核酸的研究方法1ppt课件

1、第第1515章章核酸的研讨方法核酸的研讨方法 制备天然核酸必需采用温暖的条件，制备天然核酸必需采用温暖的条件，防止过酸、过碱，防止猛烈搅拌，尤其防止过酸、过碱，防止猛烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分别、提纯和定量测定一、核酸的分别、提纯和定量测定真核真核DNADNA以核蛋白以核蛋白DNPDNP方式存在，方式存在，DNPDNP溶于水或高盐溶液溶于水或高盐溶液1mol/L 1mol/L N a C lN a C l ， 但 不 溶 于 低 盐 溶 液 ， 但 不 溶 于 低 盐 溶 液0.14mol/L NaCl0.14mol/L NaCl去除蛋白质：水饱和

2、酚，氯仿异戊去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。醇。DNADNA沉淀：沉淀：0.3M NaAC-70%0.3M NaAC-70%乙醇乙醇一一DNA分别纯化分别纯化制备制备RNARNA时，最重要的是使时，最重要的是使RNaseRNase灭活：灭活：一切容器都要经过高温处置，不能高温高一切容器都要经过高温处置，不能高温高压的用压的用0.10.1焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯DEPCDEPC处置。处置。参与强变性剂如胍盐使参与强变性剂如胍盐使RNaseRNase失活；失活；在在RNARNA的反响体系内参与的反响体系内参与RNaseRNase的抑制剂的抑制剂如如RNasin)RNasin)二二RNA的分别的分

3、别三核酸含量的测定三核酸含量的测定2、定糖法、定糖法 RNA：核糖：核糖 糠醛糠醛 绿色物质绿色物质670-680nm DNA：脱氧核糖：脱氧核糖+二苯胺二苯胺兰色物质兰色物质595-620nm苔黑酚/地衣酚浓HCl浓硫酸1、紫外吸收法、紫外吸收法1个个A50g/ml 双链双链DNA 40g/ml RNA或单链或单链DNA3、定磷法、定磷法 核酸含磷量为核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于磷相当于10.5g核酸核酸4、琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭能插入溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间构成复合物分子的碱基对间构成复合物在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光

4、强度与荧光强度与DNA含量成正比含量成正比纯纯DNA DNA 比值比值1.81.8， 1.8 Pr1.8 Pr、苯酚污染、苯酚污染纯纯RNA RNA 比值比值2.02.0， 2.0 DNA 2.0 DNA、 PrPr、苯酚污染、苯酚污染四、核酸纯度的测定OD260OD280二、核酸的沉降特性与超速离心二、核酸的沉降特性与超速离心 不同构象的核酸线形、不同构象的核酸线形、环形、超螺旋，密度和沉环形、超螺旋，密度和沉降速率不同，用密度梯度离降速率不同，用密度梯度离心可以将不同构象心可以将不同构象DNADNA、RNARNA与蛋白质区分开来与蛋白质区分开来8M CsCl，45000rpm，16h密度梯

5、度：密度梯度：1.80g/ml1.55g/ml平衡时：浮力密度平衡时：浮力密度=CsCl密度密度=离心力离心力=0 +4.22r2 - r02 10-10 ：浮力密度：浮力密度 ：角速度弧度：角速度弧度/秒秒r：样品到转轴的间隔：样品到转轴的间隔一核酸密度的测定G-C含量与含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系的浮力密度之间呈正比关系=0.1 xG-C + 1.658xG-C =-1.658 10 二测定二测定DNADNA的的G-CG-C含量含量RNADNA变性变性DNA双链双链DNA 蛋白质，蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大变性程度越大，浮力密度越大三研讨核酸的构象三研讨核酸的构象四用于核酸

6、的制备四用于核酸的制备超螺旋超螺旋DNADNA或或用于大片段用于大片段DNA的分别，精度低，但的分别，精度低，但分别范围广。分别范围广。三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳一琼脂糖凝胶电泳一琼脂糖凝胶电泳用于小片段用于小片段DNA的分析的分析相对分子质量小于相对分子质量小于1000bp的的DNA片片断和断和RNA的电泳。的电泳。PAGE中普通不含中普通不含RNase，用于，用于RNA分析时不会分解样品。分析时不会分解样品。二聚丙烯酰胺凝胶电泳二聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGEPAGE一一DNADNA的酶法测定的酶法测定四、核酸的核苷酸序列测定四、核酸的核苷酸序列测定英国英国 SangerSanger

