丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇实验设计1

1、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇试验的研究试验的研究低成本生产丁醇的必要性低成本生产丁醇的必要性 生物燃料是可替代汽油等石油燃料的清洁能源。生物燃料生物燃料是可替代汽油等石油燃料的清洁能源。生物燃料主要包括生物柴油、生物乙醇和生物丁醇等。生物丁醇是一种极主要包括生物柴油、生物乙醇和生物丁醇等。生物丁醇是一种极具潜力的新型生物燃料，被称为第二代生物燃料。与生物乙醇相具潜力的新型生物燃料，被称为第二代生物燃料。与生物乙醇相比，它具有能量高于乙醇，有较好的燃料经济性，可提高汽车燃比，它具有能量高于乙醇，有较好的燃料经济性，可提高汽车燃料效率和行车里程数等优点。丁醇的性质更接近于烃类，因此

2、与料效率和行车里程数等优点。丁醇的性质更接近于烃类，因此与汽油的配伍性好，无需改造汽车。作为新型的生物燃料，全球对汽油的配伍性好，无需改造汽车。作为新型的生物燃料，全球对于生物丁醇的需求量逐年增加，生物丁醇的研究也因此成为当前于生物丁醇的需求量逐年增加，生物丁醇的研究也因此成为当前可再生资源开发利用的热点之一可再生资源开发利用的热点之一 传统发酵法生产丁醇主要以玉米和糖蜜为原料，但对中国传统发酵法生产丁醇主要以玉米和糖蜜为原料，但对中国这样的人口大国来说，粮食关系到国计民生，确保粮食安全是社这样的人口大国来说，粮食关系到国计民生，确保粮食安全是社会稳定最基本的需求。开发粮食替代资源，不与人争粮

3、，不与粮会稳定最基本的需求。开发粮食替代资源，不与人争粮，不与粮争地，是我国大规模生物炼制技术开发和产业发展的基本国策。争地，是我国大规模生物炼制技术开发和产业发展的基本国策。原始农作物玉米秸秆 植物秸秆主要成分是纤维素、半纤维素和木质素。其中,纤维素、半纤维素是可发酵糖的来源,含量占66% 75%(纤维质原料的绝干重量)。 但丙酮丁醇梭菌是无法直接利用木质纤维素为底物进行丁醇发酵,它需将木质纤维素水解产生葡萄糖、木糖等单糖再用于丁醇发酵。本实验所用菌种丙酮丁醇梭菌（clostridiumacetobutylicum ） 一种革兰染色阳性、细胞呈梭状、能产生丙酮和丁醇等溶剂的厌氧芽抱杆菌。细胞

4、大小(0.6一0.9)um* (2.4一4.7)um，常含细菌淀粉粒。以周生鞭毛运动。芽抱卵圆形，次端生。表面菌落圆形、突起，直径3一5mm，边缘不规则，色灰白，半透明，表面有光泽。严格厌氧。能分解蛋白质和糖类;生物素和对氨基苯甲酸作生长因子试验内容一、玉米秸秆水解实验设计一、玉米秸秆水解实验设计二、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇培养基及发酵二、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇培养基及发酵 条件优化条件优化三、以玉米秸秆水解液为底物发酵产丁醇的三、以玉米秸秆水解液为底物发酵产丁醇的 研究研究一、一、玉米秸秆水解实验设计 实验研究玉米秸秆经不同试剂预处理后对其酶水解的影响,以及ph值、时间、酶用量、底物浓度等因素

5、对酶水解率的影响,从而得出最佳酶解条件。并利用最佳条件下的水解液进行丁醇发酵,从而达到农业秸秆的资源化利用。1. 试验材料：玉米秸秆、纤维素酶、及其他试剂和器材试验材料：玉米秸秆、纤维素酶、及其他试剂和器材2. 试验方法：试验方法：（1）玉米秸秆的预处理。碱浸泡法）玉米秸秆的预处理。碱浸泡法: 3%的的naoh,固液比固液比 为为1 10,室温浸泡室温浸泡24 h,过滤过滤,滤渣洗净后于滤渣洗净后于60 烘干水分至恒烘干水分至恒重。氨水浸泡重。氨水浸泡: 10%的氨水的氨水,固液比为固液比为1 10,室温浸泡室温浸泡24h,过滤过滤,滤滤渣洗净后于渣洗净后于60 烘干水分至恒重。以不作处理玉米

6、秸秆作为对烘干水分至恒重。以不作处理玉米秸秆作为对照。照。（2）酶水解反应条件。称取）酶水解反应条件。称取1 g秸秆于秸秆于250 ml锥形瓶锥形瓶,加入纤维加入纤维素酶溶液素酶溶液(0. 05 mol/l, ph值值4. 8的柠檬酸的柠檬酸- 柠檬酸钠缓冲溶液柠檬酸钠缓冲溶液) ,将三角瓶置于恒温水浴振荡摇床上进行酶解反应将三角瓶置于恒温水浴振荡摇床上进行酶解反应,温度温度50 ,转速转速100 r/min,反应时间反应时间36 h。反应结束。反应结束,离心取上清液进行还原糖的离心取上清液进行还原糖的分析分析。（一）实验材料与方法(1)秸秆成分分析。测定预处理前后1 g秸秆粉中的 纤维素、半

