5-荧光分析法

1、12光致发光光致发光：有些物质受到光照射时，除吸收某有些物质受到光照射时，除吸收某种波长的光外还会种波长的光外还会发射出比原来吸收波长更长的发射出比原来吸收波长更长的光光，当激发光停止照射后，这种光线随之消失。，当激发光停止照射后，这种光线随之消失。这种现象称为。这种现象称为。最常见的是最常见的是荧光和磷光荧光和磷光荧光荧光：物质分子接受光子能量激发后，从激发物质分子接受光子能量激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。态的最低振动能级返回基态时发射出的光。荧光分析法荧光分析法：基于对化合物的荧光光谱测量建立：基于对化合物的荧光光谱测量建立起来的分析方法。起来的分析方法。分类分类：分

2、子荧光和原子荧光分子荧光和原子荧光。根据激发光的波长范围可分为紫外根据激发光的波长范围可分为紫外- -可见荧光；红外可见荧光；红外荧光和荧光和X X射线荧光。射线荧光。3分子的电子能级与激发过程分子的电子能级与激发过程在室温时，大多数分子处在在室温时，大多数分子处在电子基态的最低振动电子基态的最低振动能级能级，当受到一定的辐射能作用就会发生能级之，当受到一定的辐射能作用就会发生能级之间的跃迁。间的跃迁。在基态时在基态时, ,电子成对地填充在能量最低的各轨道。电子成对地填充在能量最低的各轨道。根据保利不相容原理根据保利不相容原理, ,一个给定轨道中的两个电一个给定轨道中的两个电子必定具有相反的自

3、旋子必定具有相反的自旋, ,其自旋量子数其自旋量子数S S分别为分别为1/21/2和和 -1/2, -1/2, 其总的自旋量子数其总的自旋量子数S S总总=0=0基态的多重性基态的多重性2S+1=1,2S+1=1,这种状态称为这种状态称为单重态单重态，以，以S S0 0表示表示一、荧光产生一、荧光产生4当基态电子激发到某高能级时当基态电子激发到某高能级时, , 将有两种激发态将有两种激发态：自旋相反多重性为自旋相反多重性为1 1，称为，称为激发单重态激发单重态，用用S表示表示自旋平行多重性为自旋平行多重性为M=21+1=3，称为称为激发三重态激发三重态（triplet statetriplet

4、 state）用）用T T表示表示5荧光的产生荧光的产生 平行自旋比相反自旋稳定平行自旋比相反自旋稳定( (洪特规则洪特规则) )，三重态，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；基态处于单重态； 基态基态( (S0)激发态激发态( (S1、S2激发态振动能级激发态振动能级) )：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态激发态基态：基态：通过辐射跃迁和无辐射跃迁等通过辐射跃迁和无辐射跃迁等方式释放多余的能量而返回至基态。方式释放多余的能量而返回至基态。 S0T1 禁阻跃迁禁阻跃迁；

5、通过其他途径进入；进入；通过其他途径进入；进入的几率小。的几率小。6S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜越内转换振动弛豫能量l 2l 1l 3 外转换l 2T2内转换振动弛豫7v激发态基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁通过辐射跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁8q 辐射能量传递过程辐射能量传递过程 荧光发射荧光发射：电子由电子由第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基

6、态基态（ 多为 S1 S0跃迁），发射波长为 2的荧光； 10-710 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； 2 2 1 ； 磷光发射磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（ T1 S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 T1禁阻跃迁） S0 激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫 T1 发光速度很慢： 10-410 s 。 光照停止后，可持续一段时间。9q 非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程v 振动弛豫振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发由高振动能级至低相邻振动能级间

7、的跃迁。发生振动弛豫的时间生振动弛豫的时间1010-12-12 s s。v 内部能量转换（内转换）：内部能量转换（内转换）：当两个电子激发态当两个电子激发态之间的能量相差较小，以致其振动能级有重叠之间的能量相差较小，以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。移至低电子能级的过程。10v外转换外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。v体系间跨越体系间跨越：处在

8、激发态的电子发生自旋反转：处在激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。而使分子的多重性发生变化的过程。S S1 1的最低振动能级同的最低振动能级同T T1 1的最高振动能级重叠，的最高振动能级重叠，则有可能发生体系间跨越（则有可能发生体系间跨越（S S1 1 T T1 1） 11二、荧光激发光谱与发射光谱二、荧光激发光谱与发射光谱1.1.荧光检测的基本原理荧光检测的基本原理122.2.荧光的激发光谱和发射光谱荧光的激发光谱和发射光谱激发光谱（激发光谱（excitation spectrum) )：固定测量波长，固定测量波长，将激发光的光源分光，测定不同波长的激发光照射将激发光的

