第5章农药残留测定方法

1、第五章 农药残留测定方法5.1 5.1 气相色谱法气相色谱法5.2 5.2 高效液相色谱法高效液相色谱法5.3 5.3 高效薄层色谱法高效薄层色谱法5.4 5.4 色谱色谱- -质谱联用技术质谱联用技术5.1 气相色谱法（1）气相色谱法基本术语 色谱图：响应信号时间or响应信号载气流出体积 基线：仅载气载气通过时检测器所产生的响应信号曲线 色谱峰：色谱柱流出组分组分通过检测器时所产生的响应信号曲线 峰底：峰起点与终点之间连接的直线 峰高：色谱峰最高点到峰底的距离 峰宽：峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离 半高峰宽：峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点间的距离 峰面积（A

2、）：峰与峰底之间的面积（1）气相色谱法基本术语 死时间tr0：不被固定相吸附或溶解的组分（如空气）从进样到出现峰最大值之间的时间。 保留时间tr：组分从进样到出现峰最大值时所经过的时间。 调整保留时间tr ：某组分的保留时间扣除死时间。p tr= tr - tr0 相对保留值：两组分调整保留时间的比值，通常作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。p 12rrtt例题 由以上气相色谱图及数据，求组分1和2的调整保留时间tr1和 tr2，并计算选择因子 的值。（2）气相色谱法的分配原理 气相色谱分析的关键是物质的分离问题。怎样实现两物质色谱峰的完全分离？ 分配系数K 分配比k，又称为容量因子，组

3、分在两相间分配平衡时，固定相和流动相中的组分的质量比，即（2）气相色谱法的分配原理0rrmsttkmmk时间组分在流动相中的滞留时间组分在固定相中的滞留组分在流动相中的质量组分在固定相中的质量另可证明得出塔板理论的假设a. 在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡，这一小段柱长称为理论塔板理论塔板高度高度H；b. 载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积；c. 所有组分开始时都集中于0号板上，而且组分的纵向扩散可忽略；d. 分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。（3）塔板理论 在N为8和9时，组分从具有5块塔板的柱中洗脱出来达到最大浓度。流出

4、曲线呈峰形，由于柱子的塔板数太少，峰形不对称。当塔板数n50时，就可以得到对称的峰形曲线。在GC中，一般n值很大，约103106，因而流出曲线可趋于正态分布。理论塔板数塔板理论222222154. 51654. 516 kknttnnnnnLHwtwtnnLHwtwtnrreffeffeffeffhrbreffhrbr的关系：与有效塔板高度有效塔板数理论塔板高度理论塔板数n越大或H越小，则柱效越高。理论塔板数与选择因子、分离度的关系p 选择因子是固定液对两个相邻组分的调整保留时间之比。 越大，两组分越易分离。柱温降低柱温降低， 增大，有利于分离和柱效率的提高。p 分离度R定义为两个相邻组分的保

5、留值之差与其平均峰宽值之比。R值越大，分离越好。R=1时，两峰重叠约2%。通常降低柱温，增加柱长降低柱温，增加柱长，使两峰间距增大，R提高，但又会使峰加宽，因此需进行最优化选择。（3）塔板理论12rrtt2112211222/bbrrbbrrwwttwwttR理论塔板数与选择因子、分离度的关系p理论塔板数n与选择因子 、分离度R的关系：（3）塔板理论222221116116 kkRnRneff 范弟姆特（Van Deemter）速率理论： 塔板高度H-载气线速度u关系 H = A + B/u + Cu（4）速率理论及影响柱效率的因素涡流扩散项分子扩散项传质阻力项 柱长柱长：柱长可使理论塔板数n

6、 ，但峰宽，分析时间。 柱径柱径：柱径小利于减少组分在柱内的分子扩散，提高柱效，但柱径太小不利操作。填充柱的柱内径23mm为宜。 载气及流速载气及流速： H = A + B/u + Cu 柱温柱温：需综合考虑。农药多残留等多组分的分析通常采用程序升温的办法解决。 担体担体：粒度细小、装填均匀有利于减小涡流扩散项、提高柱效。一般粒度直径为柱内径的1/201/25为宜。 气化温度气化温度：应高于各组分最高沸点，保证瞬间气化。 样品进样量样品进样量：不宜过大，进样量超过柱负荷，会降低柱效，色谱峰变宽。（5）操作条件的选择GC检测器 检测器是测量柱后流出物质成分和浓度变化的装置，通过化学和物理作用，将

7、流出物质成分和浓度的变化转换为电信号。浓度型检测器浓度型检测器热导检测器热导检测器电子捕获检测器电子捕获检测器质量型检测器质量型检测器氢火焰离子化检测器氢火焰离子化检测器火焰光度检测器火焰光度检测器氮磷检测器氮磷检测器热导检测器（热导检测器（TCD）浓度型检测器通用型检测器，对有机物和无机物都有响应不破坏样品，可收集馏分 缺点：灵敏度较低缺点：灵敏度较低p 原理：载气中混入其他气态物质时热导率发生变化。 载气中无组分时，平衡电桥，无电压信号输出，记录仪走直线（基线）。 载气携带试样组分时，电桥失去平衡，有电压信号输出，记录仪记录组分浓度随时间变化的峰状图形。氢火焰离子化检测器（氢火焰离子化检测

