Chap12重组与修复

1、Chapter 12 重组与修复1 1 重组的分子基础重组的分子基础2 2 转座与转座因子转座与转座因子 3 DNA3 DNA损伤的修复损伤的修复1 1 重组的分子基础重组的分子基础 变异是生物进化的原材料,变异的来源是基变异的来源是基因突变和基因重组；因突变和基因重组； 基因重组改变了染色体上基因的组成和排列顺序；一、遗传重组的类型：一、遗传重组的类型：（一）、同源重组（一）、同源重组(homologous recombination): 发生在DNA的同源序列之间。有重组热点, 而异染色质及其附近区域很少发生重组.真核生物：减数分裂发生于同源染色体的非姊妹染色单体之间。细菌及某些低等真核生

2、物的转化、转导、接合，某些病毒的重组都属于这一类。 E. coli的同源重组需要RecA蛋白, 故又称依赖RecA重组.（二）、位点专一重组（二）、位点专一重组(site-specific recombination): 常见于原核生物，直接在专一序列之间配对而发生重组,两个DNA并不交换对等的部分，而是一个DNA分子整合到另一个DNA分子中，又称整合式重组。 如噬菌体在att位点整合到细菌基因组中，不需要RecA蛋白参与。P P att site B B Bacterial chr gal bio att site P B B P bio gal Prophage/lysogen Excis

3、ion ( int + xis IHF) Integration ( int + IHF) 噬菌体通过位点专噬菌体通过位点专一性重组整合到细一性重组整合到细菌基因组中菌基因组中。 细菌上的附着点称为细菌上的附着点称为attBattB，由，由BOBBOB组成组成噬菌体上的附着点称噬菌体上的附着点称为为attPattP，由，由POPPOP组成组成（三）、（三）、异常重组 属于非同源重组范畴，完全不依赖于序列间的同源性而使一段DNA序列插入到另一段中。但在形成重组分子时往往是依赖于DNA复制而完成重组过程，因此又称为复制性重组(replicative recombination)。如转座子一般的同源

4、重组模型需能够解释：1. DNA双链的断裂、交换和重连 2. 交互性3. 一般性 4. 精确性 5. 基因转变二、同源重组的分子机制 A A a a 重组不仅有正常重组不仅有正常的交互方式，偶的交互方式，偶而也有不规则的而也有不规则的非交互方式。非交互方式。 吡哆醇依赖型突变：吡哆醇依赖型突变： pdxp pdxp pdxpdx 585个子囊个子囊重组后应该同时出现野生型和双突变型孢子对链孢霉VB6突变型的杂交试验(Mitchell,1955)基因转变频率比这些位点的正常突变率高得很多，好象是一个基因转变成为另一个基因，其邻近的基因仍然是2:2分离 基因转变(gene conversion):

5、 细胞减数分裂生成4个子细胞时, 如果3个子细胞得到了一个亲本的等位基因, 只有一个子细胞得到了另一个亲本的等位基因, 这种亲本之间等位基因被调换的现象称为基因转变。基因转变是通过重组和DNA修复所造成的。基因转变的特点 基因转变的频率很低； 基因转变与遗传重组有关，因为基因转变与遗传重组都发生在同样两个染色单体的子囊比例高达90%；一个基因发生基因转变时常伴随着它两旁的基因发生重组。 基因转变的类型一个染色单体相当于一个DNA分子，转变可以影响一个DNA分子的双链，也可仅仅影响其中的一条链。 染色单体转变（chromatid conversion):减数分裂的4个产物中只有一个发生转变，出现

6、6:2分离； 半染色单体转变（half-chromatid conversion)：减数分裂的4个产物中有一个产物的一半或两个产物的各一半发生转变，出现5:3分离或3:1:1:3分离。基因分离发生在减数分裂后的有丝分裂中，即减数后分离。 一些学者提出不同的重组模型，其中Holliday提出的一个重组模型受到多数学者的支持，以后又经过一些学者和Holliday本人的修改。这个模型叫做异源或杂种DNA模型(heteroduplex or hybrid DNA model)，适用于原核类和真核类。遗传重组的Holliday模型 (1) 5 A B 3 (8) A 3 5 B3 55 a b 3 两臂

