微生物药物发酵工艺

1、微生物药物发酵过程微生物药物发酵过程福建省微生物研究所福建省微生物研究所周周 剑剑 （副研究员（副研究员 ） 2014.05.23微生物药物工业生产的组成微生物药物工业生产的组成( (原料药）原料药）发酵分离 菌种 菌种选育菌种分离纯化菌种制备保存 摇瓶种子制备罐上种子制备发酵生产 发酵液预处理 产物提取产物精制纯化微生物药物（一）微生物药物工业生产菌种（一）微生物药物工业生产菌种l工业生产用菌株不同于实验室研究菌株，不但工业生产用菌株不同于实验室研究菌株，不但要求其产物合成能力能够稳定的表达，还应追要求其产物合成能力能够稳定的表达，还应追求产量尽可能的高，作为目标产品的类似物尽求产量尽可能的

2、高，作为目标产品的类似物尽可能的少，发酵产物尽可能的易于提取精制等。可能的少，发酵产物尽可能的易于提取精制等。l在工业生产中，需要对生产菌株不断的纯化、在工业生产中，需要对生产菌株不断的纯化、复壮和改良。复壮和改良。 工业生产菌株应满足的要求：工业生产菌株应满足的要求：能够产生较高浓度的目标产物；能够产生较高浓度的目标产物；微生物药物工业发酵中高浓度产物一般是胞外产物；微生物药物工业发酵中高浓度产物一般是胞外产物；产物便于分离提取；产物便于分离提取；能利用易得廉价原料，如淀粉、糖蜜、甲醇和纤维素物能利用易得廉价原料，如淀粉、糖蜜、甲醇和纤维素物质等；质等；不致病，不产生内毒素；不致病，不产生内

3、毒素；发热量低，需氧低，具备适中的发酵温度和细胞形态，发热量低，需氧低，具备适中的发酵温度和细胞形态，即发酵条件较温和；即发酵条件较温和；容易进行代谢调控。容易进行代谢调控。l菌种的选育菌种的选育 1. 寻找产生新化合物的菌种（略）寻找产生新化合物的菌种（略） 2. 现有微生物药物产生菌种的选育现有微生物药物产生菌种的选育 目的：目的：a. 提高目标产物的产率水平，降低杂质组分含提高目标产物的产率水平，降低杂质组分含量量 b. 提高菌种对工业化生产条件的适应力提高菌种对工业化生产条件的适应力 方法：方法：a. 自然纯化选育自然纯化选育 b. 传统诱变选育（紫外线、诱变剂、离子束）传统诱变选育（

4、紫外线、诱变剂、离子束） c. 代谢调控和条件模型选育代谢调控和条件模型选育 d. 基因工程选育基因工程选育l工业用菌种的分离纯化工业用菌种的分离纯化正常菌退化菌传代传代传代微生物遗传变异是绝对的变异是绝对的，稳定是相对稳定是相对的；退化性的变异是多数的，进化性的变异是少数的。不对工业用菌种加以分离纯化，剔除变异菌，那么通过传代的累积效应，退化变异菌种将占据种群遗传优势。最终导致生产水平的波动和下降。l菌种分离纯化流程菌种分离纯化流程（例）保存菌种涂布平板点种平板斜面稀释涂布单菌落点种接斜面扩增生产能力鉴定斜面斜面l菌种制备保存方式：菌种制备保存方式： 1.短期制备保存短期制备保存 短期制备保

5、存方式主要用于生产用菌种的扩增制备和短时保存。短期制备保存方式主要用于生产用菌种的扩增制备和短时保存。 保证培养物能够短时的保存在常温或者冷藏条件下，随时应用保证培养物能够短时的保存在常温或者冷藏条件下，随时应用 于生产。于生产。 主要包括：菌落平板主要包括：菌落平板 试管试管/茄子瓶斜面茄子瓶斜面 麸皮麸皮/米孢子培养物米孢子培养物 2. 中长期制备保藏中长期制备保藏 中长期制备保存方式主要用于菌种中长期保存，保证菌种的遗中长期制备保存方式主要用于菌种中长期保存，保证菌种的遗 传特性和活力，保证生产菌种有可靠来源。传特性和活力，保证生产菌种有可靠来源。 主要包括：冷冻甘油管保藏主要包括：冷冻

6、甘油管保藏 冷冻干燥管保藏冷冻干燥管保藏 液氮甘油管保藏液氮甘油管保藏 沙土沙土/石蜡管保藏石蜡管保藏 基本原则：低营养基本原则：低营养/干燥干燥/缺氧缺氧/低温低温/密封密封（二）微生物药物发酵生产过程（二）微生物药物发酵生产过程l发酵生产流程概况生产菌种培养摇瓶种子培养一级种子 罐培养二级种子 罐培养发酵罐培养微生物药物的发酵生产包括种子培养和发酵生产两个阶段。种子培养阶段通过连续的扩增培养，获得足够量健壮均一健壮均一的 种子投入发酵生产。发酵生产包括生长期和生产期，生长期仍以菌量的扩增为目的；当营养消耗等条件适宜后，微生物即开始产生目标产物，进入生产期。l发酵种子培养过程发酵种子培养过程

7、迟滞期对数期平台期衰亡期种子生长曲线种龄菌量种子的评价指标：生长健壮旺盛，移入下一级后能迅速生长，迟滞期短菌体稳定均一，生长同步性好菌体总量和生长密度适宜1.无杂菌污染l发酵种子培养的调控发酵种子培养的调控 1. 培养基培养基 碳源、氮源、无机盐、生长因子是微生物生长的四大营养要素。碳源、氮源、无机盐、生长因子是微生物生长的四大营养要素。一般而言，种子配方中一般而言，种子配方中碳碳/氮比要求均衡氮比要求均衡，量以满足生长为宜，量以满足生长为宜，优质有机氮源要有一定比例。碳氮源种类选择上则必须了解菌优质有机氮源要有一定比例。碳氮源种类选择上则必须了解菌种的利用能力，并配合考虑种龄种量和发酵配方中

