高效异养硝化细菌分离筛选及多样性分析

1、高效异养硝化细菌的分离筛选及多样性分析-农学论文高效异养硝化细菌的分离筛选及多样性分析胡 甜1,江林峰1,陈青云1,余知和1,毛 涛2，李 利1(1.长江大学生命科学学院/荆楚特色食品研发中心，湖北 荆州4 3 4 0 2 5; 2.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉4 3 0 2 2 3 )摘要：采用生长曲线指导的富集培养法，从生活污水排放渠中分离筛选出高 效异养硝化细菌，并对其多样性进行了分析。结果显示，从分离得到的27株异 养硝化细菌中筛选出6株高效菌株Ni 12、 Ni1 8、Ni2 5、Ni 2 7、Ni3 1和N i34，其48h氨氮去除率分别为88.9%、7 6.6%、87.

2、7%、93.1%、99.2% 和 9 1.4% ;结合菌落形 态、革兰氏染色反应、扫描电镜观察和16SrDNA序列分析，发现菌株的种类较为丰富，初步确定Ni12和Ni18为节杆菌属 (Arthrob acter) ， Ni2 5 和 N i3 1为产碱杆菌属(Alcaligene s)，Ni2 7 为无色杆菌属 (Achromobacter) ， Ni34 为 芽抱杆菌属(Bacillus)。该结果可为高效异养硝化菌的分离筛选及其 多样性分析提供参考。关键词：异养硝化；节杆菌属(Arthrobacter);产碱杆菌属 (Alcaligenes) ;无色杆菌属(Achromobacter) ;

3、芽 抱杆菌属(Bacillus)中图分类号：X 7 0 3文献标识码： A文章编号：0439 8 114 ( 2 0 15 )05 1181-05DOI : 10.14088/ki.issn0439-8114.2015.05.039收稿日期：2014 10 09基金项目：湖北省科技支撑计划项目(2013ECE009) ;湖北省高 校青年教师深入企业行动计划项目(XD2014068) ;湿地生态与农业利 用教育部工程研究中心开放基金项目作者简介：胡 甜(1 9 9 3 )，女，湖北仙桃人，在读本科生，(电话)1 5 1 7 1 1 3 4 2 0 9 (电子信箱)2466475678;通信作者，

4、李 禾0( 1 9 8 3 )，讲师，主要从事食品微生物和环境微生物教学和研究，(电话)0 7 1 6 8 0 66 7 12(电子信箱)1 ily2012。随着工农业生产的发展和人民生活水平的提高，未经适当处理的含氮废水，如生活污水、工业、种植业及禽畜养殖业废水等，大量排放入江河湖泊，造成了 越来越严重的水体富营养化问题，危害到农业、渔业、旅游业等诸多行业，对饮 水卫生和食品安全也构成了巨大威胁。 近年来，国内外在脱氮微生物菌株的筛选 和培育研究方面非常活跃，一些异养硝化菌、好氧反硝化菌、自养反硝化菌、厌 氧氨氧化菌等非传统脱氮微生物不断被发现1 -4，为研究开发经济有效的 氮污染物净化技术

5、提供了新的理论和思路。异养硝化菌是指在好氧条件下能将氨氮或还原态有机态氮氧化成羟胺、亚硝酸盐和硝酸盐的一类微生物5。异养硝化微生物的发现，是对传统硝化理论 的丰富与突破，特别是一些异养硝化微生物同时具有好氧反硝化的特性，可实现同步硝化反硝化的全新脱氮工艺6。因此，异养硝化微生物的重要性日益受 到关注7 10。异养硝化微生物种类繁多，分布于藻类、放线菌、真菌和细菌中7。由于其遗传背景的差异性，不同的异养硝化微生物的生长及硝化特点都有所不同60并且异养硝化菌可以利用的基质范围广泛，如铵、胺、酰胺、N-烷基 羟胺、肟、氧肟酸及芳香硝基化合物等，这使得异养硝化机理到目前仍不清楚， 其代谢途径也未被确定

6、和证实11。从自然环境中分离不同的异养硝化菌， 对研究异养硝化途径和异养硝化微生物多样性，以及开发新型高效脱氮工艺具有 重要意义。为此，本研究通过四级富集培养法从生活污水排放渠中分离筛选高效 异养硝化细菌，分析其多样性，为异养硝化菌的理论研究和应用研究提供材料。1 材料和方法1.1 环境样品采集排污沟渠距水面10 cm处的水样以及其附近10 cm深度的土样。 采样后立即用于异养硝化细菌的筛选。19 严并甘1.Z 培养基富集培养基(pH 7.0):C6H5O7Na35.00 g，(NH4)2SO4 1.24 g，KH2PO4 1.00 g，Na2HPO4 7.8 5 g，NaCl 0.50 g,

