基因诊断与治疗

1、第第7章章 基因诊断与治疗基因诊断与治疗（Gene Diagnosis and Therapy ）概概 述述o 分子生物学领域日新月异的进展为基础科研分子生物学领域日新月异的进展为基础科研的成果应用于临床疾病检查和治疗奠定了坚的成果应用于临床疾病检查和治疗奠定了坚实基础，使得以实基础，使得以DNA分子重组、杂交和分子重组、杂交和DNA转移技术转移技术为基础的分子医学（为基础的分子医学（基因诊断基因诊断和治疗和治疗）成为当今生物医学科学最为活跃的）成为当今生物医学科学最为活跃的前沿领域之一。前沿领域之一。7.1 基因诊断基因诊断o 概念：利用现代分概念：利用现代分子生物学和分子遗子生物学和分子遗

2、传学的技术方法，传学的技术方法，直接检测基因结构直接检测基因结构（DNA水平水平）及其）及其表达水平（表达水平（RNA水水平平）是否正常，从）是否正常，从而对疾病做出诊断而对疾病做出诊断的方法。的方法。基因诊断的常用技术方法基因诊断的常用技术方法 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术n 限制性内切酶图谱分析法限制性内切酶图谱分析法n DNA限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLP）n 等位基因特异寡核苷酸探针（等位基因特异寡核苷酸探针（ASO）杂交法）杂交法 PCR 基因测序基因测序 基因芯片技术基因芯片技术单链构象多态性单链构象多态性PCR (SSCP-PCR)单链单链DNA碱基组成

3、碱基组成和和(或或)排列顺序不同排列顺序不同,形成的构象就不同形成的构象就不同, 在非变性在非变性PAGE中电中电泳中会表现出不同的泳中会表现出不同的迁移率迁移率SSCP可以区分可以区分1bp的差异的差异PCR-SSCP分析不分析不能确定基因变异的内能确定基因变异的内容，因此电泳后结果容，因此电泳后结果有差异后还需进行测有差异后还需进行测序分析，确定变异性序分析，确定变异性质质基因诊断的特点（基因诊断的特点（1） 特异性高。特异性高。基因诊断检测的目标是基因，它是原基因诊断检测的目标是基因，它是原始的致病因素，不同基因的碱基序列是各不相同始的致病因素，不同基因的碱基序列是各不相同的。检测基因的

4、分子生物学方法亦是高度特异的，的。检测基因的分子生物学方法亦是高度特异的，因此可以检测出因此可以检测出DNA 片段的缺失、插入、重排片段的缺失、插入、重排,甚甚至单个碱基的突变。至单个碱基的突变。 灵敏度高灵敏度高。单拷贝基因虽。单拷贝基因虽然很少，难以检测，但目然很少，难以检测，但目前已有使基因或其片段高前已有使基因或其片段高度扩增的度扩增的PCR 技术以及高技术以及高灵敏度的基因探针可以应灵敏度的基因探针可以应用，所以待测标本往往只用，所以待测标本往往只需微量，目的基因只需需微量，目的基因只需pg水平就已足够。水平就已足够。 基因诊断的特点（基因诊断的特点（2） 稳定性高。基因的稳定性高。

5、基因的化学组成是核酸化学组成是核酸,它它比蛋白质稳定得多比蛋白质稳定得多,长期保存的蜡块中长期保存的蜡块中常能顺利检出。而常能顺利检出。而且被检测的基因不且被检测的基因不需要一定处于活性需要一定处于活性状态。状态。 基因诊断的特点（基因诊断的特点（3） 诊断范围广诊断范围广,适用性强。适用性强。基因诊断不仅能对某些疾基因诊断不仅能对某些疾病作出确切的诊断，如确定有遗传病家族史的人病作出确切的诊断，如确定有遗传病家族史的人或胎儿是否携带致病基因等；也能确定与疾病有或胎儿是否携带致病基因等；也能确定与疾病有关联的状态关联的状态,如对疾病的易感性、发病类型和阶段、如对疾病的易感性、发病类型和阶段、是

