药物分析与检验：第七章 免疫分析法

1、第七章免疫分析法 生命科学学院制药工程抗原1抗体2免疫分析法3本章内容一、抗原抗原：指能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质。物质抗原性包括免疫原性和抗原特异性。免疫原性：注射入动物体内，促使动物产生循环抗体或改变免疫细胞反应性。抗原特异性：具有能与特异抗体作用的性质。全抗原：既具有免疫原性又具有抗原特异性物质。半抗原：只能与特异抗体作用但不能引起机体免疫应答。 人工抗原合成（一）半抗原和载体结合的化学反应 1 多肽激素类 （1）活化蛋白质或多肽的游离羧基形成肽键的结合剂。 碳化二亚胺类 异噁唑盐类 烷基氯甲酸类 （2）连接氨基的结合剂 蛋白质或多肽游离氨基缩合形成肽键结合剂。 卤代硝基苯 二

2、亚胺酯 （3）重氮盐类 2 甾体 制备甾体衍生物含游离羧基再经碳化二亚胺缩合反应与载体蛋白赖氨酸氨基形成肽键。 琥珀酸衍生物 肟 3 抗生素 B-内酰胺类抗生素 氨基糖苷类抗生素二、抗体 抗体：机体经抗原刺激由免疫活性细胞产生的免疫球蛋白，IgG，血清含量最高，常用抗体。（一）抗体制备 多克隆抗体：抗血清，由抗原直接免疫动物得到。 多克隆抗体制备步骤： 免疫原制备 动物免疫 试血 测定免疫血清效价 放血 采集血清单克隆抗体：经细胞融合产生杂交瘤细胞产生。 单克隆抗体制备步骤：每种细胞克隆只分泌特异均一的一种单克隆抗体，然后运用细胞培养法大量生产，也可接种于动物体内大量生产。单克隆抗体制备多克隆

3、抗体制备（二）抗体纯化 1 化学法 （1）冷酒精沉淀法 （2）中性盐分段沉淀法 （3）DEAE-纤维素柱层析法 2 利用免疫吸附剂纯化特异抗体 （1）利用特异抗原纯化特异抗体 （2）利用特定的细菌蛋白纯化特异抗体（三）特异性抗体筛选与效价测定1 抗体的效价测定u效价：又称滴度，指某一物质与一定量的另一物质产生反应所需要的量。u免疫分析中，免疫血清中抗体效价指将血清稀释，测定与一定的抗原能发生反应的最大稀释浓度，为血清效价。2 抗原决定簇特异性抗体的筛选3 构象特异性抗体的筛选三、免疫分析方法 1 放射性免疫分析法 原理：待测抗原与定量标志抗原与限量抗体进行特异性反应。待测抗原与定量标志抗原发生

4、竞争性结合。待测抗原多，待测抗原抗体复合物形成多，定量标志抗原-抗体结合物少。待测抗原量与定量标志抗原结合物成反比例关系，用已知不同浓度的标准品绘制曲线，根据放射性强度测定待测抗原浓度。 放射性物质分离方法：（1）柱层析法 电泳法（2）吸附法（3）硫酸铵、聚乙二醇沉淀法（4）抗抗体法（5）微孔滤膜法（6）固相法 2 荧光免疫分析法 紫外光照射抗体，吸收一定波长的光，为消散吸收的这部分能量发射波长较长的光，当这部分能量转移到不发荧光的分子上，蛋白质的荧光减少，当这部分能量被发生荧光的分子吸收，荧光增强，因此，当抗体与具有某些荧光性质的半抗原作用时，由于紫外光照射产生的激发能量被转移到不发生荧光的

5、结合半抗原上导致抗体荧光减弱。 荧光 法 荧光增强法 荧光偏振光法 时间分辨荧光免疫分析法3 克隆酶给予体免疫分析法 两个无酶活性蛋白质片段，结合时，有酶活性。ED标记半抗原药物与抗体结合，就不与另一片段形成酶。当游离药物增加，ED标记半抗原与另一片段结合，酶量增加，显色强。 4 酶联免疫分析法 酶联免疫吸附测定法 ELISA原理：包被抗原或抗体后，通过抗原抗体反应使酶标抗体结合到抗体上，使结合的酶标抗体和游离的酶标抗体分离，洗去游离的酶标抗体，加底物显色，定性定量分析。 双抗体夹心法（双抗原夹心法） 竞争法 酶联免疫分析法技术要点 包被技术 ：将抗原或抗体连接到固相载体上的过程称为包被。 聚苯乙烯对蛋白质具有较强吸附功能，抗体或蛋白质抗原吸附后可保留其免疫活性， 对于半抗原，多糖类抗原，聚苯乙烯亲和力弱，形成半抗原-载体结合物。 含氨基的半抗原可与用戊二醛或者乙二胺处理过的聚苯乙烯微孔板连接，短肽类抗原用UV辐射处理后的微孔板，多糖类抗