课题3分解纤维素微生物分离2013.6.4

1、课题分解纤维素的微生物的分课题分解纤维素的微生物的分离离（一）纤维素与纤维素酶（一）纤维素与纤维素酶1、纤维素、纤维素纤维素是一种由纤维素是一种由葡萄糖葡萄糖首尾相连而成的首尾相连而成的高分子高分子化合物，是含量最丰富的化合物，是含量最丰富的多糖多糖类物质。类物质。一、基础知识一、基础知识植物的根、茎、叶等器官都含有大量的植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物高的天然产物。土壤中某些微生物能够产生纤维素酶土壤中某些微生物能够产生纤维素酶, ,把把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。纤维素分解为葡萄糖，后再利用。 纤维

2、素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过年产生的纤维素超过70亿吨，其中亿吨，其中40%-60%能被土壤能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。 在草食性动物等的消化道内，也在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的共生有分解纤维素的微生物微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。人没有分解纤维素的能力。 人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等废弃物转变人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等废弃物转变成酒精

3、，用纤维素酶处理服装面料等。成酒精，用纤维素酶处理服装面料等。2、纤维素酶、纤维素酶 纤维素酶是一种纤维素酶是一种复合酶复合酶，一般认为它，一般认为它至少包至少包括三种组分括三种组分，即，即C1酶酶(外切酶外切酶)、CX酶酶(内切酶内切酶)和和葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素取二支取二支20mL的试管的试管各加入一张滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加入pH4.8，物质量为，物质量为0.1

4、mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和和10ml在乙试管中加入在乙试管中加入1mL纤维素酶纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，放在两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h结果：乙试管的滤纸条消失结果：乙试管的滤纸条消失实验：纤维素酶分解纤维素的实验实验：纤维素酶分解纤维素的实验甲甲 乙乙 讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？ 甲试管的作用是什么？甲试管的作用是什么？本实验的本实验的自变量是纤维素酶的有无自变量是纤维素酶的有无。自变量的操纵方法是：在一支试管中添加适量自变量的操纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL）的

5、纤维素酶溶液，在另一支试管不添）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的入蒸馏水，否则会影响溶液的pH。实验分析：实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？的小实验是如何构成对照的？刚果红染色法刚果红染色法原理：原理：刚果红能与纤维素形成红色复合物刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，时，刚果红刚果红能与培养基中的能与培养基中的纤维素纤维

6、素形成形成红色复合红色复合物物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维以纤维素分解菌为中心的透明圈素分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以，这样我们就可以通过通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选哪种纤维素分解菌分解纤维素的能力最强？哪种纤维素分解菌分解纤维素的能力最强？二、实验设计二、实验设计请你根据实验流程图和提供的三个资料以及请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操操作提示作提示”，在思考有

7、关问题的基础上，设计出一个详细，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。的实验方案。土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释 将样品涂布在鉴别纤将样品涂布在鉴别纤 维素分解菌的培养基上维素分解菌的培养基上 筛选产生透筛选产生透 明圈的菌落明圈的菌落操作步骤操作步骤1、土壤取样：、土壤取样：分布环境：分布环境：富含纤维素的环境中富含纤维素的环境中原因原因生物与环境的互相依存关系，在富含纤生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普

8、通环境。高于普通环境。实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。积累的枯枝败叶等。讨论讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？为滤纸应该埋在土壤中多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境的适宜环境。一般应将滤纸埋于。一般应将滤纸埋于深约深约10cm左右左右的土壤中。的土壤中。2、

9、选择培养、选择培养 目的：目的： 增加纤维素分解菌的浓度增加纤维素分解菌的浓度， 以确保能够从样品中分离所需要的微生物。以确保能够从样品中分离所需要的微生物。制备选择培养基：制备选择培养基：操作：操作：将土样加入装有将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养荡培养12天，直至培养液变浑浊。也可重复天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。选择培养。 培养基成分分析培养基成分分析培养基组成培养基组成提供主要的营养物质提供主要的营养物质 纤维素粉纤维素粉 5g碳源（能源）碳源（能源） NaNO3 1

10、g氮源、无机盐氮源、无机盐 KCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2g KH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g无机盐无机盐酵母膏酵母膏 0.5g生长因子、碳源、氮源生长因子、碳源、氮源水解酪素水解酪素 0.5g氮素、生长因子氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至溶解后，蒸馏水定容至1000mL水水P29：回答下列问题：回答下列问题1、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？么？ 是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）。是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）。2、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，、这个

11、培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？是如何进行选择的？有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。解纤维素的微生物可以大量繁殖。3、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照，或者将纤维素改为可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照，或者将纤维素改为葡萄糖。葡萄糖。说明：说明：分析分析“纤维素分解菌的选择培养基纤维素分解菌的