6、否具有抗药性等进行检测是否具有抗药性等进行检测。 基因诊断的特点（基因诊断的特点（4） 临床应用前景好。临床应用前景好。随着分子生物学技随着分子生物学技术的普及术的普及,在配备有在配备有一定的仪器和试剂一定的仪器和试剂盒的情况下，在临盒的情况下，在临床实验室开展基因床实验室开展基因诊断是完全可能的。诊断是完全可能的。 基因诊断的特点（基因诊断的特点（5）基因诊断的策略基因诊断的策略 基因突变的检测基因突变的检测 基因突变检测法可检测基因大片段缺失基因突变检测法可检测基因大片段缺失和插入、小片段缺失和插入、点突变、异常和插入、小片段缺失和插入、点突变、异常基因重排和异常基因融合等的检测。基因重排

7、和异常基因融合等的检测。 基因连锁分析基因连锁分析 基因连锁分析是指采用紧邻致病基因区域基因连锁分析是指采用紧邻致病基因区域的多态性标志或已知基因为坐标在一个家系的多态性标志或已知基因为坐标在一个家系中探查其致病基因的分析方法。中探查其致病基因的分析方法。 感染性外源疾病基因的检测感染性外源疾病基因的检测 包括感染性病毒、细茵、寄生虫、支原包括感染性病毒、细茵、寄生虫、支原体、衣原体等在人体内存在的外源性生物体、衣原体等在人体内存在的外源性生物DNA或或RNA 基因异常表达的检测基因异常表达的检测 基因诊断的优点基因诊断的优点 可对那些具有组织和分化阶段表达特异性可对那些具有组织和分化阶段表达

8、特异性 的的基因及其异常基因及其异常进行检测和诊断进行检测和诊断 在感染性疾病的基因诊断中，既可检出正在感染性疾病的基因诊断中，既可检出正 在生长的病原体，又可检出潜伏的病原体；在生长的病原体，又可检出潜伏的病原体； 既能确定既往感染，又能确定现行感染；既能确定既往感染，又能确定现行感染； 尤其适用于不易体外培养和不能在实验尤其适用于不易体外培养和不能在实验 安全培养的病原体，大大扩大诊断范围。安全培养的病原体，大大扩大诊断范围。基因诊断的临床应用基因诊断的临床应用基因诊断基因诊断 在在感染性疾病感染性疾病诊断中的应用诊断中的应用 病毒病毒 细菌细菌 螺旋体螺旋体 支原体支原体 衣原体衣原体

9、寄生虫寄生虫丙型肝炎丙型肝炎(HCV)(HCV)基因诊断实例基因诊断实例丙型肝炎为丙型肝炎为RNA病毒，病毒，9500bp，编码，编码3011-3033个氨基酸，具有高变异性。基因组组成：个氨基酸，具有高变异性。基因组组成：E1NS2NS3NS43-NCRCNS1/E2NS15-NCR高变异区（编码衣壳和包膜蛋白）（NCR: 非编码区） 5 5-NCR-NCR为保守的区域，将引物设计在该区域，为保守的区域，将引物设计在该区域，进行进行RT-PCR, RT-PCR, 可特异性的扩增可特异性的扩增HCVHCV。PCRPCR引物：引物：+: 5+: 5-GATTCTCGAGGCGACACTCCACC

10、ATAGAT-GATTCTCGAGGCGACACTCCACCATAGAT-: 5-: 5-ATACTCGAGGTGCACGGTCTACGAGACCT-ATACTCGAGGTGCACGGTCTACGAGACCTPCRPCR产物长度为产物长度为322bp322bp血液传播的疾病，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展血液传播的疾病，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)(HCC) ，已成为严重的社会和公共卫生问题。，已成为严重的社会和公共卫生问题。 基因诊断基因诊断 在在遗传性疾病和产前诊断遗传性疾病和产前诊断中的应用中的应用 血红

11、蛋白病血红蛋白病 杜氏肌营养不良症杜氏肌营养不良症 苯丙酮尿症苯丙酮尿症 脆性脆性X X综合症综合症 镰状细胞贫血症镰状细胞贫血症5 3 Mst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)5 3 突变基因突变基因1.35kb正常基因正常基因1.15kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析突变使基因内部的一个突变使基因内部的一个MstMst限制酶切位点丢失限制酶切位点丢失突变携带着突变携带着0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人患者患者基因诊断基因诊断 在肿瘤学及肿瘤诊断中的应用 肿瘤染色体易位及融合基因的检测肿瘤染色体易位及融合基因的检测 癌基因与抗癌

