第四章工业发酵灭菌1

1、 工业发酵灭菌工业发酵灭菌 n知识目标知识目标 理解工业发酵常用灭菌方法的原理和适用范围理解工业发酵常用灭菌方法的原理和适用范围 掌握工业发酵培养基和发酵设备灭菌工艺的选择掌握工业发酵培养基和发酵设备灭菌工艺的选择 掌握无菌空气制备的基本知识和典型工艺要求掌握无菌空气制备的基本知识和典型工艺要求n一、热灭菌法一、热灭菌法n1 1、火焰灭菌法、火焰灭菌法 直接在火焰上灼烧灭菌，如接种针和直接在火焰上灼烧灭菌，如接种针和一些金属小工具、试管口、三角瓶口等灭一些金属小工具、试管口、三角瓶口等灭菌采用这种方法，该方法简单有效，但局菌采用这种方法，该方法简单有效，但局限性很大。限性很大。湿热灭菌法湿热灭

2、菌法n煮沸灭菌法煮沸灭菌法 将要消毒的物品放入水中煮沸将要消毒的物品放入水中煮沸（100）1520min，一般微生物的营养细胞都可以杀死，但，一般微生物的营养细胞都可以杀死，但不能杀死芽孢。不能杀死芽孢。n巴氏消毒法巴氏消毒法 法国微生物学家、化学家巴斯德首创的低温法国微生物学家、化学家巴斯德首创的低温消毒法。加热到消毒法。加热到6262，经过，经过3030分钟，以杀死不耐分钟，以杀死不耐高温的物质中的微生物和病原体的消毒法。高温的物质中的微生物和病原体的消毒法。 牛奶、啤酒、黄酒、酱油和醋等用此法消毒。牛奶、啤酒、黄酒、酱油和醋等用此法消毒。湿热灭菌法湿热灭菌法n间歇灭菌法间歇灭菌法 反复几

3、次的常压蒸汽灭菌，以达到杀死微反复几次的常压蒸汽灭菌，以达到杀死微生物营养体和芽孢的目的。生物营养体和芽孢的目的。 操作步骤：操作步骤：100，30-60min；37，1d；同上重复三次同上重复三次 适用于不宜高压灭菌的物质，如糖类明胶适用于不宜高压灭菌的物质，如糖类明胶牛奶培养基。牛奶培养基。 方法简单，但却麻烦；工作周期长。方法简单，但却麻烦；工作周期长。 湿热灭菌法湿热灭菌法n高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法 使用密闭的高压蒸汽灭菌锅，使灭菌锅使用密闭的高压蒸汽灭菌锅，使灭菌锅内蒸汽不外溢，增加压力，由于压力的增内蒸汽不外溢，增加压力，由于压力的增高，温度也随之增高，从而提高杀菌力，高，温度

4、也随之增高，从而提高杀菌力，缩短灭菌时间。缩短灭菌时间。n最有效而广泛应用的灭菌方法最有效而广泛应用的灭菌方法n实验室常用的是实验室常用的是0.1mpa，121，1530minn应用范围应用范围 培养基，水，发酵罐等其他不适培养基，水，发酵罐等其他不适合干热灭菌的物品。合干热灭菌的物品。n高压蒸汽灭菌法的注意事项：高压蒸汽灭菌法的注意事项：1.完全排除锅内冷空气完全排除锅内冷空气2.灭菌完毕后要缓慢减压灭菌完毕后要缓慢减压3.压力降为零后打开盖子压力降为零后打开盖子四、臭氧灭菌四、臭氧灭菌n利用臭氧的氧化作用杀死微生物细胞。利用臭氧的氧化作用杀死微生物细胞。n氧化分解葡萄糖所必需的酶，从而直接

