环境工程微生物学实验 (2)

1、环境工程微生物学实验环境工程微生物学实验 一、显微镜的结构一、显微镜的结构显微镜显微镜机械部分机械部分光学部分光学部分镜座、镜柱、镜臂、镜座、镜柱、镜臂、镜筒镜筒倾斜关节、转换器倾斜关节、转换器载物台载物台目镜、物镜目镜、物镜遮光器遮光器反光镜反光镜二二.显微镜的使用显微镜的使用一、取镜和安放一、取镜和安放1 1右手握住镜臂，左右手握住镜臂，左手托住镜座手托住镜座 2 2把显微镜放在实验台上，把显微镜放在实验台上，略偏左（显微镜放在距实验略偏左（显微镜放在距实验台边缘台边缘7 7厘米左右）。安装厘米左右）。安装好目镜和物镜。好目镜和物镜。显微镜的使用显微镜的使用二、对光二、对光3转动转换器，使

2、低倍物转动转换器，使低倍物镜对准通光孔镜对准通光孔(物镜的前端物镜的前端与载物台要保持与载物台要保持5厘米的距厘米的距离离)。显微镜的使用显微镜的使用显微镜的使用显微镜的使用三、观察三、观察 5 5把所要观察的玻片把所要观察的玻片标本放在标本放在 载物台上，用载物台上，用压片夹压住，标本要正压片夹压住，标本要正对通光孔的中心。对通光孔的中心。6 6转动粗准焦螺旋，使转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，直到物镜镜筒缓缓下降，直到物镜接近玻片标本为止（眼接近玻片标本为止（眼 睛看着物镜，以免物镜碰睛看着物镜，以免物镜碰到玻片标本）。到玻片标本）。7 7向目镜内看，同时反向目镜内看，同时反方向转动粗准焦

3、螺旋，使方向转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升，直到看清镜筒缓缓上升，直到看清物像为止。再略微转动细物像为止。再略微转动细准焦螺旋，使看到的物像准焦螺旋，使看到的物像更加清晰。更加清晰。显微镜的使用显微镜的使用8、换高倍物镜：、换高倍物镜：如果进一步使用高倍物镜观察，应如果进一步使用高倍物镜观察，应在转换高倍物镜之前，在转换高倍物镜之前，把物像中需要放大观察的部分把物像中需要放大观察的部分移至视野中央移至视野中央（将低倍物镜转换成高倍物镜观察时，（将低倍物镜转换成高倍物镜观察时，视野中的物像范围缩小了很多）。视野中的物像范围缩小了很多）。如果换高倍物镜后如果换高倍物镜后物像不一定很清晰，可以转动细

4、准焦螺旋进行调节物像不一定很清晰，可以转动细准焦螺旋进行调节。 在转换高倍物镜并且看清物像之后，可以根据需要调在转换高倍物镜并且看清物像之后，可以根据需要调节光圈或聚光器，使光线符合要求（一般将低倍物镜节光圈或聚光器，使光线符合要求（一般将低倍物镜换成高倍物镜观察时，视野要稍变暗一些，所以需要换成高倍物镜观察时，视野要稍变暗一些，所以需要调节光线强弱）。调节光线强弱）。 1.转动反光镜使视野明亮转动反光镜使视野明亮2.在低倍镜下观察清楚后，把要在低倍镜下观察清楚后，把要放大观察的物像移至视野中央放大观察的物像移至视野中央3.转动转换器，换成高倍物镜转动转换器，换成高倍物镜4.观察并用细准焦螺旋

5、调焦观察并用细准焦螺旋调焦高倍镜的使用高倍镜的使用取镜和安放对光（选择低倍镜、反光镜、光圈）固定装片转动粗准焦螺旋，镜筒缓缓下降（目视物镜与装片之间）反向转动粗准焦螺旋，镜筒上升，直至看到物像移动目标至视野中央更換高倍物镜转动细准焦螺旋至标本影像清晰为止调节反光镜、光圈光学显微镜光学显微镜载物台上升载物台下降3.使用显微镜的注意事项使用显微镜的注意事项 （1）显微镜安放位置，）显微镜安放位置， 显微镜应安放在离桌边缘显微镜应安放在离桌边缘5 cm、镜筒向前，、镜筒向前，并讲清显微镜位置稍靠左侧的道理（两眼同时并讲清显微镜位置稍靠左侧的道理（两眼同时睁开观察，眼不易疲劳，便于绘图。）睁开观察，眼