12、基因的检测癌基因与抗癌基因的检测 肿瘤相关病毒的检测肿瘤相关病毒的检测 肿瘤细胞多药耐药基因的检测肿瘤细胞多药耐药基因的检测 微卫星不稳定性的检测微卫星不稳定性的检测 端粒酶活性的检测端粒酶活性的检测亲子鉴定亲子鉴定个体识别个体识别法医物证法医物证基因诊断基因诊断 在个体识别中的应用某名人某名人儿儿 子？子？基因诊断基因诊断 在疾病易感性的基因诊断疾病易感性的基因诊断中中的应用基因诊断在判断个体对某种重大疾病的易感性方面基因诊断在判断个体对某种重大疾病的易感性方面起着重要作用。如人类白细胞抗原起着重要作用。如人类白细胞抗原(human leukocyte (human leukocyte an

13、tigen ,HLA) antigen ,HLA) 复合体的多态性与一些疾病的遗传易复合体的多态性与一些疾病的遗传易感性有关。白种人类风湿性关节炎患者感性有关。白种人类风湿性关节炎患者HLA-DR4HLA-DR4携带携带者高达者高达70 % ,70 % ,而正常人阳性率仅而正常人阳性率仅28 %28 %。运用。运用HLA HLA 基因基因分型对分型对HLA HLA 多态性进行分析多态性进行分析, ,既准确又灵敏既准确又灵敏, ,能检出血能检出血清学和细胞学分析方法无法检出的型别。根据所检测清学和细胞学分析方法无法检出的型别。根据所检测的结果即可进行疾病易感性判断。的结果即可进行疾病易感性判断。

14、 器官移植器官移植( (包括骨髓移植包括骨髓移植) ) 的主要难题是如何解决机的主要难题是如何解决机体对移植物的排斥反应。理想的方法是进行术前组织体对移植物的排斥反应。理想的方法是进行术前组织配型。基因诊断技术能够分析和显示基因型配型。基因诊断技术能够分析和显示基因型, ,更好地完更好地完成组织配型成组织配型, ,从而有利于提高器官移植的成功率。从而有利于提高器官移植的成功率。基因诊断基因诊断 在器官移植组织配型器官移植组织配型中中的应用7.2 基因治疗基因治疗o 基因治疗基因治疗（Gene Therapy）：将有功能的基因转移到）：将有功能的基因转移到病人的细胞中以纠正或置换致病基因的一种治

15、疗方法，病人的细胞中以纠正或置换致病基因的一种治疗方法，特指将有功能的特指将有功能的目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生整合基因发生整合，成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的，成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因的基因的表达产物起到对疾病的治疗作用表达产物起到对疾病的治疗作用。o 若目的基因不与宿主细胞基因组发生整合，但可通过若目的基因不与宿主细胞基因组发生整合，但可通过暂暂时表达产物发挥治疗作用的方法叫时表达产物发挥治疗作用的方法叫基因疗法基因疗法（gene therapeutics），此法实际上就如同临床上使用的药物），此法实际上就如同临床上使用的药

16、物治疗一样，这与传统意义上的基因治疗是有区别的治疗一样，这与传统意义上的基因治疗是有区别的。 基因治疗的措施基因治疗的措施o 基因置换基因置换(gene reptacement)：致病基因整个地被有功：致病基因整个地被有功能的正常基因所置换，使致病基因永久地得到更正。能的正常基因所置换，使致病基因永久地得到更正。o 基因修正基因修正(gene correction)：致病基因的突变碱基序列：致病基因的突变碱基序列得以纠正，正常序列部分予以保留。得以纠正，正常序列部分予以保留。o 基因修饰基因修饰(gene augmentation) ：目的基因导入缺陷细胞：目的基因导入缺陷细胞或其它细胞，其表

17、达产物可修饰和改变缺陷细胞的功能或其它细胞，其表达产物可修饰和改变缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。或使原有的功能得到加强。o 基因失活基因失活(gene inactivation)：应用反义技术：应用反义技术(antisense technology)特异封闭某些基因的表达，以达到抑制某些特异封闭某些基因的表达，以达到抑制某些有害基因的表达的目的。有害基因的表达的目的。 基因治疗主要过程基因治疗主要过程病人病人基因诊断基因诊断缺陷基因缺陷基因正常基因正常基因基因导入基因导入健康人健康人基因基因载体载体基因治疗的基本流程基因治疗的基本流程（一）（一）外源基因外源基因的选择与制备的选择与制备