7、1955 1955 确定牛胰岛素构造，确定牛胰岛素构造，1958 1958 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖1975 1975 设计出设计出DNADNA测序法，测序法，1980 1980 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖合成一段与待测合成一段与待测DNADNA序列互补的序列互补的DNADNA片段群。片段群。 末端终止法末端终止法Sanger2，3双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸ddNTP是是DNA合成链延伸的抑合成链延伸的抑制剂。制剂。MOV : MCB4.0Dideoxy sequencing of DNADNA序列分析仪：序列分析仪：四色荧光基团标志的四色荧光基团标志的dNTP二二DNADNA的化

8、学法测序：的化学法测序： 由由MaxamMaxam和和GilbertGilbert所发明。所发明。 其根本原理是用特异的化学试剂作用于其根本原理是用特异的化学试剂作用于DNADNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反响碱基分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反响碱基的多核苷酸链。用的多核苷酸链。用4 4组不同的特异反响，可使末组不同的特异反响，可使末端标志的端标志的DNADNA分子切成不同长度的片断，其末端分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱影得到测序图谱 4 4组特异的反响如下：组特异的反响如下：1 1G G反

9、响：用硫酸二甲酯反响：用硫酸二甲酯DMSDMS使鸟嘌呤上的使鸟嘌呤上的N7N7原子甲原子甲基化，加热引起鸟嘌呤零落，多核苷酸链可在此处断基化，加热引起鸟嘌呤零落，多核苷酸链可在此处断裂裂2 2G+AG+A反响：用甲酸使反响：用甲酸使A A和和G G嘌呤环上的嘌呤环上的N N原子质子化，原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂3 3T+CT+C反响：用肼使反响：用肼使T T和和C C的嘧啶环断裂，再用哌啶的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基除去碱基4 4C C反响：当有盐存在时，只需反响：当有盐存在时，只需C C与肼反响，并被哌与肼反响，并被哌啶

10、除去。嘧啶使修饰碱基零落，并使去掉碱基的磷酸啶除去。嘧啶使修饰碱基零落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂二酯键断裂 32P-GCTACGTA：在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT在G处： 32p ，32p-GCTAC在C处：32P-G和 32P-GCTA在T处：32P-GC和32P-GCTACG硫酸二甲酯G： *ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸G+A： *A*ACTTCG *ACTTCGA *ACTTCGACA*ACTTCGACAG肼/NaclC： *AC *ACTTC*ACTTCGA C*ACTTCGACAG 肼C+T： *AC *ACT *ACT T *ACTTC*ACTTCG

11、AC*ACTTCGACAG从下往上读：CTACGTA，末端G不能读出。32P *ACTTCGACAG三三RNARNA的测序的测序 RNARNA的测序方法有的测序方法有3 3个：个：1 1用酶特异切断用酶特异切断RNARNA链：链：2 2用化学试剂裂解用化学试剂裂解RNARNA3 3逆转录成逆转录成cDNAcDNA19951995年年K.MullisK.Mullis发明。根本步骤为：发明。根本步骤为：1.1.设计一对引物以便有效扩增所需求的设计一对引物以便有效扩增所需求的DNADNA序列，并尽量减少能够产生的非特异产物序列，并尽量减少能够产生的非特异产物2.2.优化反响体系：包括适量模板、引物、

12、优化反响体系：包括适量模板、引物、4 4种种dNTPdNTP、Taq DNATaq DNA聚合酶和适量聚合酶和适量Mg2+Mg2+五、五、DNADNA聚合酶链式反响聚合酶链式反响PCRPCR3.3.选择选择3 3个温度进展热循环：个温度进展热循环：变性变性9494，454560s60s；退火，根据引物的退火，根据引物的Tm Tm ，1min1min；延伸，延伸，7272，1min1min。循环循环4.4.扩增完成后取出一定量的反响产物，检扩增完成后取出一定量的反响产物，检测扩增结果：先进展凝胶电泳，用溴化乙测扩增结果：先进展凝胶电泳，用溴化乙啶染色，紫外光下检测结果啶染色，紫外光下检测结果y=产物；产物；x=扩增效率；扩增效率；n循环次数循环次数(1)nyx 模板模板DNA单链单链引物引物DNA聚合酶聚合酶TaqdNTPMg2+MOV:MCB4.0POLYMERAS