6、不易疲劳，便于绘图。） （2） 对光根据光线的强弱来选择平面镜或凹对光根据光线的强弱来选择平面镜或凹面镜；用低倍镜进行对光，把低倍镜位置放低；面镜；用低倍镜进行对光，把低倍镜位置放低；在转动转换器时，物镜到位，光圈调节好，在转动转换器时，物镜到位，光圈调节好，视视野光线均匀、明亮野光线均匀、明亮. （3）正确使用高倍物镜的方法）正确使用高倍物镜的方法 由于高倍物镜的工作距离小，镜头易损坏，由于高倍物镜的工作距离小，镜头易损坏，,并且把光圈开大。并且把光圈开大。 （4）重视准焦螺旋的使用）重视准焦螺旋的使用 在使用高倍物镜时，不要调节粗准焦螺旋，在使用高倍物镜时，不要调节粗准焦螺旋，避免物镜损坏

7、、装片压烂。避免物镜损坏、装片压烂。 （5）不是倍数越大，越清晰）不是倍数越大，越清晰 如果目镜倍数过大，得到的放大虚像则很不如果目镜倍数过大，得到的放大虚像则很不清晰。在低倍镜下能看清楚的物像，不必用高清晰。在低倍镜下能看清楚的物像，不必用高倍镜观察。倍镜观察。 3.使用显微镜的注意事项使用显微镜的注意事项视野中物像与标本移动的关系：视野中物像与标本移动的关系：如视野中某观察对象位于左下方如如视野中某观察对象位于左下方如何移到中央，应将装片或切片向左何移到中央，应将装片或切片向左下方移动（下方移动（同向移动同向移动）。原因是视）。原因是视野中物像移动的方向或切片移动的野中物像移动的方向或切片

8、移动的方向相反方向相反 使用高倍镜观察的步骤和要点是：使用高倍镜观察的步骤和要点是：（1）首先用低倍镜观察，找到要观察的物）首先用低倍镜观察，找到要观察的物像，移到视野的中央。像，移到视野的中央。 （2）转动转换器，用高倍镜观察，并轻轻）转动转换器，用高倍镜观察，并轻轻转动细准焦螺旋，直到看清楚材料为止。转动细准焦螺旋，直到看清楚材料为止。高倍显微镜的使用高倍显微镜的使用 （1）是低倍镜还是高倍镜的视野大，视野明亮？为什么？）是低倍镜还是高倍镜的视野大，视野明亮？为什么？低倍镜的视野大，通过的光多，放大的倍数小；低倍镜的视野大，通过的光多，放大的倍数小；高倍镜的视野小，通过的光少，但放大的倍数

9、高。高倍镜的视野小，通过的光少，但放大的倍数高。 （2）为什么要先用低倍镜观察清楚后，把要放大观察的）为什么要先用低倍镜观察清楚后，把要放大观察的物像移至视野的中央，再换高倍镜观察物像移至视野的中央，再换高倍镜观察? 如果直接用高倍镜观察，往往由于观察的对象不在如果直接用高倍镜观察，往往由于观察的对象不在视野范围内而找不到。视野范围内而找不到。 因此，需要先用低倍镜观察清楚，并把要放大观察因此，需要先用低倍镜观察清楚，并把要放大观察的物像移至视野的中央，再换高倍镜观察。的物像移至视野的中央，再换高倍镜观察。 （3）用转换器转过高倍镜后，转动粗准焦螺旋行不行？）用转换器转过高倍镜后，转动粗准焦螺

