08分子克隆实验设计

1、分子克隆实验原理q一、菌种保存和活化q二、质粒提取和保存q三、感受态细胞的制备q四、载体的制备q五、基因的制备q六、连接q七、转化q八、重组克隆的筛选菌种保存和活化q1、 100 ul菌液100 ul灭菌甘油 【混匀】q2、多制备几管，做上标记【菌名，质粒，时间】q3、20 可保存半年；【80 可长期保存】二、甘油菌活化：q1、取一管甘油菌，混匀；q2、用接种针接种并在培养平板上划线；q3、37 倒置培养12 h；q4、挑单克隆于2.5ml lb (视情况加抗生素），37 振荡培养12 h.q【注明：甘油菌用完后，最好扔掉，反复冻融易死亡。】质粒的提取原理碱裂解法q三种溶液：质粒的提取原理碱裂

2、解法qprotocal: c* 30 min.除去细菌rna(15)电泳鉴定初抽精抽除去少量杂质蛋白质粒的保存q1.ddh2o (可含edta) 中可短期保存 4 保存1月; -20 可保存一年 2. 75%乙醇可长期保存. 3. 烘干可长期保存(可能难溶)感受态细胞的制备q1. 菌种活化q2.取0.5ml菌液至50ml lb培养液中；q3、37 ，振荡培养2h至对数期；q4、转至50 ml无菌塑料管， 0 *10 min;q5、5000 rpm *10 min * 4 q6、取沉淀，加25ml 50mm cacl2【0 ，无菌】q7、 5000 rpm *10 min * 4 q8、取沉淀,

3、 加 2 ml 含15甘油的50 mm cacl2重悬，200 ul/tube分装，液氮速冻后至80 冰箱保存（半年有效）。【注意：（1）需要做一个无质粒的对照 （2）并用已知质粒转化，鉴定感受态细胞的转化效率大约106【1ug puc 质粒，产生克隆106 】载体的制备q1、酶切（放大体积100 ul，要充分)q2、胶回收（注意远紫外照射时间不能太长，防止dna突变）q3、纯度，浓度测定。(电泳测定）基因的制备(*)q1、pcr扩增q2. 酶切q3、胶回收q4、纯度，浓度测定连接q1、总体积为10 ul ；q2、16 连接过夜；q3、基因mol /载体mol 10 ; 【 平端 15】转化q

4、1、连接产物 5 ul加入感受态细胞中；q2、混匀，冰上30min-cell 吸附dna, 90 s热击，促进dna进入cellq4、冰上12min使细胞复原q5、加1ml lb (无 amp)外源dna还未表达q6、 37 培养1hamp抗性基因表达q7、6000rpm*30s，浓缩100ulq8、涂板（amp板）抗性筛选q9、37 培养过夜。重组克隆的筛选*q1、抗性筛选；q2、蓝白斑筛选；q3、酶切电泳筛选(*)；q4、pcr筛选；q5、测序验证；q6、表达筛选；q7、生物活性筛选。抗性筛选-质粒载体携带的筛选标记q1. ampr （氨苄青霉素抗性）q2、tetr (四环素抗性）q3、k

5、anr (卡那霉素抗性)特点：一般用抗性培养基做初级筛选，只能保证有载体转入，不能保证外源基因插入。克隆的amp抗性筛选蓝白斑筛选q一、酶切电泳筛选(*)q一、选用不同的酶切组合，通过电泳检测dna片断的大小。q二、特点：q1、可鉴定外源基因的重组和插入方向。q2、结果可靠但操作比较麻烦；q3、无法检测基因内部的突变。ecor1和xho1双酶切筛选pcr筛选q1、通过特异引物扩增，电泳检测，筛选重组质粒。q二、特点：q1、可用2ul菌液做模板，快速，方便，可批量检测。q2、不能检测基因插入方向q3、不能检测基因内部突变。测序验证q一、选取阳性克隆，送公司测序；q二、特点：q 1、最可靠的检测方

6、法。可确定基因的重组，插入的方向，基因内部的突变等。q 2、价格贵，适于12个克隆的验证。q1、一次测序反应一般准确测定500bp左右(也有测准800bp,价格贵）60元左右。q2、测定的序列靠近引物（起点）2030bp不准，500bp后的序列也不准。q3、（1）质粒测序： 测序引物公司提供 （2）pcr产物直接测序： 测序引物自己提供，理论上比质粒测序更可靠。 注意: a. 测序引物必须与模板完全配对；含有mix碱基的引物一般不能测序； b. 测序引物长度一般为20个碱基左右，gc含量必须在5060%左右。测序验证测序验证表达筛选q一、sds-page筛选；q二、亲和筛选；q三、免疫筛选；s

7、ds-page筛选q1、小量诱导表达；q2、全菌液裂解后进行sds-page电泳；q3、重组的表达克隆将在特定的位置出现较浓的蛋白条带。（需加不诱导的对照）q特点：q1、可检测外源基因的表达。（一般基因的插入，方向，读框都正确）q2、无法筛选不能有效表达的重组质粒。亲和筛选q1. 50 ml菌液诱导表达，q2、超声破菌，q3、用少量亲和beads吸附上清；q4、sds-page检测，在特点位点将出现一条蛋白带。q特点：q1、适用于有亲和taq的融合蛋白的检测；q2、比sds-page筛选更灵敏（富集），可靠；q3、比较麻烦。免疫筛选q用抗体检测目标蛋白：qwestern blot（最准确）qelisa (可能会受到交叉反应的干扰）生物活性筛选q酶：测定酶活；q亲和蛋白：与亲和底物作用。q其它的生物活性。分子克隆流程q1、分析基因，载体特点；q2、设计克隆策略；q3、检测基因