南美叉柱花的离体培养与快速繁殖

1、南美叉柱花的离体培养与快速繁殖摘要：以叉柱花幼嫩枝条为外植体，建立了快速无性 繁殖体系。结果显示：采用0.1%的升汞溶液消毒处理 10min最为合适；诱导不定芽最佳增殖培养基配方为改良 Ms 培养 基+6-BA 2.0mg/L+KT 0.5mg/L+IBA O.1mg/L ;生根培养基配方 为改良的 MS培养基+NAA 1mg/L+IBA 0.1mg/L。该离体培养方 法能提高叉柱花的繁殖系数，有效缓解当前种苗不足和缩短 上市时间，满足市场需求。关键词：叉柱花;组织培养;快速繁殖 观赏水草在水族箱中有着重要的地位，随着人们对水草 的喜爱，已经发展成为以水草为主的观赏水族箱。南美叉柱 花(Sta

2、urogynerepens),也称叉柱花，是一种双子叶植物， 属于爵床科叉柱花属，分布于巴西、委内瑞拉等地，虽然近 年来才刚刚引入我国，但是得到市场的认可，市场上往往供 不应求。南美叉柱花的繁殖主要依靠对成年的匍匐茎进行分 株，繁殖系数较低，同时成本较高。其属于短日照植物，在 每年 11 月以后常常开花，引起植物早衰，叶片变黄，失去 欣赏价值，不仅导致经济价值下降，而且在秋冬季节市场上 产品缺乏。随着生物技术的发展，特别是植物组织培养技术 的日趋成熟，利用植物工厂生产花卉，果树等的种苗已经广 泛应用，比如香蕉、番木瓜、蝴蝶兰、杨树、铁皮石斛等。 近年来一些观赏水草如水榕、红椒、绿椒、皇冠、红波

3、等也 已经成功建立了组织培养技术体系，有些品种开展了工厂化 育苗，但是还没有工厂化生产叉柱花的报道。组织培养技术 能够在短期内大量提供南美叉柱花的种苗，同时通过室内培 养避免其受光周期诱导开花。本研究通过对影响叉柱花组织 培养及快速繁殖的因素进行了相关探索，以期为叉柱花的工 厂化组培育苗提供技术方案，保障周年供应市场。1 材料与方法1.1 材料2014 年春季在南宁花鸟市场购买生长健壮的叉柱花成 苗，培养在亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室 玻璃温室。1.2 培养基与培养条件改良MS培养基（MX）:改良MS培养基的配方为：用Ca （ N03） 2?4H2O代替原 MS培养基中的 CaC

4、I2?2H20并添 加抗坏血酸，其他组分均无变化；其中 Ca（ NO3） 2?4H2O 的浓度为 95mg/L ，抗坏血酸的浓度为 5mg/L ；丛芽增殖培养 基：在 MX培养基中添加适量的 6-BA、KT、NAA;生根培养 基：在MX培养基中添加适量的I-BA及NAA。所有培养基附 加蔗糖30g/L、琼脂5.5g/L, pH值调至5.8 0.2,经121 C高 压灭菌20min。培养条件：温度25 3C,湿度为65%80%, 光照度800Lx,光照时间10h/d。1.3 外植体消毒处理 选取叉柱花幼嫩的枝条作为外植体，去除叶片，用自来 水冲洗 30min ，然后用吸水纸吸干枝条表面水分。在超

5、净工 作台上，将洗净的枝条切成带有 12个芽的茎段，先用70% 酒精清洗30s，再用无菌水冲洗 3次，每次3min，立即转入 含有吐温的 0.1%的升汞溶液中分别浸泡 7、9、11、13min ， 晃动烧杯，让材料充分接触消毒剂，最后将材料用无菌水洗 涤3次，每次5min，得到消毒外植体备用。消毒好的茎段切除与消毒剂有接触的两端，接种于诱导 培养基 MX+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L 中，每个消毒处理 30 个芽。于 1 5d 后统计污染率和萌芽率。1.4 丛芽的增殖 取诱导得到的初代材料，接种于丛芽增殖培养基，培养基中激素的组合和浓度如表 1所示，进行继代培养 21d，比

6、 较不同浓度的6-BA和KT对叉柱花丛芽增值的效果，统计20 个芽的增殖情况。1.5 叉柱花生根诱导将叉柱花丛芽切成带有 12 不定芽的茎段，然后将生 物学底端插入生根培养基中。培养基以 MX 为基础，添加不 同浓度的NAA和IBA,浓度见表2。进行生根培养1 520d , 统计 20 株再生植株根的数量和长度。1.6 叉柱花的种植当叉柱花幼苗生的根长至 12cm、苗高3cm以上后， 将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养7d ,然后洗净根部培养基， 浸泡0.1%多菌灵溶液10min，将组培苗根部用适量消毒后的 岩棉包裹，固定在直径 5cm，高6cm的塑料镂空杯中，种植 在遮光率为 50%的塑料大棚的

