边摇边搅拌）饱和硫酸铵4mL（此时溶液硫酸铵饱和度约为20%）。静置20min，以3000r/min离心15min，沉淀为纤维蛋白（弃去），上清液中含清蛋白、球蛋白。上清中，再加饱和硫酸铵溶液6mL（方法同

40、前），此时溶液硫酸铵饱和度为50%，静置20min，以3000r/min离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。一部分组的同学，将沉淀溶于2mL PBS（0.01mol/L pH7.0），编号“总球蛋白”，备用。另一部分组的同学，将沉淀溶于5mL PBS（0.01mol/L pH7.0），加饱和硫酸铵3.2mL，此时溶液硫酸铵的饱和度约为33%，静置20min，以3000r/min离心15min，除去上清液，沉淀即为“-球蛋白”，该沉淀用2mL PBS溶解。（二）凝胶过滤脱盐1.试剂 Sephadex G-25：用前要活化和充分溶胀（旧药品：用50左右的2%氢氧化钠和0.5mol/L氯

41、化钠的混合液浸泡若干小时后，再用水洗净即可。新药品：以蒸馏水浸泡5h或在沸水浴中溶胀2h即可）；磷酸盐缓冲液（pH6.7，0.0175mol/L，PB）：见前；磷酸缓冲液（pH7.0，0.01mol/L，PBS）见前；2.操作 取层析柱一根（1.5cm20cm），垂直于固定架上，夹住流出口。加10mL PB（0.0175mol/L, pH6.7）于柱中。将已溶胀好的Sephadex G-25倾倒去水，加入PB并搅拌成悬浮液，慢慢装入柱中，打开流出口，继续加入Sephadex G-25使自然沉降至15cm高，关闭出口。打开出口，使柱中多余的PB流出凝胶柱床面（切勿低于柱床面）。用吸管吸取盐析所得

42、的“-球蛋白”溶液2mL，沿管壁加入凝胶面上，打开流出口，让样品进入凝胶柱，再用滴管小心加入PB至离凝胶面23cm高，编号，按顺序放在试管架上。使用试管分批收集。在收集的同时，使用核酸蛋白检测仪检查蛋白质是否流出，并使用记录仪记录。将“-球蛋白”的峰对应的试管合并，取500L，编号，冷冻并用于第三个实验。其它用于DEAE-纤维素52纯化。在另一个准备好的Sephadex G-25层析柱中，加入2mL“总球蛋白”样品，过柱，收集，期间使用记录仪记录。收集不同峰对应的试管样品，按收集时间顺序编号（最多-），冷冻并用于第三个实验。（三）DEAE-纤维素纯化IgG1.试剂 DEAE-纤维素：DE-11

43、、DE-22、DE-32、DE-52均可；0.5mol/L HCl溶液；0.5mol/L NaOH溶液；pH6.7，0.0175mol/L磷酸盐缓冲液，PB。2.操作 DEAE-纤维素的活化处理 称取20gDEAE-纤维素，蒸馏水浸泡过夜。次日倾去蒸馏水，加0.5mol/L NaOH溶液100mL，轻轻搅拌。静置，沉降后倒出NaOH溶液，用蒸馏水洗至pH为8左右，倒出上清液。加0.5mol/L HCl溶液100mL，轻轻搅拌，静置10min，小心倒出HCl溶液，用蒸馏水洗至pH为6，待用（2014年用过的，不用活化，但要用蒸馏水浸泡过夜）。 装柱 取层析柱一根（1.5cm20cm），按照安装S

44、ephadex G-25柱的方法装柱。待纤维素自然沉降后接通洗脱瓶让PB（pH6.7，0.0175mol/L）流经柱床，待流出液的pH为6.7为止（充分平衡）。 加样与洗脱 关闭洗脱瓶，让柱内缓冲液流出至纤维素柱面，关闭流出口，用吸管将已脱盐的-球蛋白沿柱壁缓缓加入柱内，打开流出口，让样品进入柱床（勿使空气进入）。立即用滴管向柱内沿管壁加入PB至高出柱面2cm，接通洗脱瓶，调整流速至1.5mL/min，按每管1.5mL连续收集，出现白色沉淀者，核酸蛋白检测仪检测出蛋白后，即含有纯的IgG，继续收集，直至无蛋白流出，直至不发生白色沉淀反应时为止，合并蛋白管，取500L编号，置冰箱保存，用于第三个

