第八章蛋白质的测定

1、8-1 概述概述8-2 蛋白质的定性测定（自学）蛋白质的定性测定（自学）8-3 蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定*（8-4 蛋白质的末端测定）蛋白质的末端测定）8-5 氨基酸的定性测定（自学）氨基酸的定性测定（自学）8-6 氨基酸的定量测定氨基酸的定量测定*8-7 氨基酸的分离及测定氨基酸的分离及测定第八章第八章 蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定本章重点本章重点1.凯氏定氮法的原理及注意事项。凯氏定氮法的原理及注意事项。2.蛋白质快速测定法有哪些？蛋白质快速测定法有哪些？3.氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。第一节第一节 概述概述l蛋白质是复杂的含

2、氮有机化合物。蛋白质是复杂的含氮有机化合物。l蛋白质换算系数蛋白质换算系数F 玉米、高粱玉米、高粱 6.24 6.24 花生花生 5.465.46 乳制品乳制品 6.38 6.38 大米大米 5.955.95 面粉面粉 5.70 5.70 大豆及制品大豆及制品 5.715.71 肉与肉制品、复合配方食品、一般食物肉与肉制品、复合配方食品、一般食物 6.256.25l蛋白质平均含蛋白质平均含N量（量（15-17.6）为）为16% 。OHCN|l不同的食品中蛋白质含量不一样，一般动物性不同的食品中蛋白质含量不一样，一般动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。食品的蛋白质含量高于植物性食品。 鸡肉鸡肉

3、 鸭鸭 兔肉兔肉 牛肉牛肉 猪肉猪肉 带鱼带鱼 21.5 16.5 21.2 20.1 9.5 18.1大豆大豆 稻米稻米 菠菜菠菜 苹果苹果 黄瓜黄瓜 牛乳牛乳 36.3 8.5 2.4 0.4 0.8 3.5l测定意义：测定意义：评价食品的营养价值。评价食品的营养价值。为合理开发利用食物资源，提高产品质量，为合理开发利用食物资源，提高产品质量，优化食品配方及生产过程控制提供依据。优化食品配方及生产过程控制提供依据。其中：其中：凯氏定氮法凯氏定氮法最常用的，国内外应用普遍。最常用的，国内外应用普遍。双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法等双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法等多用于生多用于生产单位

4、质量控制分析。产单位质量控制分析。国外：红外分析仪国外：红外分析仪在一般的常规检验中多进行氨基酸总量的测定，通常采在一般的常规检验中多进行氨基酸总量的测定，通常采用酸碱滴定法来完成。用酸碱滴定法来完成。各种氨基酸的分离与定量各种氨基酸的分离与定量色谱技术。色谱技术。有多种氨基酸分析仪。有多种氨基酸分析仪。l蛋白质的测定方法：蛋白质的测定方法： 分两大类分两大类 一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；等测定蛋白质含量； 另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基（酸性和碱性另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基（酸性和碱性基团、芳香基团等）测定

5、蛋白质含量。基团、芳香基团等）测定蛋白质含量。第二节第二节 蛋白质的定性测定蛋白质的定性测定（自学）（自学）一、蛋白质的一般显色反应一、蛋白质的一般显色反应电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。书中列举了并变色。书中列举了 5 种染料。种染料。二、复合蛋白质的显色反应二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（一）糖蛋白的显色（3种方法）种方法）（二）脂蛋白的显色（二）脂蛋白的显色（2种方法）种方法）测定总氮量测定总氮量 N%F =粗蛋白质含量粗蛋白质含量%因为：样品中除蛋白氮外，可能还包括有非蛋白因为：样品中除蛋白氮外，可能还包括有非蛋白质含氮化

6、合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物质含氮化合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物碱、含氮类脂、卟啉和含氮色素等。碱、含氮类脂、卟啉和含氮色素等。第三节第三节 蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定！一、一、 凯氏定氮法凯氏定氮法 由由Kieldhl于于1833年提出，现发展为常量、微年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。改良改良：氮的完全氨化氮的完全氨化，缩短时间缩短时间，简化操作简化操作。 主要改良催化剂主要改良催化剂及消化及消化蒸馏蒸馏装置。装置。（一）常量凯氏定氮法（一）常量凯氏定氮法原理原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋

7、白质分样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。使氨蒸出。用用H3BO3吸收后再以标准吸收后再以标准HCl滴定滴定或或H2SO4溶液滴定。溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。也可以用过量的标准也可以用过量的标准H2SO4或标准或标准HCl溶液吸收后再溶液吸收后再以标准以标准NaOH滴定过量的酸。滴定过量的酸。为什么？催化剂催化剂煮沸煮沸

8、1、消化：、消化：NCOC + 浓浓H2SO4 （NH4）2SO4 + CO2 + SO2 + H2O 2、蒸馏与吸收：、蒸馏与吸收： 2NaOH +（NH4）2SO4 2NH3+Na2SO4 + 2H2O 2NH2NH3 3 + 4H + 4H3 3BOBO3 3 （NHNH4 4）2 2B B4 4O O7 7 + 5H + 5H2 2O O 3 3、滴定：（、滴定：（NHNH4 4）2 2B B4 4O O7 7 + 5H + 5H2 2O + 2HCl 2NHO + 2HCl 2NH4 4Cl + 4HCl + 4H3 3BOBO3 3 ( (注注: NCOC, Nitrogen co

9、ntaining organic compounds ): NCOC, Nitrogen containing organic compounds )凯氏定氮法原理（方程式）凯氏定氮法原理（方程式）整个过程分三步：消化、蒸馏与吸收、滴定整个过程分三步：消化、蒸馏与吸收、滴定1. 消化消化加硫酸钾加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点纯硫酸沸点 340，加入硫酸钾之后可以提高，加入硫酸钾之后可以提高至至400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。高沸点，但效果不如硫酸钾。要防止暴沸要防止暴沸 加硫酸铜加硫酸铜

10、作为催化剂。还可以作消化终点作为催化剂。还可以作消化终点指示剂、蒸馏时碱性指示剂。还可以加氧化汞、指示剂、蒸馏时碱性指示剂。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。 加氧化剂加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。物氧化速度。凯氏定氮法注意事项凯氏定氮法注意事项图：常量凯氏定氮消化及蒸馏装置图：常量凯氏定氮消化及蒸馏装置 a a消化装置消化装置 b b蒸馏吸收装置蒸馏吸收装置1 1、装置的气、装置的气密性密性2 2、何时加碱、何时加碱3 3、火候控制、火候控制4 4、难消化的、难消化的 对策对策5 5、

11、停止蒸馏、停止蒸馏自动回流消化蒸馏仪自动回流消化蒸馏仪2. 蒸馏与吸收蒸馏与吸收消化液消化液 + 40%氢氧化钠，加热蒸馏，放出氨气。氢氧化钠，加热蒸馏，放出氨气。 “以奈氏试剂以奈氏试剂”检查。检查。同时用同时用4%硼酸吸收硼酸吸收Nessler试剂，试剂，K2（HgI4）检验检验NH4+离子，析出黄色或红离子，析出黄色或红棕色沉淀。棕色沉淀。3. 滴定滴定l 用用HCl滴定滴定l 用混合指示剂（甲基红用混合指示剂（甲基红+溴甲酚绿或亚甲基兰溴甲酚绿或亚甲基兰+甲基红）甲基红） 终点：蓝色终点：蓝色微红色微红色计算：计算：0CVV0.01401%F 100m （）蛋蛋白白质质（ ）F要根据样

12、品来源定要根据样品来源定 说明及注意：说明及注意：本法可应用于各类食品中蛋白质含量测定（粗本法可应用于各类食品中蛋白质含量测定（粗蛋白质）蛋白质）。结果准确，但费时。结果准确，但费时。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。同时作一空白试验，从消化开始到滴定同时作一空白试验，从消化开始到滴定。消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。的情况下消化不完全而造成氮损失。GB5009.5 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用消

13、化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。其消化完全。 样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。意控制热源强度。 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入瓶冷却，加入30