8、器（FID）质量型检测器选择型检测器，对大多数有机化合物有响应，对永久性气体及H2S、H2O、NH3、CS2等在火焰中不电离的无机物无响应灵敏度比热导检测器高几个数量级，可检测ppb（10-3ppm）级的痕量物质 缺点：破坏样品，对无机物无响应缺点：破坏样品，对无机物无响应p 原理：色谱柱流出物中可燃烧 有机物在氢-氧火焰中发生电离。 有机物CnHm在火焰中发生化学 电离： 化学电离产生的正离子（CHO+与H3O+）和电子（e）在外加恒定直流电场作用下分别向两极定向移动而产生微电流（10-710-14A）。微电流单位时间进入离子室的被测组分质量。COOHOH6CHOeCHOOCHCHHC322

9、mn（自由基）定性与定量分析p 定性分析的主要依据保留值 利用已知物直接对照定性 如果样品比较复杂，可在未知混合物中加入已知纯物质，通过未知物中峰的变化，来确定未知物中成分。定性与定量分析p 定量分析的依据色谱峰的峰高或峰面积 外标法：直接对比法和标准曲线法例：例：已知敌敌畏标准样品数据如下表所示，另实验测得敌敌畏的标准曲线为y=2304.0 x-7.477，r=0.9999，分别用直接对比法和标准曲线法，计算样品中的敌敌畏含量。敌敌畏敌敌畏含量（含量（mg/L）峰面积峰面积标准物0.050110.723样品x150.509定性与定量分析p定量分析的依据在一定操作条件下，分析组分的质量（mi）

10、或其在载气中的浓度（Ci）与检测器的响应信号（色谱峰的峰高hi或峰面积Ai）成正比： mi = f i Ai 定量校正因子f i = mi /Ai（单位面积的组分含量） 由于f i受操作条件影响较大，测定比较困难，因此在实际工作中都使用相对校正因子fi ： 常用的标准物质：热导池是苯，氢火焰是正庚烷。ississiisiiAmAmAmAmfff定性与定量分析p定量分析 内标法内标法：在试样中加入能与所有组分完全分离的已知量的内标物质，根据被测物和内标物的质量及其在色谱图上相应的峰面积求出某组分的含量。 内标法要求：内标物为样品中不存在，且内标与其他组分可完全分离；内标峰与被测组分峰要靠近，内标

11、量也要接近被测组分含量，最少取三位有效数字。 内标法优点是，定量准确，可以抵消操作条件变化所产生的误差；弥补了归一化法使用限制上的不足。缺点是，每次分析需要用分析天平准确称量，不太方便。例题 有一试样含甲酸、乙酸、丙酸及不少水、苯等物质，称取此试样1.055g，以环己酮作内标，称取0.1907g环己酮加到试样中混合均匀后，吸取3L进样，得到色谱图。从色谱图上测得的各组分峰面积及已知的fi如下表所示，求甲酸、乙酸、丙酸的百分含量。甲酸甲酸乙酸乙酸环己酮环己酮丙酸丙酸峰面积峰面积14.872.613342.4相对校正因子相对校正因子fi3.831.781.001.07定性与定量分析p定量分析 归一

12、化法归一化法：样品中的所有组分全部流出色谱柱，并在色谱图上都出现色谱峰，可以通过各组分的校正因子和峰面积计算各组分的含量。%100%100%100%111niiiiiniiiiiniiiiAACffAfAmmC值相近，则：若各组分的例题 已知大米中多种有机磷农药残留色谱图，经测定各组分的值和峰面积如下表所示，用归一化法计算在大米的有机磷农药残留中各组分所占的比例。敌敌畏敌敌畏 乐果乐果 甲基对硫磷甲基对硫磷杀螟硫磷杀螟硫磷对硫磷对硫磷 三唑磷三唑磷Ai342142787725047.3fi0.840.741.001.051.281.365.2 高效液相色谱法p 输液系统 流动相在转入贮液器前必

13、须过滤和脱气 梯度洗脱装置：将两种或两种以上的不同极性的溶剂进行混合，作为流动相使用。p 进样系统 手动六通进样阀：10、20、50、100L定量环 自动进样器p 分离系统色谱仪的核心部分 保护柱起到保护分析柱作用，固体微粒、污染物首先被保护住挡住。p 检测系统 将物理或化学特性转变为可处理的电信号p 控制和数据处理系统 由计算机和数据处理软件组成HPLC常用检测器p紫外-可见光检测器（UV-VIS） 浓度型的选择性检测器 液相色谱应用最广泛的检测器 具有紫外吸收能力的物质 缺点：对紫外无吸收的物质无响应，对紫外有吸收的溶剂（如苯）不能用作流动相。p紫外-可见光检测器（UV-VIS） 光源光源