10、旋行不行？不行。用高倍镜观察，只需微调即可。不行。用高倍镜观察，只需微调即可。转动粗准焦螺旋，容易压坏玻片。转动粗准焦螺旋，容易压坏玻片。 污点判断：污点判断：玻片移，污点移，则污点在玻片上；玻片移，污点移，则污点在玻片上；物镜换，污点移，则污点在物镜上；物镜换，污点移，则污点在物镜上；目镜转，污点移，则污点在目镜上目镜转，污点移，则污点在目镜上 目镜目镜5X、物镜、物镜4X、视野中央有一排、视野中央有一排细胞共细胞共15个。若把物镜换成个。若把物镜换成10X，则，则细胞数目为（细胞数目为（ ）个。）个。因为视野中的因为视野中的细胞数目与放大倍数成反比细胞数目与放大倍数成反比；若目镜；若目镜5

11、X，物镜，物镜4X，视野中共有，视野中共有50个细胞，个细胞，再把物镜换成再把物镜换成10X，则视野中有（，则视野中有（ ）个细胞。个细胞。因为视野中看到的实物的范因为视野中看到的实物的范围与放大倍数的平方成反比围与放大倍数的平方成反比。练习：练习：洋葱鳞叶表皮细胞(1010)洋葱鳞叶表皮细胞(1040)洋葱鳞叶表皮细胞(1040)洋葱鳞叶表皮细胞装片（10 40）细胞壁细胞壁细胞核细胞核细胞质细胞质(液泡液泡)微生物细胞的计数微生物细胞的计数目的要求目的要求 1.1.了解血球计数板的结构及计数了解血球计数板的结构及计数原理。原理。 2 2、掌握使用血球计数板进行微、掌握使用血球计数板进行微生

12、物计数的方法。生物计数的方法。 实验原理实验原理 测定微生物数量方法很多，通常采用的有显测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法、平板计数法和光电比浊计数法。微镜直接计数法、平板计数法和光电比浊计数法。 显微镜直接计数法显微镜直接计数法 将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，又称血球计数板，有确定面积和容积的载玻片上，又称血球计数板，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。方法。血球计数板的构造血球计数板的构造血球计数板的计算方法血球计数板的计算方法 血球计数板上刻有

13、一长宽各为血球计数板上刻有一长宽各为1 1毫米的方形大格，其毫米的方形大格，其体积为体积为0.1mm0.1mm3 3。计数板有两种刻度，一种是每大格分为。计数板有两种刻度，一种是每大格分为1616个中格，而每中格又分个中格，而每中格又分2525个小格，每大格为个小格，每大格为16162525小格小格=400=400小格，而另一种，则是每大格分为小格，而另一种，则是每大格分为2525个中格，而每中个中格，而每中格又分为格又分为1616个小格，则每大格为个小格，则每大格为252516=40016=400小格（计数板小格（计数板上的标识为上的标识为XBXBK25K25） 计数时，如果使用计数时，如果

14、使用16格格25格规格的计数室，要按对格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格（即个中格（即100个个小格）的酵母菌数。如果使用小格）的酵母菌数。如果使用25 格格 16格规格的计数室格规格的计数室除了取其除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格个对角方位外，还需再数中央的一个中格(即即80个小方格个小方格)的酵母菌数。的酵母菌数。(6)当遇到位于大格线上的酵母菌，一般只计数大方格的当遇到位于大格线上的酵母菌，一般只计数大方格的上方和左方线上的酵母细胞上方和左方线上的酵母细胞(或只计数下方和右方线上的或只计数下方和右方线上的酵母细胞酵

15、母细胞)。计数公式计数公式 (1)1625的血球计数板计算公式：的血球计数板计算公式： 酵母细胞数酵母细胞数ml=（100小格内酵母细胞个数小格内酵母细胞个数 100）40010000稀释倍数稀释倍数 (2)25x16的血球计数板计算公式：的血球计数板计算公式： 酵母细胞数酵母细胞数ml=（80小格内酵母细胞个数小格内酵母细胞个数80）40010000稀释倍数稀释倍数实验器材实验器材 显微镜、血球计数板、酵母菌液、盖玻显微镜、血球计数板、酵母菌液、盖玻片、吸管、吸水纸。片、吸管、吸水纸。操作步骤操作步骤1. 镜检计数室镜检计数室 对计数板进行镜检。若有污物，对计数板进行镜检。若有污物，则用自来