5、氧化分解葡萄糖所必需的酶，从而直接破坏其细胞膜，从而将细菌杀死。破坏其细胞膜，从而将细菌杀死。n无污染消毒剂无污染消毒剂n对细菌、霉菌等杀菌效果好对细菌、霉菌等杀菌效果好n安全，杀菌效果明显，安装灵活等特点安全，杀菌效果明显，安装灵活等特点n用于洁净室、净化设备的消毒。用于洁净室、净化设备的消毒。表表 3 3- -6 6 各各种种灭灭菌菌方方法法的的特特点点及及适适用用范范围围 灭菌方法 原理及条件 特点 适用范围 火焰灭菌法 利用火焰直接把微生物杀死。 方法简单、 灭菌彻底、但适用范围有限。 适用于接种针、玻璃棒、试管口、三角瓶口等灭菌 干热灭菌法 利用热空气将微生物体内的蛋白质氧化进行灭菌

6、 灭菌后物料可保持干燥，方法简单，但灭菌效果不如湿热灭菌 适用于金属或玻璃器皿的灭菌。 湿热灭菌法 利用高温蒸汽将物料的温度升高使微生物体内的蛋白质变性进行灭菌 蒸汽来源容易、潜热大、穿透力强、灭菌效果好、 操作费用低、有经济快速的特点 广泛应用于生产设备及培养基的灭菌。 射线灭菌法 用射线穿透微生物细胞进行灭菌 使用方便，但穿透能力较差，适用范围有限 一 般 只 适 用 于 无 菌室，无菌箱摇瓶间和器皿表面的消毒 化学式剂灭菌法 利用化学试剂对微生物的氧化作用或损伤细胞等进行灭菌 使用方法较广，可用于无法用加热方法进行灭菌的物品 常用于环境空气的灭菌及一些表面的灭菌 过滤除菌法 利用过滤介质

7、将微生物菌体细胞过滤进行除菌 不改变物性而达到灭菌目的，设备要求高 常用于生产中空气的净化除菌，少数用于容易被热破坏的培养基的灭菌 第二节第二节 培养基和发酵设备的湿热灭菌培养基和发酵设备的湿热灭菌n一、灭菌条件的选择一、灭菌条件的选择 选择的原则：达到灭菌的目的，同时选择的原则：达到灭菌的目的，同时使培养基成分破坏减至最小。使培养基成分破坏减至最小。1、灭菌温度和灭菌时间的选择灭菌温度和灭菌时间的选择 为什么选择为什么选择高温快速高温快速灭菌？灭菌？ 温度升高，反应速率升高，温度升高，反应速率升高，微生物死亡速微生物死亡速率远大于营养成分的的破坏速率率远大于营养成分的的破坏速率灭菌程度与灭菌

8、时间的影响灭菌程度与灭菌时间的影响 微生物的热死规律微生物的热死规律对数残留定律对数残留定律n灭菌程度与灭菌时间的灭菌程度与灭菌时间的影响影响 微生物的热死规律微生物的热死规律对数对数残留定律残留定律n微生物受热死亡的主要原因是高微生物受热死亡的主要原因是高热能使蛋白质变性，这种反应可热能使蛋白质变性，这种反应可认为是单分子反应，死亡速率可认为是单分子反应，死亡速率可视为一级反应，即与残存的微生视为一级反应，即与残存的微生物数量成正比。物数量成正比。ktennttnnkndtdn000,积分得：初始条件：式中式中 n经时间经时间t后残存的活菌浓度（个后残存的活菌浓度（个/l)， n0开始灭菌时

9、原有活菌浓度（个开始灭菌时原有活菌浓度（个/l)；t灭菌时间（灭菌时间（s,min）k灭菌速率常数或比死亡速率常数（灭菌速率常数或比死亡速率常数（s-1,min-1）它的大小与微生物的它的大小与微生物的种类种类和加热和加热温度温度有关。在同等有关。在同等温度下，其值小，微生物的耐热性强。温度下，其值小，微生物的耐热性强。从上式得出：从上式得出：t, n之间的关系为对数之间的关系为对数式中式中n/n0菌体存活率，而菌体存活率，而n0/n为灭菌度。为灭菌度。t=（2.303/k）(n0/ n)二、培养基的灭菌方法二、培养基的灭菌方法n缺点缺点 不适用于黏度大或固形物含量高的培不适用于黏度大或固形物