8、碳氮源组成。种的利用能力，并配合考虑种龄种量和发酵配方中碳氮源组成。 2. 环境因素环境因素 影响菌种生理活性的因素包括了影响菌种生理活性的因素包括了温度、温度、pH、溶氧、渗透压、离、溶氧、渗透压、离子强度子强度等。不同的菌种都有着其最适应的范围，从而进行正常等。不同的菌种都有着其最适应的范围，从而进行正常的生理代谢。的生理代谢。 所有上述因素的选择在种子阶段都应以菌种的生所有上述因素的选择在种子阶段都应以菌种的生长最适条件来进行选择。长最适条件来进行选择。 3. 种子级数的设计种子级数的设计 种子培养级数越多，培养周期越长，过程中可能出现的不稳定种子培养级数越多，培养周期越长，过程中可能出

9、现的不稳定因素越多。在设备条件允许的情况下，应因素越多。在设备条件允许的情况下，应尽可能缩减种子培养尽可能缩减种子培养级数级数，提高每一级培养下菌体的扩增量，保证下一级需要。，提高每一级培养下菌体的扩增量，保证下一级需要。 发酵生产流程发酵生产流程培养基投料溶解移入发酵罐定容调节灭菌前pH值高压蒸汽灭菌降温至培养温度种子液移入调节空气流量、搅拌速度、罐顶压至规定值，开始发酵发酵生长曲线发酵生长曲线迟滞期对数期平台期衰亡期发酵周期生长期生产期次生代谢发酵原理：次生代谢发酵原理：当微生物生长到一定阶段，由于营养减少和有害代谢物积累，使当微生物生长到一定阶段，由于营养减少和有害代谢物积累，使比生长速

10、率下降趋零。为了维持生存，微生物体触发有关次生代比生长速率下降趋零。为了维持生存，微生物体触发有关次生代谢基因，产生次生代谢物。以取得环境竞争优势，保存自身。谢基因，产生次生代谢物。以取得环境竞争优势，保存自身。影响发酵的相关因素影响发酵的相关因素培养基培养基 1. 碳源碳源 碳源用于提供微生物能量来源、构建细胞和形成产物。碳源包括碳源用于提供微生物能量来源、构建细胞和形成产物。碳源包括单糖、双糖、多糖、天然复合物、油脂、低级醇烃等，如葡萄糖、单糖、双糖、多糖、天然复合物、油脂、低级醇烃等，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、面粉、豆油、甘油等。当培养基中碳源达到蔗糖、淀粉、面粉、豆油、甘油等。当培养基中碳

11、源达到5%以上就以上就形成高渗透压溶液，影响发酵。同时在一定浓度下碳源会阻遏产物形成高渗透压溶液，影响发酵。同时在一定浓度下碳源会阻遏产物合成酶，形成合成酶，形成碳分解代谢物阻遏碳分解代谢物阻遏。 2. 氮源氮源 氮源是微生物蛋白质和其他含氮有机物的来源，也参与形成含氮氮源是微生物蛋白质和其他含氮有机物的来源，也参与形成含氮产物。氮源包括产物。氮源包括无机氮源和有机氮源无机氮源和有机氮源，如氨盐、硝酸盐、玉米浆粉、，如氨盐、硝酸盐、玉米浆粉、蛋白胨等。无机氮中的铵离子及有机氮通过降解得到的铵离子也有蛋白胨等。无机氮中的铵离子及有机氮通过降解得到的铵离子也有阻遏产物合成酶的性质。阻遏产物合成酶的

12、性质。 3. 矿物盐矿物盐 磷酸盐、镁盐、钙盐是微生物能量代谢和生长的参与因素。锌、磷酸盐、镁盐、钙盐是微生物能量代谢和生长的参与因素。锌、铁、钼、钴等是微生物所需要的微量元素。碳酸钙可以调节发酵液铁、钼、钴等是微生物所需要的微量元素。碳酸钙可以调节发酵液pH，但盐浓度达到一定程度则成为生长抑制和产抗调节因素。，但盐浓度达到一定程度则成为生长抑制和产抗调节因素。 4. 生长因子生长因子 许多微生物生长需要它们所不能合成的许多微生物生长需要它们所不能合成的生长因子生长因子，如特殊氨，如特殊氨基酸、维生素、生物素、嘌呤等。一般在天然复合物（如酵母基酸、维生素、生物素、嘌呤等。一般在天然复合物（如酵

13、母粉、玉米浆）中有存在，但有时也必须单独添加以保证需要。粉、玉米浆）中有存在，但有时也必须单独添加以保证需要。 5. 消泡剂消泡剂 发酵过程中，由于营养物分解代谢和菌体老化，加上发酵罐发酵过程中，由于营养物分解代谢和菌体老化，加上发酵罐内通气和搅拌效果，易导致泡末产生，造成溶氧不足和逃液等内通气和搅拌效果，易导致泡末产生，造成溶氧不足和逃液等问题。可通过问题。可通过消泡剂的添加控制泡末消泡剂的添加控制泡末。一般消泡剂为高分子聚。一般消泡剂为高分子聚合物，如泡敌，聚乙二醇等。油类也具有类似效果，如豆油、合物，如泡敌，聚乙二醇等。油类也具有类似效果，如豆油、葵花子油等。葵花子油等。 6. 前体物质

14、前体物质 次生代谢产物的合成往往需要特定化学结构物质作为反应起次生代谢产物的合成往往需要特定化学结构物质作为反应起始物。这些物质虽然也能够通过微生物代谢合成得到，但如果始物。这些物质虽然也能够通过微生物代谢合成得到，但如果予以人为添加则可以有效减少限制，促进产物合成。如青霉素予以人为添加则可以有效减少限制，促进产物合成。如青霉素发酵中添加苯乙酸，红霉素发酵中添加正丙醇，达托霉素发酵发酵中添加苯乙酸，红霉素发酵中添加正丙醇，达托霉素发酵中添加癸酸，雷帕霉素、环孢菌素等添加特定氨基酸效价可以中添加癸酸，雷帕霉素、环孢菌素等添加特定氨基酸效价可以提高好几倍。提高好几倍。影响发酵的相关因素影响发酵的相