16、水冲洗，用电吹风吹干后则用自来水冲洗，用电吹风吹干后 才能才能 进行计数。进行计数。2. 加样品加样品 在血球计数板上盖上盖玻片在血球计数板上盖上盖玻片, , 用滴用滴管将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴管将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴, ,菌液菌液会自动进入计数室，静置会自动进入计数室，静置5 5分钟。分钟。3. 计数计数 将血球计数板置于载物台上，先用低倍将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。 25个中格个中格的的取计数板四角和中间位置的五个中方格计菌数。重取计数板四角和中间位置的五个中方格计菌数。重复计复

17、计2-32-3次，取其平均值，按公式计算每毫升酵母菌液次，取其平均值，按公式计算每毫升酵母菌液中菌体的个数。中菌体的个数。4.清洗血球计数板清洗血球计数板 计数后将血球计数板用自来水计数后将血球计数板用自来水冲洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则冲洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必须重复洗涤干净为止。必须重复洗涤干净为止。结果记录结果记录 第一个第一个中格中格第二个第二个中格中格第三个第三个中格中格第四个第四个中格中格第五个第五个中格中格第一次第一次测测 定定第二次第二次测测 定定第三次第三次测测 定定平平 均均思考题思考题 1.1.使用血球计数板应注意什么问题使用血球计数

18、板应注意什么问题? ? 2. 2.试分析影响本实验结果的误差来源并提出试分析影响本实验结果的误差来源并提出改进措施改进措施实验二实验二 培养基的配制和灭菌培养基的配制和灭菌 实验目的实验目的 1.熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。 2.掌握培养基和无菌水的制备方法。掌握培养基和无菌水的制备方法。 3.掌握高压蒸气灭菌技术。掌握高压蒸气灭菌技术。实验原理实验原理 培养基是用人工的办法将多种营养物培养基是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。培养基中均应含有满足微生物营养基质。培养基中均应含有满足

19、微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素素外外还应具有适宜的酸碱度还应具有适宜的酸碱度pH值值、缓、缓冲能力、氧化还原电位和渗透压。冲能力、氧化还原电位和渗透压。 实验器材实验器材(1)药品和试剂：牛肉膏、蛋白陈、药品和试剂：牛肉膏、蛋白陈、NaCl、10NaOH溶液、溶液、l0盐酸溶液、琼脂、水盐酸溶液、琼脂、水(2)器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、1000mL刻度烧杯、玻棒、玻璃珠、刻度烧杯、玻棒、玻璃珠、pH试纸、试纸、试管、分装漏斗

20、、棉花。试管、分装漏斗、棉花。高压蒸气灭菌锅、高压蒸气灭菌锅、烘箱。烘箱。实验步骤实验步骤 一、玻璃器皿的洗涤和包装一、玻璃器皿的洗涤和包装 清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。 棉塞的制作棉塞的制作 包装培养皿和移液管等包装培养皿和移液管等。 2-1棉塞制作方法2-2移液管灭菌前的包装二、培养基的配制二、培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基的配制 （一）（一）培养基配方：培养基配方： 牛肉膏牛肉膏2.5g 蛋白胨蛋白胨5.0g、NaCl2.5g、琼脂、琼脂10.0g、自来水、自来水500mL、pH7.27.4。 （二）

21、（二）操作步骤：操作步骤： 1. 取一个取一个1000mL烧杯，装烧杯，装500mL蒸馏水。蒸馏水。 2. 按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶解。解。注意：注意：a. 前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分 b. 蛋白胨、肉膏可加热促进溶解蛋白胨、肉膏可加热促进溶解 c. 加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适当补充加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适当补充因蒸发而损失的水量。因蒸发而损失的水量。 3. 调调pH值值：用：用10 NaOH调调pH至至7.27.4，用精密，用精密pH试纸对试纸对照。照。 4