7、MgSO4 0.0 5 g,微量元素溶液1 21 mL，补充去离子水至1 L。用于异养硝化菌的富集培养。异养硝化培 养基 (pH 7.0):C6H5O7Na37.5 0 g，(NH4)2SO 40.6 6 g,Na2HPO4 3.7 g，其余成分同富集培养基。固体培养基添加1.5%的琼脂。用于异养硝化菌的分离纯化及氨氮去除能力研究。牛肉膏蛋白胨培养基(pH 7.2):牛肉膏5 g,蛋白胨10 g，N aCl 5 g,补充去离子水至1 L。固体培养基添加1 .5%的琼脂。用于 菌株的形态观察、保存及活化。1.3 异养硝化菌的筛选1.3.1 富集培养 取土样10 g或水样10 mL加入到9 0 m

8、L含有玻璃珠的无菌水中，震摇3 0 min使样品充分分散。取上清5 mL接种 到9 5 mL富集培养基中，于30 C,160 r/mi n摇床震荡培养，每 隔2 h测定富集液的0D 6 0 0nm绘制生长曲线，在稳定期初期转接2 0mL培养液至8 0 mL新鲜的富集培养基中继续培养，连续转接4次。富集期 间定期检测培养液中氨氮含量，若氨氮显著减少，表示富集液中含有硝化微生物， 可用于后续分离纯化试验。1.3.2 分离纯化取富集培养液作梯度稀释，涂布固体异养硝化培养 基平板，30 C培养3 d,挑取不同形态的菌落接种到液体异养硝化培养基中，3 0 C震荡培养3 6 h，检测培养液中氨氮的含量，将

9、氨氮去除率较高的培养 液再次稀释涂布平板进行分离和筛选，直到得到氨氮去除效果较好的纯培养菌 株。1.4 菌株的多样性分析1.4.1 形态观察 将分离得到的菌株涂布牛肉膏蛋白胨平板，30 C 培养2 d，观察菌株的菌落形态、革兰氏染色反应以及扫描电子显微镜下的细胞形态。1.4.2 16S rDNA的PCR扩增、测序和系统发育分析用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA作为模板，采用通用引物13 27F(5AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3)和 1492R(5TACCTT GTT ACG ACT T3)进 行16S rDNA序列的PCR扩增。扩增体系(50L) : 1

10、0X PfBuffer 5 yL, 2.5 mmol/L dNTP 2L,10 ymo1/L引物各2.0 yL, 基因组DNA 50 ng,P fu DNA聚合酶 2 U, FddH2O 至5 0 yLPCR 反应条件：94C5min;94C 3 0s,55 C 30s,72C 2 min,28 个循环；72 C 8 min0PCR产物的纯化和测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。测 序所获序列在NCEI核酸数据库中进行BLAST比对分析，下载部分相似性高的序列及一些常见的异养硝化细菌和自养硝化细菌的16SrDNA序列，利用MEGA 5. 1软件中基于Kimura 2parameter模

11、型的 Neighbour joining (NJ)邻接法构建系统发育树14。1.5 氨态氮(N H4+ N)的检测定性检测：取6 0 0 yL待测样品于比色板上，滴加50yL钠氏试剂，呈黄色，则培养液中含氨氮，颜色越深，氨氮含量越高。定量检测：采用国家环境保护标准水质氨氮的测定一钠氏试剂分光光度法(HJ 535 2009)。2 结果与分析2.1 菌株的分离纯化通过生长曲线指导的四级富集培养得到氨氮残留量较少的培养液，对稀释后 的培养液进行涂布平板分离和连续多次划线纯化， 成功获得具有异养硝化能力的 异养型菌株共2 7株，分别编号为Ni1 1Ni1 13,Ni2 1 Ni2 9,Ni3 1Ni3

12、 5o2.2 菌株的筛选将分离纯化后的菌株在异养硝化培养基中培养3d,各取600 yL培养液于白色的比色板上，用定性检测方法检测氨氮的去除情况， 结果见表1。由表 1可知，菌株Ni 12、Ni1 8、Ni2 5、Ni2 7、Ni3 1、 N13-4培养液用纳氏试剂显色后颜色较浅，表明培养液中氨氮残留量较少， 这6株菌株的异养硝化能力较强。 |异葬和乞创璨的第氐试刑色反即*： th = yNil-i帕弋Nd-2*Ki2-7+Ml-3+-4+Ml-VZ+2.3 菌株的氨氮去除率将筛选得到的6株异养硝化能力较强的菌株接种于液体异养硝化培养基中，3 0 C 6 0 r/mi n摇床培养4 8 h,检测

13、氨氮浓度的变化， 结果显 示6株菌株的氨氮去除效果较好（表2）,氨氮去除率为7 6.6%99. 2%。闱株舉勺術I-2MJil-S76.62-5B7.7NS2-7町WJ2NLJ-49L42.4 菌株的多样性分析2.4.1 形态学分析 将活化后的菌株在牛肉膏蛋白胨培养基中30C培养2 d后，分别观察其菌落形态、菌体细胞形态和革兰氏染色反应。结果显示，6株菌株在菌落大小、颜色、形状、边缘、表面光泽、透明程度、以及菌体，呈现出较好的多样性。细胞大小和形态方面的差异明显（表3,图1和图2）A3召廉耳莽确忧榄力较弹揀前崔态特谊掙M血片用齐誚吒歯料的薦乂也否年潘拮詩补耶兰民冬芭僧佯牺牺幣土NB眉鼠曲瓶&K