7、旋转 联会 (2) 5 A B 3 b 3 5 a3 55 a b 3 (9) A 酶切 B (3) 5 A B 33 5 b 3 5 a5 a b 3 游离端移动联会 (4) 5 A B 3 (10) A A 3 5 B B 3 55 a b 3 游离端交叉连接 b b(5) 5 A B 3 a a3 53 5 (11) A B A b5 a b 3 形成单链交叉 a b a B(6) 5 A B 33 5 3 5 A B A b 5 a b 3 分支点移动(7) A a b a B B a b 图 238 Holiday 重组模型。1. 同源的非姊妹染色体的DNA配对 2. 同源非姊妹染色

8、单体DNA中两个方向相同的单链在DNA内切酶的作用下, 在相同位置上同时切开。34. 单链的游离端交换位置 5. 单链连接，形成交单链连接，形成交联桥结构（联桥结构（cross-bridged structure）6.交联桥的位置可以靠拉交联桥的位置可以靠拉链式活动链式活动,沿着配对沿着配对DNA分子移动分子移动桥迁（桥迁（Bridge migration），形成较大），形成较大片段的异源双链区。这种片段的异源双链区。这种结构又称为结构又称为Holliday 中间中间体体 (1) 5 A B 3 (8) A 3 5 B3 55 a b 3 两臂旋转 联会 (2) 5 A B 3 b 3 5 a

9、3 55 a b 3 (9) A 酶切 B (3) 5 A B 33 5 b 3 5 a5 a b 3 游离端移动联会 (4) 5 A B 3 (10) A A 3 5 B B 3 55 a b 3 游离端交叉连接 b b(5) 5 A B 3 a a3 53 5 (11) A B A b5 a b 3 形成单链交叉 a b a B(6) 5 A B 33 5 3 5 A B A b 5 a b 3 分支点移动(7) A a b a B B a b 图 238 Holiday 重组模型。 (1) 5 A B 3 (8) A 3 5 B3 55 a b 3 两臂旋转 联会 (2) 5 A B 3

10、 b 3 5 a3 55 a b 3 (9) A 酶切 B (3) 5 A B 33 5 b 3 5 a5 a b 3 游离端移动联会 (4) 5 A B 3 (10) A A 3 5 B B 3 55 a b 3 游离端交叉连接 b b(5) 5 A B 3 a a3 53 5 (11) A B A b5 a b 3 形成单链交叉 a b a B(6) 5 A B 33 5 3 5 A B A b 5 a b 3 分支点移动(7) A a b a B B a b 图 238 Holiday 重组模型。79.绕交联桥旋转180度，出现中空的十字构型1011通过两种方式切断DNA单链以消除交联桥

11、,恢复两个线形DNA分子 ，如左右切断, 形成的线性分子是非重组体(AB与ab); 如上下切断, 在形成的线性分子中, 其异源双链异源双链DNA的两侧标记基因是重组体(Ab与aB).Holliday 模型的十字构型中间体的电镜照片 g+ ACAGT g ACATT TGTCA TGTAA则所形成的异源双链区域为: ACAGT TGTAA ACATT TGTCA 不管Holliday结构断裂是否导致旁侧标记基因的重组, 它们都含有一个异源双链DNA区, 所以如果杂交的亲本为 错配碱基由核酸外切酶切除,留下单链缺口，由DNA聚合酶合成互补片段，填补缺口，再由连接酶把新合成的短链以共价键连接上去，成

12、为完整的核苷酸链，完成修复过程。异源异源DNA链的两种校正方式链的两种校正方式G(+)A()GCTA切除A,野生型g+切除G,突变型g-基因转换的起源 错配碱基G/A校为G/C, C/T校为A/T, 产生4:4分离;G/A或C/T校为G/C或C/G, 产生6:2或2:6分离;G/A校为G/C, C/T未校正, 产生5:3或3:5分离;G/A或C/T均未校正, 产生3:1:1:3分离. A g+ A g+ a g+ A g+ 全部校正 4 : 4 a g+ 6 :2 a g 正常分离 正常分离 a g A g+ 未校正 A g+ A g+ a g A g+ a g 部分 a g+ 校正 a g