7、纤维素及木质素含量。(2)还原糖的测定。dns法。(3)酶水解率测定。 酶水解率(%) = a 0. 9m (1 - w) 100 式中, a为还原糖质量,m 为秸秆质量,w为含水率。（二）（二） 分析方法设计因素：1.粉碎程度对酶水解的影响： 该试验采用15目、60目和200目的秸秆粉碎程度考察粒径大小对酶水解的影响。2. 温度对酶水解的影响： 设计30 、35、40 、45 、50 、55 。七个梯度对酶水解的影响。( (三三) )酶水解工艺的优化酶水解工艺的优化3.纤维素酶的用量对酶水解的影响： 分别设置200、400、600、800、1000、1200u g 六个梯度。4.ph值对酶水

8、解的影响: 分别设置ph=3、4、5、6、7、8进行试验。5.底物浓度对酶水解的影响： 设置固液比为1：10、1：20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70几种底物浓度做试验。二、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇培养基及发酵条件优二、丙酮丁醇梭菌发酵产丁醇培养基及发酵条件优化化（一）实验设计：1.培养基及培养方法(1)培养基a 种子培养基: 5%玉米醪，ph自然;b 原始发酵培养基: 葡萄糖 50 gl kh2po4 0.5l 醋酸胺 3 g/ l mgso7h2o 0.2g/l k2hpo4 0.5 g/ l 邻氨基苯甲酸 0.01 g/ l ph 自然c 单因素实验发酵培养基(g/ l

9、):以原始培养基为基础组分，分别改变初始糖浓度、初始ph值、碳氮比、发酵温度、转速、邻氨基苯甲酸浓度;糖浓度:40 、 60 、 80 、 100 、 120 g/lph值: 4 、 5 、 6 、 7 、 8碳氮比: 37、42、47、52、57邻氨基苯甲酸浓度:0.0005、0.001、 0.0015、0.002、 0.0025和 0.003g/l发酵温度:32 、 34 、 36 、 38 、 40转速: 150、160、170、180、200r/mind 正交设计实验发酵培养基(g/ l ): 培养基选取葡萄糖为碳源，醋酸按为无机氮源，并添加适量邻氨基苯甲酸。由于培养基的碳氮比c/n、

10、初始ph、发酵温度以及生长因子对微生物的丙酮、丁醇合成影响很大，故对发酵培养基的c/n ，初始ph，邻氨基苯甲酸浓度，发酵温度进行均匀设计实验，以达到优化发酵培养基和发酵条件的目的。按照实验设计按下表配制; 试验号12345678910111213141516 c/n37373737424242424747474752525252 ph4567456745674567邻氨基苯甲酸浓度g/l0.00050.0010.00150.0020.00050.0010.00150.0020.00050.0010.00150.0020.00050.0010.00150.002 发酵温度32343638323

11、436383234363832343638a.菌种活化培养:将lml菌种接种于 20ml玉米醪试管培养基中，沸水浴下热处理1一2min，37下厌氧活化培养。b.摇瓶培养(单因素实验):将活化好菌种以体积比10%的接种量接种于 100ml单因素实验发酵培养基中，充氮气 10min，于37， 150r/min摇床培养。c.摇瓶培养(正交设计实验):将活化好菌种以体积比10%的接种量接种于 100ml正交设计实验发酵培养基中，充氮气 10min，于37， 150r/min摇床培养。（2）培养方法d.d.摇瓶培养摇瓶培养( (优化验证实验优化验证实验):):将活化好菌种将活化好菌种以体积比以体积比10

12、%10%的接种量接种于的接种量接种于 100ml100ml优化优化培养基中，初始培养基中，初始phph值值5.55.5，充氮气，充氮气 10min10min，于于37.537.5， 150r/min150r/min摇床培养。摇床培养。e.e.发酵罐培养发酵罐培养: :将将llll优化培养基加入优化培养基加入1.5l1.5l发发酵罐中，酵罐中，121121下饱和蒸汽灭菌下饱和蒸汽灭菌20min20min，冷却后，将活化好菌种以体积比冷却后，将活化好菌种以体积比10%10%的接的接种量加入发酵罐内，通氮气种量加入发酵罐内，通氮气 30min30min，设，设定温度为定温度为37.537.5，转速，

13、转速150r/min150r/min，初始，初始phph值值5.55.5的条件下发酵的条件下发酵(1)葡萄糖、果糖浓度的测定 采用dns法测定 (2)丙酮、丁醇、乙醇浓度的测定 用气相色谱测定， (3)含氮量的测定 采用凯氏定氮法测定。(4)菌体生物量的测定 采用酶标仪测定620nm下的菌体浓度（二）实验结果分析（2）对照组培养基: 碳源分别为葡萄糖和果糖，浓度和玉米秸秆水解液保持一致，添加醋酸按(调好c/n比)，培养基中其他组成同玉米秸秆培养基，初始ph5.5。以上培养基均在121饱和蒸汽下灭菌15min。三、以玉米秸秆水解液为底物发酵产丁醇的研究三、以玉米秸秆水解液为底物发酵产丁醇的研究实验方法1.培养基的制备 玉米秸秆水解液的制备:根据先前玉米秸秆水解实验，按优化的最佳条件水解，调最终浓度分别为5%，6%和8%。（1）玉米秸秆水解液培养基 玉米秸秆水解液、mnso4、 kh2po4、 mgso7h2o 、 k2hpo4、 邻氨基苯甲酸（1 1）不同底物发酵过程中主要产物分析）不同底物发酵过程中主要产物分析（2 2）不同底物发酵过程中副产物分析）不同底物发酵过程