14、：氘灯（紫外光源）195400nm 钨灯（可见光源）400850nm 透镜透镜：将光源射来的光束变为平行光 遮光板遮光板：将平行光变为细小平行光束 测量池测量池：通流动相+检测样品 参比池参比池：通参比品（多为空气） 滤光片滤光片：滤去非单色光 光电倍增管光电倍增管：接收信号5.3 薄层色谱法 薄层色谱法（Thin-Layer Chromatography, TLC） TLC是在平面上进行分离的一种方法，又叫平面色谱法，采用液体作为流动相，属于液相色谱的范畴。 按其固定相的性质和分离机理可分为： 吸附薄层法 分配薄层法 离子交换薄层法 凝胶薄层法应用较为广泛p吸附薄层法的原理吸附薄层法的原理

15、将吸附剂（固定相）均匀地涂布在玻璃、金属等载板上形成薄层，在薄层的一端点上试样溶液，置于展开室中，将薄层的下端浸入合适的展开剂（流动相），借毛细作用使溶剂上升。试样组分不断地被吸附剂吸附，又被溶剂溶解解吸，随展开剂向前移动，由于吸附剂对不同组分有不同的吸附能力，展开剂也有不同的解吸能力，因此在流动相向前移动的过程中，不同组分移动的距离不同，从而得到分离。 薄层分离是被分离物质（样品）、吸附剂（固定相）及展开剂（流动相）共同作用的结果。薄层制备点样展开定位 定性 定量薄层板的制备 玻璃板需光洁，否则吸附剂易脱落，大小由需求决定。p 软板：吸附剂直接干法涂层p 硬板：吸附剂加黏合剂后湿法涂层 吸附

16、剂（固定相）：90%以上的分离都可应用硅胶 常用黏合剂：煅石膏（煅石膏（CaSOCaSO4 41/2H1/2H2 2O O）机械强度差，易脱落，但不易腐蚀羧甲基纤维素钠（羧甲基纤维素钠（CMC-NaCMC-Na）机械强度好，不易脱落，但易腐蚀点样 在薄层色谱技术中，点样是造成定量误差的主要来源。p 样品溶液的制备：将样品中的残留农药定量地提取出来，配制成一定浓度的样品溶液，常用溶剂为甲醇及乙醇。点样后必须将溶剂全部除去后再进行展开。p 点样技术点状点样和带状点样，点样体积和点样量不宜过大，否则容易造成远点“超载”，展开剂产生“绕行”现象，使斑点拖尾或重叠。点样基线距底边2.0cm，样点直径24

17、mm，点间距离1.52.0cm展开 点样后的薄层需置密闭并加有展开剂的展开室中进行展开。 展开剂渗过薄层板的固定相，借毛细管作用力毛细管作用力的影响，样品与展开剂及固定相之间相互作用，使样品中各成分沿展开剂流动的方向分开。定性分析p斑点的比移值（Rf） 比移值是溶质移动距离与流动相移动距离之比，是薄层色谱的基本定性参数。 根据图中所给数据，分别计算物质A 和物质B的Rf值。 Rf =0， Rf =1分别表示？的距离原点中心至流动相前沿心的距离原点中心至组分斑点中fR定量分析p 间接定量（洗脱测定法） 取下斑点用溶剂洗脱化合物收集洗脱液分析测定。p 直接定量（原位薄层扫描法） 用薄层色谱扫描仪（

18、或薄层色谱光密度计）对薄层上被分离物质进行直接定量的方法。 基本测定原理：用一束具有一定波长和强度的光照射到薄层斑点上进行整个斑点的扫描，用仪器测量通过斑点或被测量通过斑点或被斑点反射的光束强度的变化斑点反射的光束强度的变化从而达到定量的目的。5.4 色谱-质谱联用技术 质谱：化合物分子经电离后，形成具有不同质荷比（m/z）的离子，在质量分析器的作用下按照其m/z大小分开，到检测器被检测记录下来而形成的谱图。进样系统离子源质量分析器离子检测器数据记录分析系统真空系统质谱仪的基本结构质谱仪的基本结构质谱（MS） 进样系统进样系统：气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）和直接进样都可以作为MS的进样系统。 离子源离子源：使气态分子电离成离子的装置，MS的心脏。 质量分析器质量分析器：将经过电离加速的离子束按不同m/z分离，MS的分离系统。 离子检测器离子检测器：离子源产生的离子经过质量分析器被分离后到达接收检测系统。p采用质谱法对农药进行分析，通常可以提供如下信息：该农药的相对分子量、分子式、分子结构。气相色谱气相色谱-质谱联用仪质谱联用仪GC-MS液相色谱液相色谱-质谱联用仪