15、关因素培养基培养基发酵工业中，一些常见前体物质发酵工业中，一些常见前体物质产品产品前体前体产品产品前体前体青霉素青霉素G青霉素青霉素V金霉素金霉素灰黄霉素灰黄霉素红霉素红霉素达托霉素达托霉素苯乙酸苯乙酸苯氧乙酸苯氧乙酸氯化物氯化物氯化物氯化物正丙醇正丙醇癸酸癸酸核黄素核黄素类胡萝卜素类胡萝卜素L-异亮氨酸异亮氨酸L-色氨酸色氨酸L-丝氨酸丝氨酸西索霉素西索霉素丙酸盐丙酸盐-紫罗酮紫罗酮 -氨基丁酸氨基丁酸邻氨基苯甲酸邻氨基苯甲酸甘氨酸甘氨酸蛋氨酸蛋氨酸前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 如苯乙酸，一般基础料中仅仅添加如苯乙酸，一般基础料中仅仅添

16、加0.07%，癸酸，癸酸必须培养必须培养15h后加入。后加入。 前体添加过多，容易引起挥发和氧化，分解等。前体添加过多，容易引起挥发和氧化，分解等。 因此因此，前体在使用过程中，常采用流加方法。前体在使用过程中，常采用流加方法。用法用法：前体普遍采用流加的方法，：前体普遍采用流加的方法， 流加有利于提高前体的转化率。流加有利于提高前体的转化率。产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。体，但加入后却能提高产量的添加剂。 产物促进剂 促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面促进剂提高产量的机制还不

17、完全清楚，其原因是多方面的（机理不详）。的（机理不详）。 有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂本身是酶的诱导物； 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产；细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产； 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用； 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。l在发酵培养基设计中，一般先用合成成分鉴别特殊需要，在发酵培养基设计中，一般先用合成成分鉴别特殊需要，再转为天然培养基，以扩大

18、生产。再转为天然培养基，以扩大生产。l在发酵培养基成分选择是，除传统营养外，可选用各种在发酵培养基成分选择是，除传统营养外，可选用各种农副产品、工业副产品、废料等。农副产品、工业副产品、废料等。l开发天然培养基时，应考虑：开发天然培养基时，应考虑：l新选微生物及其工艺的特殊营养需求；新选微生物及其工艺的特殊营养需求；l为保持培养基成分稳定，改善储藏条件和加工条件；为保持培养基成分稳定，改善储藏条件和加工条件；l原料的性质及配制、灭菌、发酵条件对产物提取的影原料的性质及配制、灭菌、发酵条件对产物提取的影响；响；l培养基价格。培养基价格。发酵培养基设计发酵培养基设计培养基优化l（1）目前还不能完全

19、从生化反应的基本原理来推断和计算出适合）目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方。某一菌种的培养基配方。l（2）只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参）只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照他人所使用的比较适合某一类菌种、某一类产品发酵的照他人所使用的比较适合某一类菌种、某一类产品发酵的经验配经验配方。方。l（3）采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和）采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。实验方法选择出较为适合的培养基。培养基优化的基本原则l注意事项：注意事项：l（1）菌

20、种特性，同化能力）菌种特性，同化能力l（2）合适的合适的C、N比。比。l（3）合适的快速利用碳源、氮源。）合适的快速利用碳源、氮源。l（4）合适的生理性酸性与碱性）合适的生理性酸性与碱性l（5）pH、离子强度等、离子强度等没有最好，只有更好没有最好，只有更好提高生产率提高生产率降低物耗、能耗、三废排放降低物耗、能耗、三废排放提高发酵单位提高发酵单位缩短生产时间缩短生产时间价廉的原料替代，降低成本价廉的原料替代，降低成本培培养养基基优优化化目目标标正交正交实验实验均匀均匀设计设计神经神经网络网络其他其他方法方法聚类聚类分析分析响应面响应面分析分析单因子单因子实验实验成本成本发酵单位发酵单位方法方

21、法结果结果培养基优化的基本方法影响发酵的相关因素影响发酵的相关因素培养条件培养条件 1. 温度温度 温度影响温度影响微生物酶系的活力微生物酶系的活力，这些酶分别决定微生物的初级代谢生长，这些酶分别决定微生物的初级代谢生长和次级代谢产抗。不同微生物菌种的生长温度不一样，而生长和产抗阶和次级代谢产抗。不同微生物菌种的生长温度不一样，而生长和产抗阶段的最适温度也有差异。发酵温度的设计要综合考虑能源消耗、发酵周段的最适温度也有差异。发酵温度的设计要综合考虑能源消耗、发酵周期、稳定培养和产率水平因素，必要时可考虑变温培养。期、稳定培养和产率水平因素，必要时可考虑变温培养。 2. pH pH对微生物的影响

22、，主要也是作用于酶。另外对营养利用和细胞结对微生物的影响，主要也是作用于酶。另外对营养利用和细胞结构也有重要影响。无控制的条件下，构也有重要影响。无控制的条件下，pH 呈现如下变化规律。呈现如下变化规律。有机氮分解，形成大量NH4+NH4+消耗利用 碳源消耗产生有机酸菌体老化，进入鸟氨酸循环形成大量NH4+菌体二次生长影响发酵的相关因素影响发酵的相关因素培养条件培养条件 pH的调节首要在基础培养基的设计，如生理酸碱性物质的搭配、的调节首要在基础培养基的设计，如生理酸碱性物质的搭配、缓冲体系的设计等。另外可以加入外源性的酸碱物质调控，如盐酸、缓冲体系的设计等。另外可以加入外源性的酸碱物质调控，如

23、盐酸、氨水等。在流补体系中，往往通过葡萄糖和氨水的流加平衡氨水等。在流补体系中，往往通过葡萄糖和氨水的流加平衡pH，同，同时也兼具营养补充功能。时也兼具营养补充功能。 3. 氧的供应氧的供应 工业微生物大都为工业微生物大都为好氧微生物好氧微生物，氧的供应和利用影响初级生长和，氧的供应和利用影响初级生长和次级代谢。工业发酵中，将无菌空气通入培养基，通过搅拌桨分散气次级代谢。工业发酵中，将无菌空气通入培养基，通过搅拌桨分散气体以实现有效利用，同时维持一定罐顶压以增大氧的溶解度。体以实现有效利用，同时维持一定罐顶压以增大氧的溶解度。 反映氧的供给和利用情况的数值包括：反映氧的供给和利用情况的数值包括

