免疫荧光技术2

1、免疫荧光技术免疫荧光技术（immunofluorescence technique,IFA)immunofluorescence technique,IFA) 实验实验1301班班 杨小玉杨小玉主要内容一.免疫荧光技术概念 原理二.免疫荧光技术的基本条件三.经典荧光抗体染色法四.现代免疫荧光技术一一. .免疫荧光技术的概念及原理免疫荧光技术的概念及原理 概念：免疫荧光技术是将荧光素的敏感可测性,抗原抗体反应的可测性以及显微技术高度精确性相结合的一种免疫标记测定技术。 免疫荧光技术原理 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原

2、）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。 在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。二二. .免疫荧光技术的基本条件免疫荧光技术的基本条件（一）荧光素（二）待标记抗体的标准（三）荧光标记抗体的制备（四）荧光标记抗体的纯化与鉴定（一）荧光素（一）荧光素:一种有机或无机的化学物质，其接受激发光的光能以后，能够以发射光形式产生明亮的荧光而作为染料使用。各种荧光素都有各自的激发波长和发射波长。因发射波长不同，荧光颜

3、色各异。荧光素及其性质：荧光素具有共轭双键体系的化学结构。荧光素通常处于最低的能量状态，称为基态（ground state)。当荧光素受到紫外光或可见光的短波部分（紫光和蓝光）作为激发光照射时，会吸收合适波长的电磁波，其外层 电子即进入更高能量的轨道，从而处于激发态（excited state)。荧光素的荧光特性： （1）停止供能，荧光现象随即终止 （2）对光的吸收和荧光的发射具高度选择性入射光波长发射光波长 （3）荧光效率：荧光效率=发射荧光的光量子数 /吸收光的光量子数 （4）荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱常见荧光素： 1）异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocya

4、nate, FITC) ：FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长为520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 （2）四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) ：RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595600nm，呈现

5、橘红色荧光。 （3）四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。 （5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式

6、细胞仪来说，推荐使用58521nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用57513nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。 常见荧光素的特性： FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490495nm，发射光520530nm，明亮的黄绿色荧光。 RB200：橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光595600nm，橘红色荧光。 TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙红色荧光。 PE：吸收光490560nm，发射光595nm，红色荧光。FITC 呈黄绿色荧光RB200 呈橘红色荧光色FITC+RB200 双标记染色法合适荧光素的选择： （1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。 （

7、2）荧光效率高，标记后下降不明显。 （3）荧光色泽与背景色泽对比鲜明。 （4）标记后能保持生物学活性和免疫活性 （5）标记方法简单、快速。 （6）安全无毒（二）待标记抗体的标准 用于标记的抗体须特异性强，纯度高，效价高，经荧光素标记后抗体活性损失少。标记前，可用梅花状琼脂双向扩散法测定抗体效价，即中央孔加抗原（1mg/ml),周围孔加倍比稀释的抗体（1：21：64），抗体效价在1：32以上较为理想。荧光标记的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，亦可以是SPA，后者可作为荧光二抗的通用试剂。（三）荧光标记抗体的制备1.FITC标记抗体2.RB200标记抗体3.TRITC标记抗体4.PE标记抗体（1

8、）搅拌标记法）搅拌标记法（2）半透膜透析标记法）半透膜透析标记法（1）PE巯基化巯基化（2）IgG与与PE交联交联（3）残余巯基的封闭）残余巯基的封闭（4）透析平衡）透析平衡（四）荧光标记抗体的纯化与鉴定 荧光标记抗体的纯化 荧光标记抗体的鉴定 荧光标记物的保存（1）去除游离荧光素）去除游离荧光素（2）去除未标记和过度标记的抗体）去除未标记和过度标记的抗体（1）抗体和）抗体和荧光的活性鉴定荧光的活性鉴定（2）荧光素与蛋白质的摩尔比值）荧光素与蛋白质的摩尔比值（F/P）（3）荧光抗体浓度的测定）荧光抗体浓度的测定（4）荧光抗体特异性的鉴定）荧光抗体特异性的鉴定（1）经鉴定合格的荧光抗体，可过滤除

9、菌，也）经鉴定合格的荧光抗体，可过滤除菌，也可加入防腐剂（可加入防腐剂（0.01%硫柳汞或硫柳汞或0.1%NaN3）或抗）或抗生素防腐生素防腐（2）荧光抗体经无菌，小量分装后置）荧光抗体经无菌，小量分装后置04可保可保存存1年左右，年左右，-20可保存可保存23年，冷冻干燥后可保年，冷冻干燥后可保存较长时间。存较长时间。（3）冷冻取出后应快速融化，并避免反复冻融）冷冻取出后应快速融化，并避免反复冻融。三三. .经典荧光抗体染色法经典荧光抗体染色法一.直接荧光抗体染色法二.间接荧光抗体染色法三.补体荧光染色法四.特殊染色法一.直接荧光抗体染色法 概念：将荧光素标记的特异性抗体直接滴加于待检标本片

10、上，避光反应和洗涤以后，在荧光显微镜下观察标本中是否有相应抗原存在。这是荧光抗体技术最简单，最基本的方法。二.间接荧光抗体染色法 概念：将荧光素标记于抗抗体（荧光二抗）或标记葡萄球菌A蛋白（SPA），以荧光二抗检测与抗原结合的特异性抗体。 检测过程： 第一步：将第一抗体加在含有抗原的标本上，避光孵育一定时间以后，洗去未结合的抗体。 第二步：将荧光二抗加在标本上，与结合在抗原上的抗体（一抗）结合，形成“抗原抗体荧光二抗”的复合物三.补体荧光染色法 概念：将荧光素标记在抗补体抗体（抗C3抗体），检测抗原抗体复合物。此法是间接法的一种改良，利用补体结合反应的原理，在抗原抗体反应时加入补体（多用豚鼠补体），再用荧光素标记的抗C3抗体进行示踪。主要用于检测抗体。 检测过程分两步： 第一步：将待测抗体和补体加在已知抗原的玻片上，作用一段时间后，洗去未结合的抗体和补体。 第二步：滴加荧光标记抗C3抗体。如果在第一步中抗原抗体发生特异性结合，则补体被固定，此时加入的标记抗补体抗体即与补体发生结合，形成“抗原抗体