14、过氧化氢过氧化氢 23 m1 后再继续后再继续加热消化加热消化。 般消化至呈透明后，继续消化般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸等时，需适当延长消化时间（如氨酸、色氨酸、酪氨酸等时，需适当延长消化时间（如大豆粉）。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，大豆粉）。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。但含铁量多时，呈较深绿色。蒸馏装置不能漏气。蒸馏时，加热火力要稳定，否则蒸馏装置不能漏气。蒸馏时，加热火力要稳定，否则将发生倒吸

15、现象。将发生倒吸现象。(NH4)2SO4 检验蒸馏前加蒸馏前加NaOH要足量，溶液应变为深蓝色或要足量，溶液应变为深蓝色或黑褐色黑褐色（Cu（OH）2、CuO、铜氨离子），如、铜氨离子），如颜色不变可能碱不够颜色不变可能碱不够 。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸管口，再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。收液倒吸。H3BO3吸收液的温度不应超过吸收液的温度不应超过40，否则对，否则对NH3的吸收作用减弱而造成损失。的吸收作用减弱而造成损失。 （二）微量凯氏定氮法（二）微量凯氏定氮法1、原理、步骤及适用范

16、围同前、原理、步骤及适用范围同前2、与常量法不同点：、与常量法不同点：样品量、试剂用量样品量、试剂用量 减少减少加入硼酸量加入硼酸量由由50 ml 10 ml,滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L ,可用微量滴定管。可用微量滴定管。3、蒸馏装置见下图、蒸馏装置见下图 。保持保持酸性酸性改良式微量凯改良式微量凯氏定氮装置氏定氮装置 （三）自动凯氏定氮法（三）自动凯氏定氮法1 1、原理及适用范围同前原理及适用范围同前 2 2、特点：特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。外线加热的消化炉。（2）

17、快速：一次可同时消化）快速：一次可同时消化8个样品，个样品，30分钟可消分钟可消化完毕。化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成分钟完成1个样。个样。如何测定蛋白氮？如何测定蛋白氮？ 先把非蛋白质的含氮物与蛋白质分开。一般多先把非蛋白质的含氮物与蛋白质分开。一般多采用沉淀剂（采用沉淀剂（CuSO4 + NaOH，或三氯乙酸，或三氯乙酸 ），），将蛋白质沉淀析出，经过过滤（或离心分离），将蛋白质沉淀析出，经过过滤（或离心分离），将沉淀物再用凯氏法测定

18、含将沉淀物再用凯氏法测定含N量。量。 马铃薯含非蛋白氮多。马铃薯含非蛋白氮多。乳中非蛋白氮的测定？乳中非蛋白氮的测定？ 二、双缩脲法二、双缩脲法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。要大仪器，但费时间，有环境污染。 快速方法：快速方法： 双缩脲法双缩脲法 紫外分光光度法紫外分光光度法 染料结合法染料结合法 水杨酸比色法水杨酸比色法 红外光谱法红外光谱法 考马斯亮蓝染料比色法考马斯亮蓝染料比色法 蛋蛋白白质质染染料料（过过量量）蛋蛋白白质质染染料料复复合合物物染染料料（余余）样品消化转化为铵样品消化转化为铵盐

19、后，在一定条件盐后，在一定条件下与水杨酸钠和次下与水杨酸钠和次氯酸钠生成蓝色化氯酸钠生成蓝色化合物，合物，660nm660nm比色。比色。 在酸性溶液中在酸性溶液中与蛋白质结合染与蛋白质结合染色，色，620nm620nm吸收。吸收。快、灵敏，干扰快、灵敏，干扰较少。较少。 1.原理原理 脲（尿素）脲（尿素）NH2CONH2 加热至加热至150160时，两分时，两分子缩合成双缩脲。子缩合成双缩脲。NH2CONHCONH2 + NH3NH2CONH2 + NH2CONH2 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫红色络合物，这种反双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫红色络合物，这种反应叫应叫双缩脲反应双缩脲反

20、应。 蛋白质分子中含有肽键蛋白质分子中含有肽键 CONH ，与双缩脲结构相，与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（定含量。（560nm）与蛋白质分子量及氨与蛋白质分子量及氨基酸成分无关基酸成分无关配合物：双缩脲铜钠氢氧化物配合物：双缩脲铜钠氢氧化物 注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化样品不用消化可直接用粉样，振荡、显色后离心。可直接用粉样，振