24、：DO溶解氧、溶解氧、OUR摄氧率、摄氧率、Kla氧传递速率等，可通过溶氧电极、发酵尾气分析仪等获得。氧传递速率等，可通过溶氧电极、发酵尾气分析仪等获得。 类似的，生长和产抗往往有不同的氧需求。通过调节通气量、搅类似的，生长和产抗往往有不同的氧需求。通过调节通气量、搅拌速率、罐压可以有效控制和保证氧的供给。而发酵拌速率、罐压可以有效控制和保证氧的供给。而发酵黏度黏度、泡沫泡沫等因等因素往往导致氧利用的恶化，需要警惕和控制。素往往导致氧利用的恶化，需要警惕和控制。影响发酵的相关因素影响发酵的相关因素培养条件培养条件 4. 灭菌条件灭菌条件 发酵罐和培养基灭菌是无菌培养的必要前提，同时也导致发酵罐

25、和培养基灭菌是无菌培养的必要前提，同时也导致营养营养损失和毒性物质积累损失和毒性物质积累。因此对于敏感菌种往往需要对部分养分单。因此对于敏感菌种往往需要对部分养分单独灭菌，以降低影响。但是这些影响因素往往会成为控制生长、独灭菌，以降低影响。但是这些影响因素往往会成为控制生长、调节微生物产抗的必要因素。通过灭菌温度、时间的调整来控制调节微生物产抗的必要因素。通过灭菌温度、时间的调整来控制微生物发酵也是常用的手段。微生物发酵也是常用的手段。 5. 剪切力剪切力 发酵生产培养中，搅拌促进氧的分散利用，但发酵生产培养中，搅拌促进氧的分散利用，但桨叶尖端末速桨叶尖端末速形形成的剪切力也会损伤菌体，造成菌

26、体断裂破碎，进而导致二次生成的剪切力也会损伤菌体，造成菌体断裂破碎，进而导致二次生长、黏度提高、菌种变异等情况，使发酵恶化。长、黏度提高、菌种变异等情况，使发酵恶化。 对于剪切，可以筛选耐剪切力菌种，提高菌种抵抗能力。在设对于剪切，可以筛选耐剪切力菌种，提高菌种抵抗能力。在设备上也可以选择低剪切、高分散效率的搅拌桨，如轴流推进式桨备上也可以选择低剪切、高分散效率的搅拌桨，如轴流推进式桨叶。叶。影响发酵的相关因素影响发酵的相关因素其他因素其他因素 1. 种子质量的影响种子质量的影响 2. 设备的影响设备的影响 良好可靠的发酵设备是发酵生产的必要因素。设备对于发酵良好可靠的发酵设备是发酵生产的必要

27、因素。设备对于发酵生产的负面影响表现如：轴封磨损、管路接头缝隙、过滤器失生产的负面影响表现如：轴封磨损、管路接头缝隙、过滤器失效导致效导致染菌问题染菌问题；搅拌不平衡导致罐体震动，影响；搅拌不平衡导致罐体震动，影响供氧供氧；开关；开关阀门动作失灵导致阀门动作失灵导致温度、温度、pH控制控制不稳等等。不稳等等。 3. 人员操作的影响人员操作的影响 人员操作是发酵生产控制的重要因素人员操作是发酵生产控制的重要因素,对发酵生产各环节都对发酵生产各环节都有决定性影响。只有严格按照操作规程操作，才能避免由于粗有决定性影响。只有严格按照操作规程操作，才能避免由于粗略和错误的影响。略和错误的影响。 4. 环

28、境因素环境因素 环境因素往往导致发酵水平的环境因素往往导致发酵水平的季节性波动季节性波动。如环境空气的温。如环境空气的温湿度会使无菌空气的温湿度有差异，导致培养体积随时间的增湿度会使无菌空气的温湿度有差异，导致培养体积随时间的增减，影响发酵环境。减，影响发酵环境。（健壮均一、足够数量、缩短迟滞期）（健壮均一、足够数量、缩短迟滞期）发酵终点的判断发酵终点的判断 1. 发酵的评价指标发酵的评价指标 发酵产率：单位体积的产物含量发酵产率：单位体积的产物含量 g/L 发酵总亿：发酵液中产物总产量发酵总亿：发酵液中产物总产量 十亿单位十亿单位/kg 发酵系数：产物总产量发酵系数：产物总产量/总发酵体积总

29、发酵体积*总发酵时间总发酵时间 kg/m3*h 发酵成本：发酵发酵成本：发酵(原料原料+动力动力+人员人员+其他其他)成本成本/总产量总产量 元元/kg 2. 终点判断标准终点判断标准 发酵终点的判断主要从发酵终点的判断主要从技术和经济指标技术和经济指标两方面来衡量。技术两方面来衡量。技术上需要寻找发酵总亿与发酵系数的平衡点，当总亿增加，发酵系上需要寻找发酵总亿与发酵系数的平衡点，当总亿增加，发酵系数却趋低时即应考虑放罐。同时从分离角度考虑，一方面残余营数却趋低时即应考虑放罐。同时从分离角度考虑，一方面残余营养物要尽量减少，另一方面菌体自溶不能大量出现。此外，一旦养物要尽量减少，另一方面菌体自

30、溶不能大量出现。此外，一旦难分离杂质组分有升高趋势，也将影响分离得率和总的成本。难分离杂质组分有升高趋势，也将影响分离得率和总的成本。 从经济角度考虑，发酵终点应处于最低发酵成本位置，但同从经济角度考虑，发酵终点应处于最低发酵成本位置，但同时也应兼顾分离提取需要。时也应兼顾分离提取需要。（三）发酵系统介绍（三）发酵系统介绍（三）发酵系统介绍（三）发酵系统介绍工业发酵搅拌器技术的发展径向流圆盘搅拌器：径向流圆盘搅拌器：Rushton涡轮半弯管圆盘涡轮BT-6轴向流搅拌器：轴向流搅拌器：窄叶高效轴流 A310，CBY, HE3，ZCX等宽叶高效轴流A315，KSX, MaxFlo等工业发酵过程搅拌