45、实验。（四）免疫球蛋白G纯度的鉴定免疫球蛋白G纯度的鉴定办法很多，最常用的是电泳。免疫电泳、凝胶电泳等都可。可溶性糖的硅胶G薄层层析一、实验原理植物组织中的可溶性糖可用一定浓度的乙醇提取出来。经去杂质手续，除去糖提取液中的蛋白质等干扰测糖的物质，获得较纯的可溶性糖混合液。糖为多羟基化合物，具有较强的极性，在硅胶G薄层层析上展层时，与硅胶分子间有一定吸附力。各种糖羟基多少不同，造成吸附力的差异。该吸附力的大小顺序为：三糖二糖己糖戊糖。根据吸附层析原理，极性不同的糖在硅胶G薄层上展层时，具有不同的Rf值。极性越大，Rf值越小。与已知标准糖Rf值比较，可分离鉴定植物样品提取液中糖的种类。二、材料、仪

46、器和试剂1.材料 苹果或其他植物材料。2.仪器 （1）离心机及大离心管；（2）台秤；（3）研钵；（4）蒸发皿或培养皿；（5）恒温水浴；（6）微量点样器或毛细管；（7）层析缸；（8）吹风机；（9）玻璃板（15cm7cm）；（10）涂布器；（11）烘箱；（12）喷雾器。3.试剂 （1）95%乙醇；（2）80%乙醇；（3）10% Pb（Ac）2；（4）饱和Na2SO4；（5）氯仿；（6）冰乙酸；（7）1%标准糖溶液（10mg/ml）：木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖；（8）苯胺-二苯胺-磷酸显色剂（显色原理，现用现配）：2g二苯胺，加2ml苯胺，10ml 85%磷酸，1ml浓HCl，100ml丙酮溶后摇匀。

47、三、操作步骤1.硅胶G薄板的制备 称取硅胶G粉3g，加0.1mol/L 硼酸溶液9ml，于研钵中充分研磨，待硅胶G开始变稠时，倾入涂布器中，可铺15m7cm薄板两块。铺层后的薄板放在100烘箱中烘干，取出后放在干燥器中备用；也可在室温下烘干过夜，用前与110烘箱中活化1h，立即使用。2.苹果中可溶性糖提取液的制备 取洗净的苹果，削皮，称10g果肉，在研钵中将果肉磨成匀浆，用20ml 95%乙醇分数次洗入大离心管中，浸提30min，3000rpm离心10min,上清液倾入另一大离心管中，残渣加5ml 80%乙醇洗涤，离心，取上清液，重复二次合并上清液，于70水浴上预热上清液，趁热逐滴加入10%中

48、性醋酸铅溶液，以沉淀蛋白质，然后再逐滴加入饱和硫酸钠沉淀多余的铅（尝试100，10min，不加PbAc2，直接使蛋白变性），30000r/min离心10min。倾出上清液，于70水浴上蒸干，析出物质以2ml蒸馏水溶解，即得糖抽提液。如果蛋白质含量不高，也可省去此步，但要通过预试决定。3.苹果提取液中可溶性糖的分离鉴定 取活化过的硅胶G玻板一块。在距离底边1.5cm水平线上确定5个点，相互间隔1cm，其中4个点分别点上1%的木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖标准溶液各3l或适量，另一个点点上苹果提取液26l或适量。以氯仿+冰乙酸+水=30+35+5为展层剂进行层析。当前沿达距薄层顶端1cm处，停止层析，取

49、出玻板以吹风机吹干（可以？）。然后以苯胺-二苯胺-磷酸喷雾（注意，千万不要直接对着喷，为什么？），于85烘箱中烘10min，各种糖即显示出不同颜色（为什么）。与标准糖比较，根据色斑颜色及Rf值即可鉴定出苹果提取液中所存在的可溶性糖类。第四编 鉴定方法第六章 电泳 电泳：是带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。第一节 电泳总论电泳三大类：显微电泳、自由界面电泳、区带电泳 影响带电粒子的泳动速度的因素1. 颗粒的理化性质：静电荷量，直径，形状，在电场中涌动的速度就越快，反之则越慢。2. 电场强度：电场强度，涌动速度，反之越慢。3.溶液的性质： PH：PH离等电点越远，则其静电荷量