9、光源分光，测定不同波长的激发光照射下所发射的荧光强度的变化，以下所发射的荧光强度的变化，以I IF F 激发激发作图，便作图，便可得到荧光物质的激发光谱。可得到荧光物质的激发光谱。发射光谱或荧光光谱（发射光谱或荧光光谱（fluorescence spectrum) )：固固定激发光波长和强度定激发光波长和强度, , 让物质发射的荧光通过单色让物质发射的荧光通过单色分光分光, ,以测定不同波长的荧光强度以测定不同波长的荧光强度, , 以以I IF F荧光荧光作图，作图，便可得到荧光物质的荧光光谱。便可得到荧光物质的荧光光谱。13200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发

10、光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱14153.3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系（1 1）. .斯托克斯位移斯托克斯位移(Stokes shift)(Stokes shift) 荧光发射波长总比激发光波长的现象，荧光发射波长总比激发光波长的现象，振动弛豫和内转换振动弛豫和内转换消耗了能量。消耗了能量。（2）. .发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量( (如能级如能级图图 2 , 1)，产生不同吸

11、收带，产生不同吸收带，但均回到但均回到第一激发单重态第一激发单重态的最的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如如 2 )。 （3）. . 镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。样）成镜像对称关系。 1617镜像规则的解释镜像规则的解释S0 S2S0 S118三、荧光的产生与分子结构的关系三、荧光的产生与分子结构的关系 1. 1.荧光寿命和荧光效率荧光寿命和荧光效率（1）除去激发光源，分子荧光强度降低到激发时除去激发光源，分子荧光强度降低到激发时

12、最大荧光强度的最大荧光强度的1/2所需的时间所需的时间，称为称为荧光寿命荧光寿命（2）荧光量子产率（荧光效率）。荧光量子产率（荧光效率）。 荧光量子产率荧光量子产率（）：吸收的光量子数发射的光量子数 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；192.2.化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光（1）长共轭结构：长共轭结构：绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环；提高共轭度有利于增加荧光效率或杂环；提高共轭度有利于增加荧光效率（2）

13、分子的刚性：分子的刚性：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。有很强的荧光，酚酞却没有。（3）取代基效应取代基效应：芳环芳环上有供电子基，使荧光上有供电子基，使荧光增强；吸电子基则荧光增强；吸电子基则荧光减弱甚至熄灭。减弱甚至熄灭。两个必备条件：强紫外两个必备条件：强紫外-可见光吸收和一定荧光效率可见光吸收和一定荧光效率2021四、影响荧光强度的外部因素四、影响荧光强度的外部因素1.1. 温度的影响温度的影响荧光强度对温度变化敏感，

14、温度增加，分子间碰撞几荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子间碰撞几率增加，使无辐射跃迁增加，荧光效率降低率增加，使无辐射跃迁增加，荧光效率降低。2.2.溶剂的影响溶剂的影响 溶剂的极性溶剂的极性波长波长荧光强度荧光强度（*跃迁，跃迁， ） 溶剂的粘度溶剂的粘度分子间碰撞分子间碰撞荧光荧光3. 溶液溶液pH 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；的影响较大，需要严格控制；NH3OHHNHNH2OHHpH13224.4. 荧光熄灭剂荧光熄灭剂 引起荧光熄灭的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分引起荧光熄灭的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、

15、羰基和羧基化合物。子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。荧光熄灭法荧光熄灭法：荧光强度的减弱和荧光熄灭剂的浓度呈：荧光强度的减弱和荧光熄灭剂的浓度呈线性关系，从而测定熄灭剂的含量。线性关系，从而测定熄灭剂的含量。5.5.散射光散射光 瑞利光瑞利光：无能量交换，波长同入射光，仅运动方向改变。：无能量交换，波长同入射光，仅运动方向改变。 拉曼光拉曼光：有能量交换，波长、方向均发生改变。：有能量交换，波长、方向均发生改变。 当拉曼光波长与荧光波长接近时，对荧光测定产生干扰。当拉曼光波长与荧光波长接近时，对荧光测定产生干扰。 选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰。选择适当的激发波长可消除拉曼

16、光的干扰。23241. 定量依据定量依据 荧光强度荧光强度F 正比于荧光吸收的光量正比于荧光吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ： F = K Ia Ia=I0-I 由朗伯由朗伯-比尔定律：比尔定律： Ia = I0(1-10-Ecl ) F = K I0(1-10-Ecl ) = K I0(1-e-2.3Ecl ) 浓度很低时，浓度很低时， Ecl0.05，将括号项近似处理后：，将括号项近似处理后： F = 2.3 K I0 Ecl = Kc252. 定量分析方法定量分析方法a.a.标准曲线法：标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；上求出浓度；b.比较法：比较法： 若曲线通过原点，且完全符合浓度的线性范围，用标样若曲线通过原点，且完全符合浓度的线性范围，用标样对照测定试样的浓度表达式为：对照测定试样的浓度表达式为：