31、技术红霉素红霉素370370吨发酵罐吨发酵罐工业发酵过程搅拌技术酶制剂酶制剂-糖化酶糖化酶长城最新发酵搅拌技术 发酵罐的长径比发酵罐的长径比H/D的考虑的考虑：考虑气体的停留时间以及：考虑气体的停留时间以及热管的布置国内一般考虑热管的布置国内一般考虑2.5到到3。考虑搅拌的整体稳定。考虑搅拌的整体稳定长城最新发酵搅拌技术工业发酵过程搅拌技术l大量的工业生物过程需要搅拌技术和设备，搅大量的工业生物过程需要搅拌技术和设备，搅拌设备随着发酵罐的容积的增大也越来越大；拌设备随着发酵罐的容积的增大也越来越大；新的搅拌技术也不断应用于工业发酵过程。新的搅拌技术也不断应用于工业发酵过程。l发酵罐的高径比设计

32、，换热管的设计等都与搅发酵罐的高径比设计，换热管的设计等都与搅拌设计密切相关，有许多经验可供参考。拌设计密切相关，有许多经验可供参考。 （四）几种抗生素的发酵工艺实例（1）青霉素的发酵工艺）青霉素的发酵工艺青霉素的产生菌青霉素的产生菌产黄青霉（产黄青霉（Penicillium chrysogenum）51-20和点青霉（和点青霉（P. notatum），目），目前全世界用于青霉素生产的高产菌株几乎都是以前全世界用于青霉素生产的高产菌株几乎都是以产黄青霉为出发菌株，经不同的改良途径得到的。产黄青霉为出发菌株，经不同的改良途径得到的。目前青霉素的发酵单位最高达到目前青霉素的发酵单位最高达到1200

33、00U/ml。lIn 1928, Alexander Fleming ( left), a Scottish bacteriologist, discovered a mold with bacteria-killing powers so incredible it was effective even when diluted 800 times. Courtesy of the USDA. Right, a strain of P. notatum was used for some of the first tests of pencillin. Courtesy of the FDA

34、s Center for Drug Evaluation and Research. 甘油、葡萄糖和蛋白胨组成的培养基斜面培养甘油、葡萄糖和蛋白胨组成的培养基斜面培养砂土孢子砂土孢子生产孢子的制备生产孢子的制备大米或小米固体培养基上大米或小米固体培养基上25培养培养7d，孢子成熟后真空干燥，低温保藏备用。孢子成熟后真空干燥，低温保藏备用。采用三级发酵，其目的是使青霉菌菌体数量逐步扩大和适采用三级发酵，其目的是使青霉菌菌体数量逐步扩大和适应发酵，其次是使发酵罐连续使用，缩短发酵周期。应发酵，其次是使发酵罐连续使用，缩短发酵周期。一级发酵：小罐，使孢子萌芽形成菌丝；一级发酵：小罐，使孢子萌芽形成菌

35、丝；二级发酵：大量繁殖青霉菌菌丝体；二级发酵：大量繁殖青霉菌菌丝体；三级发酵：继续大量繁殖菌丝体，生产青霉素。三级发酵：继续大量繁殖菌丝体，生产青霉素。大规模发酵生产大规模发酵生产发酵的影响因素及控制发酵的影响因素及控制碳源、氮源的影响和控制：碳源、氮源的影响和控制：葡萄糖是容易利用的碳源，有利于菌体的生长；乳糖葡萄糖是容易利用的碳源，有利于菌体的生长；乳糖是青霉素生物合成最好的碳源。青霉素发酵中采用连续是青霉素生物合成最好的碳源。青霉素发酵中采用连续流加葡萄糖的方法，在发酵初期使青霉菌大量迅速强壮流加葡萄糖的方法，在发酵初期使青霉菌大量迅速强壮地繁殖菌丝体；发酵后期利用乳糖使青霉素大量合成。

36、地繁殖菌丝体；发酵后期利用乳糖使青霉素大量合成。玉米浆是青霉素发酵最好的氮源。玉米浆是青霉素发酵最好的氮源。 玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、生长素和一些前体物质，含玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、生长素和一些前体物质，含大约大约40%50%固体物质。固体物质。 在玉米浸泡过程中若长有乳酸菌和酵母菌，则提高玉米浆的质在玉米浸泡过程中若长有乳酸菌和酵母菌，则提高玉米浆的质量；若长有腐败性细菌则降低玉米浆的质量。（含有大量乳酸）量；若长有腐败性细菌则降低玉米浆的质量。（含有大量乳酸） 玉米浆是微生物生长很普遍应用的有机氮源，它还能促进青霉玉米浆是微生物生长很普遍应用的有机氮源，它还能促进青霉素等抗生素

37、的生物合成。素等抗生素的生物合成。前体的影响和控制：前体的影响和控制：苯乙酸及其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均苯乙酸及其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可以作为青霉素可以作为青霉素G侧链的前体物直接结合到青霉素分子中，侧链的前体物直接结合到青霉素分子中，也可以作为养料和能源被利用。也可以作为养料和能源被利用。苯乙酸、苯乙酰胺等对菌体生长和生物合成均有毒性。苯乙酸、苯乙酰胺等对菌体生长和生物合成均有毒性。采用间歇或连续添加低浓度前体物质的方法，保持前体的采用间歇或连续添加低浓度前体物质的方法，保持前体的供应率仅大于生物合成的需要，可以起到提高产量的作用。供应率仅大于生物合成的需

38、要，可以起到提高产量的作用。pH的影响和控制：的影响和控制：青霉素发酵的最适青霉素发酵的最适pH一般认为是一般认为是6.2-6.8，应尽量避，应尽量避免免pH超过超过7.0。当当pH高于最适高于最适pH时，通过补糖和生理酸性物质（硫时，通过补糖和生理酸性物质（硫酸铵等无机氮源）降低酸铵等无机氮源）降低pH ；当当pH低于最适低于最适pH时，通过补加时，通过补加CaCO3、氨水或尿素，、氨水或尿素，也可提高通气量，促进有机酸氧化来提高也可提高通气量，促进有机酸氧化来提高pH。可利用自动加入酸或碱的方法维持可利用自动加入酸或碱的方法维持pH。温度的影响和控制：温度的影响和控制：青霉菌生长的适宜温度