10、含量高的培养基的灭菌；增加了一套连续灭菌设备，养基的灭菌；增加了一套连续灭菌设备，增加了操作环节，增加了染菌的概率。增加了操作环节，增加了染菌的概率。n按设备和工艺条件分按设备和工艺条件分 （1）蒸汽直接加热）蒸汽直接加热 （2）蒸汽间接加热）蒸汽间接加热1、蒸汽直接加热连续灭菌系统、蒸汽直接加热连续灭菌系统 定义：定义：蒸汽通入培养基中，蒸汽通入培养基中，快速加热至杀菌快速加热至杀菌温度，维持一段时间，后冷却至发酵温度的过温度，维持一段时间，后冷却至发酵温度的过程。分两种形式：程。分两种形式：（1）由连消塔、维持罐和冷却器组成）由连消塔、维持罐和冷却器组成配料罐将培养基预热配料罐将培养基预热

11、60-70，防止培养基在杀菌时，防止培养基在杀菌时料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。连消塔使培养基迅速连消塔使培养基迅速(20s)升温升温(126-132)。维持罐：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间。维持罐：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间。2-7min.冷却管：将培养基迅速冷却到冷却管：将培养基迅速冷却到40-50 ，输送到灭菌，输送到灭菌后的发酵罐内后的发酵罐内（2 2）喷射加热连续灭菌流程）喷射加热连续灭菌流程由喷射加热、维持罐和真空冷却器组成的连续由喷射加热、维持罐和真空冷却器组成的连续灭菌系统。灭菌系统。蒸汽直接喷入待灭菌的培养液

12、，培养液急剧升蒸汽直接喷入待灭菌的培养液，培养液急剧升温到预定的灭菌温度，培养基在该温度送入维温到预定的灭菌温度，培养基在该温度送入维持管维持一段时间后，通过一膨胀阀进入真空持管维持一段时间后，通过一膨胀阀进入真空冷却器冷却。冷却器冷却。保证培养基先进先出，避免过热或者灭菌不彻保证培养基先进先出，避免过热或者灭菌不彻底底升温快、营养损失小升温快、营养损失小随着蒸汽的冷凝使培养基稀释随着蒸汽的冷凝使培养基稀释2 2、蒸汽间接加热连续灭菌系统、蒸汽间接加热连续灭菌系统n蒸汽不直接与培养基接触，而是通过热交换器蒸汽不直接与培养基接触，而是通过热交换器对培养基进行加热。对培养基进行加热。n热交换器有板

13、式和螺旋板式两种热交换器有板式和螺旋板式两种n螺旋板式交换器的特点：流道宽，流速快，可螺旋板式交换器的特点：流道宽，流速快，可减少热交换器表面结垢现象。适用于含有固行减少热交换器表面结垢现象。适用于含有固行悬浮物的培养基的灭菌。悬浮物的培养基的灭菌。n板式交换器的特点：适用于含有少量固行悬浮板式交换器的特点：适用于含有少量固行悬浮物的培养基的灭菌。物的培养基的灭菌。温度随时间的变化温度随时间的变化连续灭菌与分批灭菌的比较与选择连续灭菌与分批灭菌的比较与选择分批灭菌分批灭菌优点：优点：1.1.不需附加设备不需附加设备2.2.蒸汽利用率高蒸汽利用率高3.3.节约劳动力节约劳动力 缺点缺点1.1.培养基质量差培养基质量差2.2.罐的利用率低罐的利用率低3.3.冷却水用量大冷却水用量大连续灭菌连续灭菌优点：优点：1.1.采用高温快速灭菌法采用高温快速灭菌法2.2.可以把培养基按其性可以把培养基按其性质分开灭菌质分开灭菌3.3.有利于自动控制有利于自动控制4.4.节省冷却水节省冷却水缺点缺点1.1.投资费用高投资费用高2.2.对物料要求高对物料要求高3.3.蒸汽用量大蒸汽用量大三、发酵设备灭菌三、发酵设备灭菌n实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌n连续灭菌时，发酵罐、种子罐等要先进行