18、 （二）（二）载体载体的选择与构建的选择与构建 （三）（三）靶细胞靶细胞的选择的选择（四）（四）基因转移基因转移 （五）基因转染细胞的（五）基因转染细胞的筛选与鉴定筛选与鉴定（六）（六）回输体内回输体内 （一）外源基因的选择与制备（一）外源基因的选择与制备 在了解疾病发生的分子机制基础上，在了解疾病发生的分子机制基础上， 选择对疾病有治选择对疾病有治疗作用的特定基因疗作用的特定基因。 如对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因如对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因即可用于治疗；即可用于治疗； 对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌

19、基因或抑癌基因用于基因治疗。因或抑癌基因用于基因治疗。 治疗性基因获得的方法很多：治疗性基因获得的方法很多： 用酶切或探针杂交法从基因组用酶切或探针杂交法从基因组DNADNA文库获得，从文库获得，从cDNAcDNA文文库获取，库获取，PCRPCR扩增，人工合成等。扩增，人工合成等。 基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。者体内、并能调控其适度表达。 常用的载体有两类：常用的载体有两类：病毒载体病毒载体和和非病毒载体非病毒载体。 病毒载体：逆转录病毒载体，病毒载体：逆转录病毒载体， 腺病毒载体，腺病毒载体， 腺相关

20、腺相关病毒载体等；病毒载体等； 非病毒载体：与病毒载体的主要区别在于采用理非病毒载体：与病毒载体的主要区别在于采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。化方法将治疗基因转移入患者体内。（二）载体的选择与构建（二）载体的选择与构建 (三三) 靶细胞的选择靶细胞的选择 生殖细胞生殖细胞: : 禁止禁止体细胞：体细胞： 淋巴细胞、造血细胞、淋巴细胞、造血细胞、 内皮细胞、肌肉细胞、内皮细胞、肌肉细胞、 肝细胞、成纤维细胞肝细胞、成纤维细胞 肿瘤细胞等肿瘤细胞等 o可根据疾病的特点、目的基因及其转移的方式可根据疾病的特点、目的基因及其转移的方式等因素来确定。等因素来确定。o 选择的原则：选择的原则： (1

21、) (1) 便于从体内取出和回输；便于从体内取出和回输； (2) (2) 便于在体外培养与增殖；便于在体外培养与增殖； (3) (3) 便于基因的高效转移；便于基因的高效转移； (3) (3) 能够持续表达目的基因。能够持续表达目的基因。Vector DNAHelper DNAEngineering a Virus into a Vectorwildtype virusViral vectorreplicationproteinsstructuralproteinsPackagingTherapeutic geneessential viral genesPackaging cellY Yve

22、ctorVector uncoatingTherapeutic mRNAand proteinEpisomal vectorIntegrated expression cassetteTarget cellGene Transfer 治疗基因治疗基因导入受体细导入受体细胞的方法胞的方法 化学方法化学方法物理方法物理方法膜融合法膜融合法病毒载体法病毒载体法质粒质粒DNADNA直接转移直接转移法法 磷酸钙法磷酸钙法 DEAEDEAE葡聚糖法葡聚糖法 电穿孔法电穿孔法 粒子轰击法（基因枪法）粒子轰击法（基因枪法）（四）基因转移方法（四）基因转移方法 标记基因技术标记基因技术 基因缺陷型受体细胞技术基

23、因缺陷型受体细胞技术 基因共转染技术基因共转染技术 分子杂交技术分子杂交技术 外源基因表达鉴定外源基因表达鉴定( 五五 ) 转导细胞的选择鉴定转导细胞的选择鉴定( 六六 ) 回输体内回输体内将治疗性基因修饰的细胞以不同方式回输体内。将治疗性基因修饰的细胞以不同方式回输体内。基因治疗的应用基因治疗的应用遗传病：遗传病： 替补法，导入正常基因替补法，导入正常基因病毒性疾病：病毒性疾病： 阻断病毒基因在体内的转录和翻译阻断病毒基因在体内的转录和翻译肿瘤：肿瘤： 基因的补充和修复，免疫疗法，细胞毒基因疗法基因的补充和修复，免疫疗法，细胞毒基因疗法 1990 美国医学家美国医学家WF安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶(ADA)(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID)(SCID)p病因:p淋巴细胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