39、是青霉菌生长的适宜温度是30，分泌青霉素的适宜，分泌青霉素的适宜温度是温度是20，通常采用分段变温控制法，使温度适合，通常采用分段变温控制法，使温度适合不同阶段的需要。不同阶段的需要。0-56 h维持在维持在27.2，然后恒速降温至，然后恒速降温至18.7，并维，并维持到持到184 h，最后，最后24 h回复到回复到27.2培养。这样变温培培养。这样变温培养法可比常温养法可比常温25培养产量增加培养产量增加16%。补料控制：补料控制：中间补糖以控制糖浓度和中间补糖以控制糖浓度和pH；补加氮源可延长发酵周期、调节补加氮源可延长发酵周期、调节pH、提高青霉素产、提高青霉素产量，控制发酵液中的氨基氮

40、含量在量，控制发酵液中的氨基氮含量在0.01%-0.05%。补加表面活性剂，如新洁尔灭补加表面活性剂，如新洁尔灭50 mg/L、聚氧乙烯、聚氧乙烯、山梨糖醇酐等也能增加青霉素的产量。山梨糖醇酐等也能增加青霉素的产量。加入少量可溶性高分子化合物，如聚乙烯醇、聚二乙胺加入少量可溶性高分子化合物，如聚乙烯醇、聚二乙胺或聚乙烯吡咯烷酮（或聚乙烯吡咯烷酮（PVP），能使青霉素产率提高），能使青霉素产率提高38%。（1）当发酵罐使用较大的搅拌功率和较快的搅拌叶尖）当发酵罐使用较大的搅拌功率和较快的搅拌叶尖速时，这些高分子化合物能使临近搅拌叶的液体速度梯速时，这些高分子化合物能使临近搅拌叶的液体速度梯度降低

41、，避免打断菌丝，而且促进氧在培养基度降低，避免打断菌丝，而且促进氧在培养基 中充分中充分溶解的同时还有利于除去溶解的同时还有利于除去 CO2。 （2）菌丝生长时，由于高分子化合物起到分散剂的作）菌丝生长时，由于高分子化合物起到分散剂的作用，菌丝不致成团，界面面积得以增加，因而增加了氧用，菌丝不致成团，界面面积得以增加，因而增加了氧传递到菌丝体内的总速度。传递到菌丝体内的总速度。铁离子的影响和控制：铁离子的影响和控制：Fe3+对青霉素生物合成有显著影响，一般当发酵液对青霉素生物合成有显著影响，一般当发酵液中含量超过中含量超过30-40g/ml，则发酵单位增长缓慢。，则发酵单位增长缓慢。铁制发酵罐

42、在使用前必须进行处理，可在罐壁涂上铁制发酵罐在使用前必须进行处理，可在罐壁涂上环氧树脂等保护层，使环氧树脂等保护层，使Fe3+含量控制在含量控制在30 g/ml以下。以下。冷冻干孢子琼脂斜面米孢子种子罐发酵罐提取工序菌种工艺：菌种工艺：自身耐受性突变自身耐受性突变前体或前体类似物抗性突前体或前体类似物抗性突变变营养缺陷型的回复突变营养缺陷型的回复突变耐消泡剂的菌株耐消泡剂的菌株细胞膜渗透性良好的菌株细胞膜渗透性良好的菌株构建基因工程菌株构建基因工程菌株发酵的优化控制发酵的优化控制 碳、氮源碳、氮源 pH温度温度微量元素：铁离子的影响微量元素：铁离子的影响补料补料:糖、硫酸铵、尿素、玉米浆糖、硫

43、酸铵、尿素、玉米浆前体化合物、水溶性高分子化合前体化合物、水溶性高分子化合物、表面活性剂物、表面活性剂青霉素生产工艺流程青霉素生产工艺流程（2）达托霉素的发酵工艺）达托霉素的发酵工艺达托霉素的产生菌达托霉素的产生菌玫瑰孢链霉菌玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus )福建省微生物研究所。 福建省微生物研究所改变细胞膜电位，搅乱细胞膜对氨基酸等的转运从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖改变细胞膜电位，搅乱细胞膜对氨基酸等的转运从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成；改变细菌细胞质膜的性质，破坏细菌细胞膜使细菌内容物外泄的生物合成；改变细菌细胞质膜的性质，破坏细菌细胞膜使细菌内容物外泄等。

44、等。daptomycin是目前发现的唯一能抑制是目前发现的唯一能抑制G细菌细胞膜上特有成分细菌细胞膜上特有成分脂磷脂磷壁酸壁酸合成的抗生素合成的抗生素。 化学半合成法化学半合成法 首先经玫瑰孢链霉菌发酵获得达托霉素原形药然后经微生物转化、化学半合成最终形成达托霉素。 工艺路线长，存在两步发酵，发酵效率和提取收率低，不适于工业化生产。生物定向合成法生物定向合成法 利用癸酸作为发酵的前体物直接由微生物发酵产生达托霉素。一步发酵，发酵效率高，工艺路线短，提取收率也比较高。达托霉素生物合成途径 诱变推理选育高产菌种摇瓶发酵工艺优化常规诱变：紫外辐射、NTG、抗生素处理等遗传稳定性菌种保藏工艺单因素、正

45、交、响应曲面法等摇瓶流加癸酸盐癸酸耐受性菌种遗传改良菌种遗传改良菌种工艺菌种工艺v菌种用冷冻干燥法或甘油管法保存，并严格控制有效使用期；菌种用冷冻干燥法或甘油管法保存，并严格控制有效使用期；v所有生产用菌种或斜面都保存于低温冷库内（所有生产用菌种或斜面都保存于低温冷库内（0-4），并限），并限制其使用期限；制其使用期限；v严格控制生产菌落在斜面上的传代次数，一般以严格控制生产菌落在斜面上的传代次数，一般以3代为限，用代为限，用单菌落转种，以使用新鲜斜面为原则；单菌落转种，以使用新鲜斜面为原则；v定期进行菌种的纯化筛选，淘汰退化的菌落；定期进行菌种的纯化筛选，淘汰退化的菌落；v不断选育高单位的新