21、荡、显色后离心。 2.方法特点及应用范围方法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中常用。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉中常用。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。类等样品测定。 3.操作方法：操作方法：采用凯氏法测出结果的蛋白质样采用凯氏法测出结果的蛋白质样品为标准样绘标准曲线品为标准样绘标准曲线。三紫外吸收法三紫外吸收法 1 1原理：利用蛋白质的特有基团，原理：利用蛋白质的特有基团，R R（ NH NHCHCHCOCO） 对紫外光有吸收作用，在对紫外光有吸收作用，在280 nm280

22、nm下，吸光度下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系。与蛋白质浓度成直线关系。2 2适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。素多，故在食品分析领域应用不广泛。3 3操作：用凯氏法测得结果的同类样品作标样做操作：用凯氏法测得结果的同类样品作标样做标准曲线。标准曲线。测牛乳测牛乳 冰醋酸冰醋酸四、分光光度法四、分光光度法 GB5009.5-2010 44.8,4003,52,6pHNHnm 乙酰丙酮、甲醛乙酰丙酮、甲醛消化黄色物消化黄色物二乙酰二甲基-1, 4-二氢化吡啶二乙酰二甲基-1, 4-二氢化吡啶检出限 5 g检出限 5

23、g五、燃烧法五、燃烧法 GB5009.5-2010 快快第五节第五节 氨基酸的定性测定（自学）氨基酸的定性测定（自学）利用各种显色反应（利用各种显色反应（134138页）页）一、氨基酸的一般显色反应一、氨基酸的一般显色反应 茚三酮法、吲哚醌法和邻苯二甲醛法。前二种是经典的常茚三酮法、吲哚醌法和邻苯二甲醛法。前二种是经典的常用显色法，后一种是近年来发展起来的荧光显色法。用显色法，后一种是近年来发展起来的荧光显色法。1.1.茚三酮法茚三酮法 氨基酸或蛋白质能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物。氨基酸或蛋白质能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物。2 2. .吲哚醌法吲哚醌法 各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同

24、颜色，因此可借此辩各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可借此辩认氨基酸。认氨基酸。3 3. .邻苯二甲醛法（最灵敏）邻苯二甲醛法（最灵敏） 邻苯二甲醛在邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适的激发光和发射光波长分别为作用产生荧光化合物，最适的激发光和发射光波长分别为340nm和和455nm。在手提式紫外灯。在手提式紫外灯(254/365)下观察。下观察。 各种氨基酸显现的荧光强度不同。各种氨基酸显现的荧光强度不同。二、个别氨基酸的显色反应二、个别氨基酸的显色反应利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反应定性氨基酸。

25、可利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反应定性氨基酸。可应用于纸层析和纸电泳显色。应用于纸层析和纸电泳显色。 精氨酸，胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和羟赖氨精氨酸，胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和羟赖氨酸、羟脯氨酸酸、羟脯氨酸, ,色氨酸、酪氨酸、酪氨酸和组氨酸。色氨酸、酪氨酸、酪氨酸和组氨酸。第六节第六节 氨基酸定量测定氨基酸定量测定一氨基酸的一般定量测定一氨基酸的一般定量测定（一）甲醛滴定法（一）甲醛滴定法 1.1.原理：原理：氨基酸本身有碱性氨基酸本身有碱性 NHNH2 2 基，又有基，又有 酸性酸性COOHCOOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，基，成中性内盐，加

26、入甲醛溶液后，与与NHNH2 2结合，碱性消失，再用强碱来滴定结合，碱性消失，再用强碱来滴定COOHCOOH基。基。HCHONaOH2RCHCOOHRCHCOOHRCHCOONaNCH 22 | | | N H N = C H （有多种写法）（有多种写法） 2 2、测定、测定 适量样品于适量样品于100ml100ml容量瓶中（含氨基酸约容量瓶中（含氨基酸约20mg20mg） 水水定容定容 取取20.0ml20.0ml于烧杯中，加于烧杯中，加60ml60ml水水 用用0.05mol/LNaOH0.05mol/LNaOH滴至滴至pH8.2pH8.2（此体积可供计算总酸含量）（此体积可供计算总酸含量