14、AJK.占也洋.4、进畸、礼此色fefUt*凸亂边軌觀i光m.右电斯，這瞄、壬门叵fam珀秆強NU-5剑珂，壯虻.匕集签序.理壬芝!_0屯潭半芳叫，豊邑艸ffttNU-?期劈*芒程一曲荣嚳卄.世筒吃淆 梧无汎t岂臥乳臼邑wttM3M状干,边（tt叶状*撕联.获卄耦犠,有出埒，卜邊岂WtlKfTJtt:板I盟粮狀.国屮，己題仆整咋.甲制 JtV*.ran点檢片芥萌代曲掃的若摘电碗国2.4.2 16S rDNA序列分析用引物27F和1492R对6株菌株的基因组DNA进行PCR扩增并测序，均得到长约为1.5kb的16S rDNA序列，将所获序列提交GenBank数据库，登录号见表4。用BLAST程序

15、与GenBank中核酸数据库进行同源性分析，发现Nil 2、Ni1 8、Ni2 5、Ni2 7、Ni3 1、Ni34 的16S rDNA 序列分别与 Arthrobactersp. 5118 (JX566636)、Arthrobacter sp. W1(EU339930)、 Alcaligenes faecalis TZQ4 (HQ14362 7.1)、Achromobacter sp. SR4(KC5 77545)、 Alcaligenes faecalis B_IV_2L10(JF710956.1)、Bacillus licheniformis CGMCC2 8 7 6 (GQ 1 4 8

16、 8 1 7.1 )的一致性均达98%以上(表4) 。利用MEGA5. 1软件中基于Kimura2parameter 模型的Neig hbour joining (NJ)邻接法构建系统发育树见图3。从图3可知，6株菌株聚为4个类群，其中Ni 12和Ni 1 8与节杆菌属 (A throbacter)的亲缘关系较近，Ni34与芽抱杆菌属(Eaci llus)的亲缘关系较近，Ni2 7与无色杆菌属 (Achromobac ter)的亲缘关系较近，N12 5和N 13 1与产碱杆菌属 (Alcal igenes )的亲缘关系较近。6性屏养硝址摘搖的同葬忡分析蔺棵納-.建性0苛1-2Ek血z i Jf

17、k 51 IS99.4 rt/jjjLfhia iT-er 耳. VI JNiZ-!KJMI7IB*勒+1询护曲町*r站1乂1闽鹉应Amp*访盘片RJ1 7H4占人“皿卜丁|*血皿心窟2J;U诉fg24#用即lmii i 仁钠二3 小结与讨论传统氮循环理论认为，执行硝化作用的微生物是一群生长缓慢的化能自养型 硝化细菌10。自1 949年Quastel等15以丙酮肟作为选择 性培养基，首次分离获得异养硝化菌株以来，异养硝化微生物和异养硝化作用引 起研究者们的广泛关注。研究发现，与自养硝化细菌相比，虽然异养硝化细菌单 位菌体的硝化活性低，但其生长速率快，在有大量有机物存在条件下，对氧气和 营养物的

18、竞争比自养细菌强，容易成为优势菌，而且异养硝化细菌对高浓度氨氮 的耐受性强10，16，因此异养硝化细菌对污水中氨氮的净化作用不可小 觑。.4円加宀乂w耳l 51 !8i)LAnttuE Uchriu/brwf CGMO： 2816(/1414117.1)Jbiid尸juriWix 17屮I Hijl加丄一气 kjHillM-0.U2严虫岸心儿 l Il 21 in JI7H5*.I iT J塑”域林.t6S rfNA序艸的疾SE左育射本研究在富集培养异养硝化细菌时，用生长曲线指导富集培养的时间，在对 数生长结束后立即进行转接，使自养硝化菌来不及充分生长而快速被淘汰， 从而 增加分离异养硝化菌的

19、成功率。在初筛时，以钠氏试剂为指示剂对氨氮进行定性 检测，在操作上简单快速，可大大提高筛选效率。目前报道的异养硝化细菌有粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis) 17、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutze ri) 18、恶臭假单胞菌(P. putida) 19、醋酸钙不动杆菌 (Acinetobacter calcoaceticus) 1、枯草芽 抱杆菌(Bacillus subtilis) 20 、泛养硫球菌(Thi osphaera pantotropha) 21、球形节杆菌(Arth robacter globiformis) 22、脱氮畐寸球菌(Para co

20、ccus denitrificans) 23 等。通过 16S rDN A序列分析，本研究从1份环境样品中筛选得到4个不同属的高效异养硝化细菌 共6株，结合菌落形态、革兰氏染色反应、扫描电镜观察和16sDNA序列的比对分析，初步确定Ni 12和Ni 1 8为节杆菌属 (Arthrobacter) ,Ni2 5 和N i3 1为产碱杆菌属(Alcaligenes)，Ni2 7为无色杆菌属(Achromobacter), Ni34为芽抱杆菌属(Bacillus)，菌株的种类较为丰富。该结果可为高效异养硝化 菌的获得及其多样性分析提供参考。参考文献：1 ZHAO B, HE Y L, HUGHES

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