13、a g+ a g+ 5 : 3 A g+ A g+ 异常 a g+ 4 : 4 分离 A g+ 异常分离 A g A g a g a g A g a g a g a g 图 23-7 基因转变和减数后分离2 转座与转座因子 有些基因在染色体上的位置是可以移动的, 这类基因称为可移动基因，也可称为转座元件或转座因子(transposable element). 基因可移动概念的提出 McClintock (1951), 玉米粒颜色的遗传: 正常：有色 有色 异常：有色 色斑 有色 无色McClintocks microscope and ears of corn on exhibition at

14、 the National Museum of Natural History.Barbara McClintock (1902-1992)原核生物中的转座因子：插入序列（IS）转座子（Tn）真核生物中的转座因子：玉米的Ac-Ds系统果蝇的P因子 插入序列(inserted sequence ，IS): 仅含有转座酶基因的简单转移序列，本身没有任何表型效应，长度多在7001500bp左右. 由末端反向反向重复序列(IR,inverted repeat sequence), 转座酶基因组成. 插入基因组中时, 在靶位上生成正向正向重复序列(DR).IS 长度/bp 末端IR 靶位DR 插入选择I

15、S1 768 23 9 随机IS10 1329 22 9 TNAGCN IS50 1531 9 9 热点常见的IS结构 带有转座酶基因等必需基因及抗药性等与转座无关基因的转座因子. 结构特征: 两端具有同向或反向插入序列, 同时, 两端的IS可能相同或不同. 常见的转座子： 转座子 长度/bp 抗性标记 两端序列 取向 Tn 5 5700 KanR IS50 反向 Tn10 9300 TetR IS10 反向 Tn 9 2500 CamR IS1 同向 复合转座子(transposon, Tn)转座子的遗传学效应转座子的遗传学效应 1引起插入突变； 2插入位置上出现新基因； 3、切离：造成回复

16、突变或染色体畸变。 4造成同源序列的整合。 5产生新的变异,有利于进化。由转座子引起的染色体由转座子引起的染色体DNA缺失和倒位缺失和倒位 玉米的Ac-Ds系统玉米中的Ac-Ds系统（9染色体短臂）该系统的控制元件可分为两类：自主移动的调节因子Ac ，能合成转座酶，并支配受体因子移动，4.5 kb, 5个exon, 编码转座酶.非自主移动的受体因子Ds ，不产生蛋白，0.54.0 kb, 与Ac有同源序列, 插入引起色素不能合成.C AcC DsC Ds AcThe relationship of Ac/Ds in the control of the elements and mosaic

17、color of maize. The seed in 10 is colorless, there is no Ac element present and Ds inhibits the synthesis of colored pigments called anthocyanins. In 11 to 13, one copy of Ac is present. Ds can move and some anthocyanin is produced, creating a mosaic pattern. In the kernel in panel 14 there are two

18、Ac elements and in 15 there are three.P型型（父本贡献的，（父本贡献的，paternal contributing）M型型（母本贡献的，（母本贡献的，maternal contributing） P品系（品系（paternal strains）M品系品系 ( maternal strains) 果蝇的P因子 M果蝇 P果蝇 不育 M果蝇 P果蝇 可育杂种劣育杂种劣育（hybrid dysgenesis）P因子因子（1） P因子全长因子全长2907bp，两端有，两端有31bp的反向的反向重复序列。重复序列。开放阅读框 ORF 0ORF1ORF2ORF3 内含

19、子 1 2 3（2）P因子有因子有4个编码区，个编码区，3个内含子。个内含子。P因子表达差异：体细胞 ORF 0，1，2 66 kD转座阻遏物生殖细胞 ORF 0，1，2，3 87 kD转座酶P型细胞质: 含66 kD转座阻遏物M型细胞质: 不含66 kD转座阻遏物，导致P因子转座和配子败育 P P 含P因子转座阻遏物 P因子不能转移, 可育 P M 含P因子转座阻遏物 P因子不能转移, 可育 P M 不含阻遏物 P因子能转移, 不育雌性雌性M果蝇细胞内缺失转座阻遏蛋白，引起雄性来源染果蝇细胞内缺失转座阻遏蛋白，引起雄性来源染色体上色体上P转座子自由转移，并造成卵细胞败育转座子自由转移，并造成