22、.过滤过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可省略。省略。 5. 分装分装：将培养基分装于：将培养基分装于5支试管，其余全部倒入支试管，其余全部倒入250mL锥形锥形瓶中，分别塞上棉塞。瓶中，分别塞上棉塞。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染或瓶口上面造成污染(见图见图23)。分装量：固体培养基约为试。分装量：固体培养基约为试管高度的管高度的15，灭菌后制成斜面（图，灭菌后制成斜

23、面（图24）。分装入锥形瓶内）。分装入锥形瓶内以不超过其容积的以不超过其容积的3/53/5为宜。半固体培养基以试管高度的为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为为宜灭菌后垂直待凝。宜灭菌后垂直待凝。注意不要污染棉塞和瓶口注意不要污染棉塞和瓶口。 6. 包扎成捆包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。，挂上标签，注明何种培养基。 7. 灭菌备用灭菌备用：灭菌条件：灭菌条件：1210C（相当蒸汽压力（相当蒸汽压力0.103MPa）培）培养基灭菌后必须在养基灭菌后必须在37下恒温培养下恒温培养24h，确定无菌生长，方可，确定无菌生长，方可使用。使用。图 例图23培养基分装 图24 斜面制作 三、稀释水的制

24、备三、稀释水的制备 1.取一个取一个250mL的锥形瓶装的锥形瓶装90(或或99)mL蒸蒸馏水，放馏水，放30颗玻璃珠颗玻璃珠(用于打破活性污泥、用于打破活性污泥、菌块或土壤颗粒菌块或土壤颗粒)于锥形瓶内，塞棉塞、包于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。扎，待灭菌。 2.另取另取5支支18mm180mm的试管，分别装的试管，分别装9mL蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。 无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。 四、灭菌四、灭菌 加热灭菌有加热灭菌有干热灭菌和湿热灭菌干热灭菌和湿热灭菌。 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器干热灭

25、菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 干热灭菌的操作方法干热灭菌的操作方法 a. 将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调节至节至160并维持并维持2h； b. 把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度降到降到50左右，才能将物品取出。左右，才能将物品取出。湿热灭菌：高压蒸气灭菌法湿热灭菌：高压蒸气灭菌法 高压蒸气灭菌法的操作步骤如下：高压蒸气灭菌法的操作步骤如下： 1. 灭菌锅内加入一定量的水。灭菌锅内加入一定量的水。 2. 将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。 注意：器物不能装得太满。注意：器物不能装得太满

26、。 3. 接通电源，进行加热。接通电源，进行加热。 4. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待温度计指示温度为温度计指示温度为100时关闭排气阀；或当排时关闭排气阀；或当排出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。 5. 当压力达当压力达1.05kg/cm2(灭菌器内的温度为灭菌器内的温度为121)即开始灭菌即开始灭菌，使其维持，使其维持1530min。对。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力质时，应适当降低压力(0.56kg/cm2) ，延长时，

27、延长时间。间。 6. 灭菌时间一到，切断电源，灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩余水。品，排出锅内剩余水。 7. 待培养基冷却后置于待培养基冷却后置于37恒温箱内培养恒温箱内培养24h，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。间歇灭菌法：间歇灭菌法： 即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培养基的灭即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培养基的灭菌。菌。 操作方法：操作方法： a. 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，

28、每天蒸煮1次，每次在次，每次在100煮沸煮沸3060min，连续，连续3d重复进重复进行。行。 b. 在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37恒温条件下培养恒温条件下培养24h，这样可以使每次蒸煮后，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。杀灭。 c. 第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放在放在 37恒温条件下培养恒温条件下培养24h，确定无菌才能使用。，确定无菌才能使用。 过滤除菌法：过滤除菌法：不能用加热灭菌的液体物质（如维