50、就越大，涌动速度就越快。 离子强度：一般在0.020.2时适中，离子强度过高，涌动速度下降；离子强度过低，也会影响涌动速度。 溶液黏度：泳动速度与黏度成反比。4.电渗： 颗粒涌动方向与电渗方向一致，涌动速度增加；颗粒涌动方向与电渗方向相反，涌动速度降低。 当电场力等于或小于电渗力时，颗粒涌动速度为零或向相反方向运动。5.焦耳热：Q=IRt离子强度，电流强度，产热，对介质和装置有一定影响，从而改变涌动速度。6.筛孔：筛孔大，涌动速度快。筛孔小，涌动速度慢。第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳一PAGE的优点： 孔径大小可调节，对所有蛋白质、肽都有分子筛效应 机械强度好、弹性大 电渗力低 分辨率高 易于重复

51、二. 聚合方法1. 光聚合 催化（引发）剂 核黄素 适合大孔胶2. 化学聚合 催化（引发）剂 过硫酸铵 适合小孔胶 三.不连续凝胶电泳与连续性凝胶电泳1.连续与不连续的区别：PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类： 前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应。 后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更好。2.不连续性的表现： 胶层不连续浓缩胶：不考虑分子筛效应，有浓缩效应，PH=6.7-6.8分离胶：不考虑浓缩效应，有分子筛效

52、应和电荷效应。PH=8.8 离子成分不连续 电位梯度不连续 PH不连续3. 分离效应 分子筛效应：当大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，由于受阻滞的程度不同从而表现出不同迁移率的现象。 电荷效应：各种蛋白质高度浓缩、堆叠于高浓度的区域内，它们按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一条条的区带。4. 操作不连续垂直板PAGE： 胶板模具的装配： 制备凝胶： 加样： 电泳： 样品固定、染色、脱色第三节 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳之SDSPAGE 一.基本原理1.SDS与巯基乙醇作用 SDS作用：是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质的疏水部分，形成SDS

53、-蛋白质复合物。 巯基乙醇作用：打开二硫键，避免重新氧化。2. 亚基的变化： 电荷变化：亚基表面被SDS覆盖，使各种蛋白质都带上相同密度的负电荷，其电荷量远远超过了蛋白质原来的电荷，从而掩盖了不同蛋白质分子原有的电荷差别。 形状变化：任何形状蛋白均变为较松散的两端椭圆的棒状结构，其宽度基本相同，其长度则与分子质量成正比。所以，各种蛋白质的迁移率不再受电荷量和形状的影响，而只与其分子量有关。三 具体操作1.装置电泳系统2.电泳步骤 仪器的组装；试剂的调配。（eg： Tris-HCl缓冲液， 30%Acr-0.8%Bis储备液等） 制备分离胶：凝胶浓度（T）是根据待测样品的分子质量大小来决定。样品

54、分子质量：35020KDa：T=5%10010KDa：T=10%Tris-HCl缓冲液的配置，Acr：Bis=29：:1（30%Acr-0.8%Bis储备液）3.制备浓缩胶浓缩胶配好后要快速充分摇匀，并插入梳子，待其聚合凝固。4.加样5.电泳条件：电极液为0.1%SDS-0.15（或0.005）mol/L Tris-Gly缓冲液（PH8.3），电压为100V，电泳时间2h左右。（凝胶柱浓度10%）6.固定与染色电泳完毕的凝胶柱在20%磺基水杨酸或10%三氯乙酸溶液浸泡过夜，然后用0.02%0.05%考马斯亮蓝溶液染色20min，取出后脱色2-3次，每次1小时。第三节 应用实例小牛血清蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳一、实验目的1. 学习电泳技术的基本原理，掌握电泳实验技术的操作。2. 提高学生的实验操作能力和创新能力。二、实验原理（一） 概述 电泳(Electr