12、选择培养基配方配方”可知，该配方中的可知，该配方中的酵母膏也能够提供少酵母膏也能够提供少量的碳源量的碳源，因此，因此其他微生物也能在该培养基中其他微生物也能在该培养基中生长繁殖生长繁殖。只不过，由于。只不过，由于酵母膏的含量极少酵母膏的含量极少，因此，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能只有以纤维素为碳源的微生物才能大量大量繁殖繁殖。P29旁栏思考题：旁栏思考题：为什么选择培养能够为什么选择培养能够“浓缩浓缩”所需的微生物？所需的微生物？在选择培养的条件下，可以使那些能够在选择培养的条件下，可以使那些能够适应适应这种营养条件的微生物得到这种营养条件的微生物得到迅速繁殖迅速繁殖，而那些而那些不适

13、应不适应这种营养条件的微生物的繁殖这种营养条件的微生物的繁殖被抑制被抑制，因此可以起到，因此可以起到“浓缩浓缩”的作用。的作用。比较项目比较项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基类型培养基类型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法将细菌涂布在只将细菌涂布在只有尿素做氮源的有尿素做氮源的选择培养基上选择培养基上将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源的纤维素粉做碳源的选择培养基上选择培养基上固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株选择培养选择培养纤维素分解菌与分解尿素的细菌纤维素分解菌与分解尿素的细菌选择和鉴

14、定知识的比较选择和鉴定知识的比较思考：思考：本实验的流程与课题本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？中的实验流程有哪些异同？ 本实验流程与课题本实验流程与课题2的流程的区别如下：的流程的区别如下：课题课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到得到菌落。菌落。本课题通过本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。骤基本一致。 按照课题按照课题1的稀释操作方法，将选

15、择培养后的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释的培养基进行等比稀释101107倍。倍。3、梯度稀释、梯度稀释1011021031041051064、将样品涂布到、将样品涂布到鉴别纤维素分解菌鉴别纤维素分解菌的培养基上的培养基上（1）制备鉴别培养基）制备鉴别培养基鉴别纤维素分解菌的培养基鉴别纤维素分解菌的培养基（2）涂布平板：）涂布平板：将稀释度为将稀释度为104106的菌悬液各取的菌悬液各取0.1ml涂布到涂布到平板培养基上，平板培养基上，30倒置倒置培养。培养。培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养物质CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生长因

16、子碳源、氮源、生长因子KH2PO4 0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL碳源、生长因子碳源、生长因子琼脂琼脂 15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏上述物质溶解后，加蒸馏水定容至水定容至1000mL氢元素、氧元素氢元素、氧元素 5、刚果红染色法、刚果红染色法 挑选产生透明圈的菌落，挑选产生透明圈的菌落， 一般即为分解纤维素的菌落。一般即为分解纤维素的菌落。方法一：先方法一：先 ，再加入刚果红进行颜，再加入刚果红进行颜色反应。色反应。方法二：在方法二：在 时就加入刚果红。时就加入刚果红。倒平板倒平板培养微生物培养微生物思考：方法一中思考：方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？漂洗作

17、用漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断用这方法可以判断酶活力的大小酶活力的大小，实际，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维

18、素的能就强！圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！ 这两种染色方法各有哪些优点与不足？这两种染色方法各有哪些优点与不足？（见优化方案（见优化方案P23要点一）要点一）染色法染色法优点优点缺点缺点方法一：方法一：先培养微生先培养微生物，再加入物，再加入刚果红刚果红方法二：方法二：倒平板时加倒平板时加入刚果红入刚果红颜色反应基本颜色反应基本上是纤维素分上是纤维素分解菌的作用解菌的作用操作繁琐，操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生刚果红会使菌落之间发生混杂混杂操作简便，不操作简便，不存在菌落混杂存在菌落混杂问题问题1、产生淀粉酶的微生物、产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈也产生模糊透明圈2、有些微生物能

19、降解色、有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。素，形成明显的透明圈。比较项目比较项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基类型培养基类型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法将细菌涂布在只有尿素将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上做氮源的选择培养基上将细菌涂布在只有纤维素将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源的选择培养基上粉做碳源的选择培养基上固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株选择培养选择培养纤维素分解菌与分解尿素的细菌纤维素分解菌与分解尿素的细菌选择和鉴定知识的比较选择和鉴定知识的比较在细菌分解尿素的化学反在细

20、菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚升高。在培养基中加入酚红指示剂，如果红指示剂，如果pH升高升高指示剂会变红。指示剂会变红。刚果红可以与纤维素形成刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。菌为中心的透明圈。观察菌落周围是否有观察菌落周围是否有着着色的环带色的环带出现来鉴定尿出现来鉴定尿素分解

21、菌素分解菌观察菌落周围是否出现观察菌落周围是否出现透明圈透明圈来筛选纤维素分来筛选纤维素分解菌解菌脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法在在产生明显的透明圈产生明显的透明圈的菌落，挑取并的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C 370C培养，可获得培养，可获得纯化培养纯化培养。6、纯化培养、纯化培养四、结果分析与评价四、结果分析与评价1、培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出、培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落。菌落。对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。了分解纤维素的微生物。2、分离的结果是否一致。、分离的结果是否一致。由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真