29、生素、血清），一般可用不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。细菌过滤器进行除菌。用于除菌的滤器：a.蔡氏滤器，b.注射器装置滤器思考题思考题 1.配制培养基有哪几个步骤配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意在操作过程中应注意些什么问题些什么问题?为什么为什么? 2.培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培 养基进行无菌检查？养基进行无菌检查？ 3.3.高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快

30、速降压，并要再放尽锅内蒸在灭菌后不能骤然快速降压，并要再放尽锅内蒸汽才能打开锅盖汽才能打开锅盖? 细细菌纯种分离、培养和接菌纯种分离、培养和接种技术种技术实验目的实验目的 1.掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分离培养细菌的方法，从圾、堆肥等）中分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能。而获得若干种细菌纯培养技能。 2.掌握几种接种技术。掌握几种接种技术。实实 验验 器器 材材 无菌培养皿无菌培养皿(直径直径90mm)10套、无菌移套、无菌移液管液管1mL2支、支、10mL1支。支。 营养琼脂培养基营养琼脂培养基1瓶，活性污泥或土壤或

31、瓶，活性污泥或土壤或湖水湖水1瓶，无菌稀释水瓶，无菌稀释水90mL1瓶、瓶、9mL5管。管。 其它：接种环、酒精灯、恒温箱。其它：接种环、酒精灯、恒温箱。实实 验验 步步 骤骤一、细菌的纯种分离一、细菌的纯种分离 (一一)稀释平板法稀释平板法 1. 取样取样 用无菌锥形瓶到现场取一定量的湖水，迅速带回实验室。用无菌锥形瓶到现场取一定量的湖水，迅速带回实验室。 2. 稀释水样稀释水样 将将1瓶瓶90mL和和5管管9mL无菌水排列好，用记号笔依次编上无菌水排列好，用记号笔依次编上101、 102、103、104、105、106。在无菌操作条。在无菌操作条件下，用件下，用10mL的无菌移液管吸取的无

32、菌移液管吸取10mL水样水样(或其它样品或其它样品)加入编号为加入编号为101无菌水无菌水(内含玻璃珠内含玻璃珠)中，将移液管吹洗三中，将移液管吹洗三次，用手摇次，用手摇10min将颗粒状样品打散。即为将颗粒状样品打散。即为101浓度的菌浓度的菌液。用液。用1mL无菌移液管吸取无菌移液管吸取1mL 101浓度的菌液于编号浓度的菌液于编号为为102无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为102浓浓度菌液。同样方法，依次稀释到度菌液。同样方法，依次稀释到106 。稀释液的制备稀释液的制备10mL试样 90mL蒸馏水 3. 平板的制作平板的制作 取取10套无菌培养皿编

33、号，套无菌培养皿编号， 104、105、106各各3个，另一个个，另一个为空气对照。为空气对照。 取取1支支1mL无菌移液管从无菌移液管从浓度小的菌液浓度小的菌液开始，以开始，以106、105、104为序分别吸取为序分别吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内菌液于相应编号的培养皿内(每次吸取每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀)。 加热培养基，当其冷至加热培养基，当其冷至45左左右时，右手拿装有培养基的锥形右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食名指和小指托住皿底，拇指和食指

34、夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置分混匀，冷凝后即成平板，倒置于于30培养培养2448h，然后观察，然后观察结果。结果。 a:皿法皿法 b:倒平板倒平板 取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖盖10min后盖上，倒置于后盖上，倒置于30培养培养2448h，然，然后观察结果。后观察结果。（二）平板划线法（二）平板划线法 1. 平板制作：平板

35、制作：将融化并冷至约将融化并冷至约50的肉膏蛋白的肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。板。 2. 划线：划线：用接种环挑取一环样品，左手拿培养用接种环挑取一环样品，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线在平板上轻轻划线(切勿划破培养基切勿划破培养基)。划线完毕。划线完毕盖好皿盖，盖好皿盖，30培养培养2448h