46、菌种。不断选育高单位的新菌种。达托霉素产生菌容易发生变异达托霉素产生菌容易发生变异大规模发酵生产大规模发酵生产采用高度通气搅拌、采用高度通气搅拌、3-4级的扩大深层培养法发酵。级的扩大深层培养法发酵。菌种菌种（冷冻干燥管或甘油管）（冷冻干燥管或甘油管）斜面斜面摇瓶种子（摇瓶种子（1-2级）级） 种子罐种子（种子罐种子（1-3级）级） 大罐发酵（大罐发酵（7-8 d）发酵过程控制发酵过程控制pH（流加氨水）（流加氨水）适当时机补料前体物质癸酸适当时机补料前体物质癸酸（采用不同的形式：癸酸盐（采用不同的形式：癸酸盐或溶于有机溶剂）或溶于有机溶剂）发酵的影响因素及控制发酵的影响因素及控制碳源、氮源的

47、影响和控制：碳源、氮源的影响和控制：首选碳源是马铃薯糊精；首选碳源是马铃薯糊精；可利用碳源：葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、玉米淀粉、麦芽糊精等等可利用碳源：葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、玉米淀粉、麦芽糊精等等有机氮源以黄豆饼粉为佳，无机氮源以硫酸铵和尿素最有机氮源以黄豆饼粉为佳，无机氮源以硫酸铵和尿素最常用，氨水可用来调节发酵常用，氨水可用来调节发酵pH。有机氮源：酵母粉、黄豆粉、黄豆饼粉、玉米浆粉、蛋白胨、棉籽粉有机氮源：酵母粉、黄豆粉、黄豆饼粉、玉米浆粉、蛋白胨、棉籽粉无机氮源：硫酸铵、尿素、硝酸铵、柠檬酸三铵、磷酸氢二铵等无机氮源：硫酸铵、尿素、硝酸铵、柠檬酸三铵、磷酸氢二铵等无机盐及微量元素的

48、影响和控制：无机盐及微量元素的影响和控制：磷酸盐对菌体生长和抗生素的合成非常重要，一般采用较低的磷磷酸盐对菌体生长和抗生素的合成非常重要，一般采用较低的磷酸盐浓度，酸盐浓度，15-150 mmol/L（46.5-465 mg/L）；）；Fe2+一般适用量在一般适用量在20 g/ml（FeSO4、(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O ）生物素（生物素（biotin）、维生素）、维生素C、维生素、维生素B12；通气和搅拌的影响和控制：通气和搅拌的影响和控制：q增加通气量，保持一定搅拌速度，避免长期停止搅增加通气量，保持一定搅拌速度，避免长期停止搅拌和闷罐。拌和闷罐。温度、温度、pH的影响和控制：

49、的影响和控制：q玫瑰孢链霉素发酵温度以玫瑰孢链霉素发酵温度以30为宜；为宜；q玫瑰孢链霉素菌丝生长的最适玫瑰孢链霉素菌丝生长的最适pH为为7.0左右，适于左右，适于达托霉素合成的达托霉素合成的pH为为6.5-6.8。q补加葡萄糖、硫酸铵和氨水，不仅为菌体生长和产物合补加葡萄糖、硫酸铵和氨水，不仅为菌体生长和产物合成提供营养物质，还能调节发酵液的成提供营养物质，还能调节发酵液的pH。q前体物癸酸前体物癸酸q对细胞毒性大，很小剂量就可以抑制细胞生长，甚至导致死亡；但对细胞毒性大，很小剂量就可以抑制细胞生长，甚至导致死亡；但是作为达托霉素的侧链，在发酵适当时机加入可以大大提高达托霉素是作为达托霉素的

50、侧链，在发酵适当时机加入可以大大提高达托霉素产量（约产量（约510倍）倍）q由于癸酸对细胞具有毒性，而且其在常温下是呈固体状。所以必须通过溶剂由于癸酸对细胞具有毒性，而且其在常温下是呈固体状。所以必须通过溶剂溶解后再由补料的方式流加。一般采用油酸甲酯、乙醇等溶解癸酸，但是溶溶解后再由补料的方式流加。一般采用油酸甲酯、乙醇等溶解癸酸，但是溶解在油酸甲酯或乙醇中的癸酸仍然对细胞具有较大毒性，并且温度低时容易解在油酸甲酯或乙醇中的癸酸仍然对细胞具有较大毒性，并且温度低时容易结晶析出，影响流加效果。而癸酸盐在常温下能够以液体的形式存在，并且结晶析出，影响流加效果。而癸酸盐在常温下能够以液体的形式存在，

51、并且游离癸酸根离子对细胞的毒性相对效价。因此可以作为达托霉素侧链的供体。游离癸酸根离子对细胞的毒性相对效价。因此可以作为达托霉素侧链的供体。 补料控制补料控制l种子罐为种子罐为200L，装料，装料70%，培养温度：，培养温度：301，罐压：，罐压：0.03-0.05MPa，空气流量：，空气流量：1：1 vvm，搅拌转速，搅拌转速150300rpm，发酵过程，发酵过程用浓氨水调节用浓氨水调节pH不低于不低于6.5。l菌容达到菌容达到30%左右，约左右，约30h移入移入2吨二级罐（培养基同发酵罐）装液量吨二级罐（培养基同发酵罐）装液量为为70%，移种量为，移种量为5%10%，培养温度：，培养温度：

52、301，罐压：，罐压：0.03-0.05MPa，空气流量：，空气流量：1：1 vvm，搅拌转速，搅拌转速150250rpm，发酵过程，发酵过程用浓氨水调节用浓氨水调节pH不低于不低于6.5。l在培养在培养15hr左右（菌容为左右（菌容为20%），移入发酵罐），移入发酵罐10吨，移种量吨，移种量15%，培，培养温度：养温度：301，罐压：，罐压：0.03-0.05MPa，空气流量：，空气流量：1：1 vvm，搅，搅拌转速拌转速150250rpm，发酵过程用浓氨水调节，发酵过程用浓氨水调节pH不低于不低于6.5。l发酵发酵24h后开始补料流加癸酸盐溶液（癸酸钠、癸酸钾、癸酸铵），流后开始补料流加癸