7、水池中，保持叶面湿度。2 结果与分析2.1 外植体消毒 经过消毒处理后的外植体在诱导培养基上，710d 腋芽开始萌动，在 21d 已经有丛芽（图 1 ）。按 1.3 方法对叉柱花 外植体进行消毒，70%的酒精处理20s后，再以0.1%HgCI2 作 4 种不同时间的处理，对其污染率、萌芽率和死亡率进行 统计，结果如表 3。本研究中，叉柱花外植体污染主要为细 菌污染，没有出现真菌污染，可能是采用酒精和氯化汞相结 合的2次消毒的结果。外植体的污染率与0.1%HgCI2处理时间的长短负相关，随着处理时间的延长，0.1%H gCI2外植体的伤害增加，污染率逐渐下降，消毒 13min 的污染率比消毒 7

8、min 的降低了 60%，并且出现细菌污染的时间也要滞后， 而 外植体的萌芽率也逐渐降低，在消毒 13min 时，萌芽率仅为 10%，比处理 7min 的要低 53.33%；外植体的死亡率不断上 升，处理 4的死亡率最高， 高达 66.67%，而处理 1 仅为 10%。 在本研究中处理 14均能得少量的无菌外植体，通过结合萌芽率和污染率等综合因素分析，采用70%酒精 20s 和0.1%HgCI2处理910min较为合适开展叉柱花外植体的消毒。2 .2叉柱花丛芽的诱导与增殖丛生芽通过不断继代增殖培养，在短期内可以得到大量的无菌苗（图2）。从表4 可以看出， 6-BA 浓度在 13mg/L 内均能

9、诱导不定芽的增 殖，增殖效率和浓度正相关。随着浓度的升高，不定芽的增 殖效率递增，在6-BA浓度3mg/L时增殖系数达到7左右。但是仅用6-BA诱导芽过于密集，节间短，苗较弱，不便于进 行第2次增殖操作。在培养基中加入 0.51mg/L的KT均能 促进苗的均匀，缓解6-BA浓度过高导致丛生芽的矮小， 并且 增殖系数为 6 7，和原来增殖系数相当， 但改善了苗的均匀 性。从节约生产成本的角度考虑，KT的浓度建议为0.5mg/L。2.3 生根培养将带芽的茎段接入生根培养基，培养20d，统计苗生根率、根的长度和质量。 结果0.5mg/L和1mg/L的NAA都能诱 导叉柱花的生根，单独使用 NAA，得

10、到的根相对较细，在移 栽过程中容易断。其中，在 1mg/L 处理下根的数量在 5条左 右，要比 0.5mg/L 的处理多 2 3条，根直径上没有明显的差 异。添加0.1mg/L的IBA能显著提高根直径，得到较为粗壮 的苗，完全能够满足后期的移栽，保证成活率（图3）。 MX培养基 +NAA1g/L+IBA 0.1mg/L 是适合诱导叉柱花生根的培养2.4 炼苗及移栽生根诱导培养 25d 左右，叉柱花幼苗的根一般达到长 1cm,株高3cm左右。在开盖炼苗期间，生长变慢，叶片变 厚。在移栽57d后，植株叶片转绿，有新根长出，成活率 在 95%以上（图 4）。3 讨论观赏水草品种已经超过 500 多种

11、，但是其中绝大多数来 源于美洲、非洲、东南亚等热带地区，广州已经成为我国大 陆最大的水草集散地。观赏水草市场需求量大，已经发展成 为一种重要的经济植物，但是观赏水草的繁殖系数较低，种 苗问题严重制约水草产业的发展。叉柱花造型优美、适应性 强、容易管理，适合作为前景草，市场上供不应求。但是， 叉柱花在冬季的时候，容易开花，市场上稀少。叉柱花的种 苗缺乏和避免冬季开花是目前急需解决的问题。植物组织培 养技术能解决短时间内大量扩繁种苗和通过室内培养避免 冬季开花，在叉柱花的生产上有着重要的意义。目前植物组 织培养快速繁殖在技术上非常成熟，只是生产成本的高低关 系到应用范围。在植物快繁技术中无菌外植体

12、的获得和增殖 效率是关键。叉柱花是水生植物，长期生长在水中，内生菌 丰富，获得无菌材料尤为重要。 Hg-Cl2 消毒在植物组织培养 研究中效果最好，在水草的组培应用较多，均能成功得到无 菌外植体，消毒时间的控制最为关键。消毒时间与材料的幼嫩、生理状态、表面是否光滑等相关。叉柱花的幼嫩茎段在 0.1%HgCI2处理91 0min能获得无菌材料，在这个时间内达 到一个平衡，即杀死细菌和真菌但对植物本身没有伤害。在 激素方面由于植物组织培养快速繁殖技术非常成熟，有较多 文献可以参考。在生产上，研究者往往结合自己的经验设置 简单的梯度获得适合的体系。本研究结合以往的结果，通过 设置6-BA和KT的协同作用，促进丛芽的增殖，结