20、卵细胞败育.有 P 因子转座 P 品系 (PP) 雄性染色体 雌性染色体 P 细胞型 阻遏物 P 因子 P 因子 66KD 阻遏物 抑制所 ORF0 ORF1 ORF2 ORF3 ORF0 ORF1 ORF2 ORF3 66K PM 雄性染色体 雌性染色体 P 细胞型 P 因 子 P 因子 合成转 ORF0 ORF1 ORF2 ORF3 座 酶 87K 杂种不育 MP 雄性染色体 雌性染色体 P 细胞型 阻遏物 无 P 因子 P 因子 66KD 阻遏物 抑制所 ORF0 ORF1 ORF2 ORF3 66K 有 P 因 子转座 图 23-57 杂种不育取决于基因组中 P 因子和不同类型细胞中

21、66KD 阻遏物的相互作用。 (仿 B.Lewin:GENES ,1997, Fig.18.27)无阻遏物(3)插入后在靶插入后在靶DNA序列形成序列形成8bp的正向重复的正向重复序列序列(4)缺失了中间序列而保留两端缺失了中间序列而保留两端IR的的P因子，因子，只要有相应的外显子提供转座酶，就能转座只要有相应的外显子提供转座酶，就能转座(5)P因子可以从原位切离因子可以从原位切离类型 (1) 复制型转座复制型转座 （replicative transposition） (2) 非复制型转座非复制型转座 （nonreplicative transposition） (3) 保留转座保留转座 （

22、conservative tranposition）转座机制转座机制以细菌的转座子为例，说明复制型转座的过程1切开 转座酶有两种功能(1)识别受体靶序列。从5端切开, 产生两个粘性末端。(2)识别自身两边的IR。3切开。 2连接 供体和受体结合成为共联体，以共价链齐头相连,形成两个缺口。 3复制 DNA多聚酶补上缺口,连接酶连接,形成正向重复序列。 供体质粒 受体质粒 共联体 4重组 在特定位点重组。共合体分离成两部分。 转座子是以它的一个复制品转移到另一位置,而在原来位置上仍然保留原有的转座子。 供体质粒 受体质粒 共联体 转座因子的遗传学效应转座因子的遗传学效应 1引起插入突变； 2插入位

23、置上出现新基因； 3、切离：造成回复突变或染色体畸变。 4造成同源序列的整合。 5产生新的变异,有利于进化。3 DNA损伤的修复DNA损伤的修复机制：一. 直接修复二. 切补修复途径三. AP核酸内切酶修复途径四. DNA糖基酶修复途径五. 重组修复作用 1. 概念：在可见光存在的条件下，在光概念：在可见光存在的条件下，在光裂裂合酶作合酶作用下将用下将UV引起嘧啶二聚体分解为单体的过程。引起嘧啶二聚体分解为单体的过程。 一、 直接修复（光复活）光复活）(photoreactivation)光裂合酶（photolyase),由phr 基因编码2. 作用过程：作用过程：*光复活是原核生光复活是原核

24、生物中的一种主要修物中的一种主要修复形式。复形式。1.概念概念:不需要光照, 而是经过一系列修复酶将损伤切除并修补的过程, 称暗修复。暗修复。2.特点：消除由特点：消除由UV、电离辐射和化学诱变剂引起、电离辐射和化学诱变剂引起的损伤。的损伤。二. 切补修复（暗修复）暗修复）例： 着色性干皮症是由于缺乏切补修复酶造成的遗传性缺陷.在E.coli中的切除修复系统损伤：突变的碱基错配或改变DNA结构剪切：内切酶在损伤碱基位点两侧剪切切除：外切酶除去切口间的DNA合成：DNA pol 合成取代DNA连接酶封闭缺口Uvr系统在修复各阶段中的作用UvrAB识别损伤； UvrBC在DNA上切一缺口； Uvr

25、D使被标记区解旋三. AP核酸内切酶修复途径 单个嘌呤或嘧啶脱去后的位点称AP位点, 细胞中自发产生的AP位点的频率很高. 由AP核酸内切酶切断DNA上的磷酸二酯键. 然后再启动外切、聚合外切、聚合和连接连接酶系统进行切补修复过程. Nucleotide containingA damaged base 5 3 A ATCGTAGATAGCTAA TACCATCTATCGATT 3 5 Glycosylase enzyme recognizes damaged base and cleaves bond 5 3 between base and sugas, A ATCGTAGATAGCTAA releasing the base.TACCATCTATCGATT 3 5 AP endon