53、酸盐溶液（癸酸钠、癸酸钾、癸酸铵），流速速0.5-3.0ml/L/H至发酵结束时发酵液中达托霉素效价达到至发酵结束时发酵液中达托霉素效价达到10001700mg/l左右。左右。 发酵前期控制：原材料、灭菌、种子质量、菌体形态溶氧对发酵的影响：搅拌、通气、罐压、补水等菌体比生长速率跟抗生素产量的关系淀粉酶活性的变化规律糖氮、溶磷曲线规律前体物的添加策略：癸酸的组分形式、补料时机、 流加速度、发酵液中残余癸酸浓度等最大限度的发挥高产菌株的生产性能最大限度的发挥高产菌株的生产性能连续多批次在100L发酵罐上实现高产，在工厂3吨发酵罐以及10吨生产罐上实现工艺重复。达托霉素发酵过程控制研究达托霉素发酵

54、过程控制研究02468050010001500200002448729612014416819221602468 总 糖 氨基氮 还原糖 dapTime （hours）总糖 %还原糖 %0306090120150180210240氨基氮mg/100mL DAP0102030405060MPV发酵曲线分析发酵曲线分析02468050010001500200002448729612014416819221602468 总 糖 氨基氮 还原糖 dapTime （hours）总糖 %还原糖 %0306090120150180210240氨基氮mg/100mL DAP0102030405060MPV发酵

55、曲线分析发酵曲线分析-1012345678050010001500200002448729612014416819221602468 总 糖 氨基氮 还原糖 dapTime （hours）总糖 %还原糖 %050100150200250氨基氮 mg/100mL DAP0102030405060PMVl发酵液预处理：加热、调酸、加絮凝剂、硅藻土l过滤：滤布的孔径、陶瓷膜的孔径l超滤、纳滤l溶媒萃取l树脂分离分离提炼工艺 本实验室在一株链霉菌本实验室在一株链霉菌NOV-0827产生的次级代谢产物中产生的次级代谢产物中发现发现香豆素类抗生素香豆素类抗生素新生霉素（新生霉素（novobiocin），）

56、，大环内酰胺大环内酰胺类抗生素类抗生素BE-14106（GT-32A）和）和GT-32B。 （3）新化合物的发现及发酵工艺优化）新化合物的发现及发酵工艺优化 原始菌株接种于斜面培养基上，培养原始菌株接种于斜面培养基上，培养7 7天。待菌体发育成天。待菌体发育成熟后，将斜面接入种子培养基，熟后，将斜面接入种子培养基，种子在种子在2828，转速，转速220rpm220rpm条件条件下培养下培养48h48h后，再以后，再以5%5%的接种量接到装液量的接种量接到装液量60ml60ml发酵培养基中发酵培养基中，2828，220rpm220rpm条件下培养条件下培养144h144h。流程为流程为： 斜面斜

57、面 7天，天，28 种子培养基种子培养基 48h，28 发酵培养基发酵培养基 144h， 28 发酵液发酵液菌株发酵基本流程菌株发酵基本流程原始菌株经自然选育，得到了原始菌株经自然选育，得到了14株不同形态的菌株，编号依株不同形态的菌株，编号依次为次为1#-14#。再对这。再对这14株菌株株菌株进行筛选，以新生霉素的产量进行筛选，以新生霉素的产量为指标，筛选出效价较高的为指标，筛选出效价较高的4#和和5#菌株菌株。菌株形态观察发现：菌株形态观察发现：无孢子无孢子的菌株相对于有孢子的菌株，的菌株相对于有孢子的菌株，新生霉素的新生霉素的效价更高效价更高。各筛选菌株相对效价的比较图各筛选菌株相对效价

58、的比较图 筛选菌株形态图筛选菌株形态图注：从左至右依次为：注：从左至右依次为：1#1#、8#8#（有孢子（有孢子);4#);4#、5#5#（无孢子）（无孢子）传代次数相对效价（100%）1#8#4#5#F1100100100100F2107.496.2118.492.3F3113.5100.8120.699.4F498.2114.3123.6101.2F5107.8108.5118.9103.6筛选菌株传代稳定性考察筛选菌株传代稳定性考察 对筛选出的对筛选出的4株菌株株菌株进行分别进行分别5次传代培养，次传代培养，以生长良好的第一代菌株以生长良好的第一代菌株为对照，分别考察各代新为对照，分别考

59、察各代新生霉素产量的稳定性。结生霉素产量的稳定性。结果显示：各筛选菌株的果显示：各筛选菌株的遗遗传稳定性良好传稳定性良好，可作为下，可作为下一步的实验菌。一步的实验菌。显微镜下菌丝体形态图显微镜下菌丝体形态图注：注：A A：4 4倍；倍；B B：1010倍；倍；C C：4040倍；倍；D D：100100倍倍ABCD 对种子及发酵培养对种子及发酵培养液进行取样、涂片、染液进行取样、涂片、染色后，镜检观察菌丝体色后，镜检观察菌丝体形态，镜检结果显示：形态，镜检结果显示：菌丝体长势良好菌丝体长势良好，菌丝，菌丝茁壮、茂密、舒展，无茁壮、茂密、舒展，无结团现象。结团现象。 在本部分的研究中，对原始出

60、发菌株经自然选在本部分的研究中，对原始出发菌株经自然选育和初步筛选，得到了育和初步筛选，得到了1株编号为株编号为4#，菌株形态观，菌株形态观察无孢子的菌株，其新生霉素的效价最高。且传代察无孢子的菌株，其新生霉素的效价最高。且传代稳定性实验表明其遗传稳定性良好，可作为下一步稳定性实验表明其遗传稳定性良好，可作为下一步实验菌。实验菌。 因此，选择因此，选择效价最高的效价最高的4#菌株菌株为下一步的实验为下一步的实验菌株，其新生霉素的效价较原始菌株提高了菌株，其新生霉素的效价较原始菌株提高了272.6%。min51015202530354045mAU020406080100120140 DAD1 A