27、） 加加10.0ml10.0ml中性甲醛中性甲醛 NaOHNaOH滴至滴至pH 9.2pH 9.2，记录消耗体，记录消耗体积积V V1 1。 空白试验：空白试验：80ml80ml水水 NaOHNaOH调至调至pH8.2 pH8.2 加加10.0ml10.0ml中中性甲醛性甲醛 NaOHNaOH滴至滴至pH9.2pH9.2，耗，耗V V0 0mlml。C0.014%10020m100 1 10 0（V V - -V V ）氨氨基基酸酸态态氮氮（ ）用酸度计电极的选择？ 3、说明、说明本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。量测定。固样先粉碎，称量后

28、用水萃取约半小时（固样先粉碎，称量后用水萃取约半小时（50水浴）。水浴）。铵盐的存在使结果偏高，因其也与甲醛作用产铵盐的存在使结果偏高，因其也与甲醛作用产生酸。生酸。也可用指示剂指示终点（中性红、百里酚酞），也可用指示剂指示终点（中性红、百里酚酞），但准确度稍差，对深色样品要用活性炭脱色，但但准确度稍差，对深色样品要用活性炭脱色，但芳香族氨基酸易被吸附。芳香族氨基酸易被吸附。 同时取两份样：同时取两份样： + + 中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和样液中其它酸性物质。和样液中其它酸性物质。pH6.8pH6.88.08.0 + + 百里酚酞百里酚酞+ + 中性

29、甲醛中性甲醛+ NaOH+ NaOH 滴，中和了滴，中和了 样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和。样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和。pH9.4pH9.410.6 (10.6 (淡蓝色淡蓝色) ) 二者之差可计算氨基酸含量。二者之差可计算氨基酸含量。（二）茚三酮比色法（二）茚三酮比色法1、原理：、原理：氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（脯氨酸反应成黄色），可用生成蓝紫色化合物（脯氨酸反应成黄色），可用吸光光度法测定，吸光光度法测定，=570nm。2 2、测定：样品、测定：样品 水提取氨基酸，活性炭脱色（水提取氨基酸，活性炭脱色（），），

30、过滤过滤 分取澄清液于分取澄清液于25ml25ml比色管中比色管中 加茚三酮，加茚三酮，pH8.04pH8.04磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 水浴加热水浴加热15min 15min 迅速冷却，迅速冷却，水定容水定容 静置静置15min 15min 测测A A570570，空白为参比。同时作，空白为参比。同时作标准曲线，氨基酸标液用某一干燥的氨基酸如异亮氨酸标准曲线，氨基酸标液用某一干燥的氨基酸如异亮氨酸配制。配制。3 3、结果：氨基酸含量（、结果：氨基酸含量（mg/100gmg/100g）以所用标准氨基酸计）以所用标准氨基酸计 二个别氨基酸的定量测定二个别氨基酸的定量测定介绍了介绍了8种氨基酸的定

31、量测定方法种氨基酸的定量测定方法见见P147155第七节第七节 氨基酸的分离与测定氨基酸的分离与测定 一薄层色谱法（一薄层色谱法（TLCTLC法）法）Thin Layer ChromatographyThin Layer Chromatography简介：简介： 一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层

32、析。它的应用范围层上进行，所以称为薄层层析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。残留量、黄曲霉毒素等。（一）原理：（一）原理： 取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的作用，同一物质具有相同的R Rf f值，不同成分则有不值，不同成分则有不同的同的R Rf f值，因而各种氨基酸可达

33、到彼此分离的目的。值，因而各种氨基酸可达到彼此分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。其含量。 R Rf f = a / b = a / bab样点样点溶剂前沿溶剂前沿点样原点点样原点l优点：优点： 展开时间短，一般在展开时间短，一般在20203030分钟，展开距离通常只需分钟，展开距离通常只需10 cm10 cm，且分离效果好。，且分离效果好。 层析后得到的斑点小而清晰。层析后得到的斑点小而清晰。 能够使用多种显色剂。能够使用多种显色剂。 点样量少