36、后观察结果。后观察结果。平板划线分离的划线方法 左：连续划线法（1，2依次划线的起点）右：分区划线法（1，2，3，4依次划线的起点）二、二、细菌的接种技术细菌的接种技术 接种方法：常用的有接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法。试管深层固体培养基的穿刺接种法。 接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。种铲或接种锄、玻璃涂棒等。（一）斜面接种法（一）斜面接种法 左手平托两支试管，拇指压住两支试左手平托两支试管，拇指压住两支试管

37、。外侧是菌种试管，内侧是待接种的空管。外侧是菌种试管，内侧是待接种的空白斜面白斜面(两支试管的斜面同时向上两支试管的斜面同时向上) 。右手。右手将棉塞旋松，以便在接种时容易拔出。将棉塞旋松，以便在接种时容易拔出。 右手拿接种环，在火焰上先将右手拿接种环，在火焰上先将环端环端烧烧红灭菌，然后红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部将有可能伸入试管的其余部位位也过火灭菌。也过火灭菌。 将两支试管的上端并齐，靠近火焰，将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指、无名指和手掌将两支试管的用右手小指、无名指和手掌将两支试管的棉塞一并夹住拔出，棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中棉塞仍夹在手中，然，然后让试管口缓

38、缓过火焰。后让试管口缓缓过火焰。123 将已灼烧过的接种环伸入菌种试管内。将已灼烧过的接种环伸入菌种试管内。先冷却先冷却，而，而后再用环挑取少许菌种，将接种环抽出并迅速伸入后再用环挑取少许菌种，将接种环抽出并迅速伸入待接种试管底部，在斜面上待接种试管底部，在斜面上由底部向上划线由底部向上划线。抽出。抽出接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最后再次接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最后再次烧红接种环，则接种完毕。烧红接种环，则接种完毕。45678（二）液体接种和穿刺接种（二）液体接种和穿刺接种1.液体接种法液体接种法(从斜面菌种接入培养液从斜面菌种接入培养液)：用：用接种环接种环挑取斜面菌挑取

39、斜面菌种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将环上的菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试环上的菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试管轻轻撞击手掌使菌体在培养液中均匀分布。最后将接种环管轻轻撞击手掌使菌体在培养液中均匀分布。最后将接种环烧红灭菌。烧红灭菌。2.穿刺接种法穿刺接种法(从斜面菌种接入从斜面菌种接入(半半)固体培养基固体培养基)：用：用接种针接种针经火经火焰灭菌后，挑取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心焰灭菌后，挑取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后穿刺线缓慢将针抽出，塞上棉塞。烧红

40、接种针至底部，然后穿刺线缓慢将针抽出，塞上棉塞。烧红接种针灭菌，则接种完毕。灭菌，则接种完毕。（三）稀释平板涂布法（三）稀释平板涂布法1.稀释样品：方法同稀释平板分离法稀释样品：方法同稀释平板分离法2.倒平板：将融化并冷至倒平板：将融化并冷至50左右的培养基倒入无菌培养皿中，左右的培养基倒入无菌培养皿中，冷凝后即成平板冷凝后即成平板3.用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的标志样品液于平板用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的标志样品液于平板上，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀上，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀4.将培养皿正摆在恒温箱中，调节一定温度进行培养。如果培将培养皿正摆在恒温箱中

41、，调节一定温度进行培养。如果培养时间较长，次日把培养皿倒置继续培养，直至长出菌落。养时间较长，次日把培养皿倒置继续培养，直至长出菌落。（四）液体培养基中的菌种接入液体培养基（四）液体培养基中的菌种接入液体培养基 接种工具：无菌移液管和无菌滴管接种工具：无菌移液管和无菌滴管 移液管和滴管不能在火焰上烧，应预先灭菌移液管和滴管不能在火焰上烧，应预先灭菌 用无菌移液管自菌种管中吸取一定量的菌液接用无菌移液管自菌种管中吸取一定量的菌液接 到另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。到另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。思考题 1. 斜面接种取菌前为什么要将灼烧过的接种斜面接种取菌前为什么要将灼烧过的

42、接种针在无菌培养基上沾一下？针在无菌培养基上沾一下？ 2.2.用一根无菌移液管接种几种浓度的水样时，用一根无菌移液管接种几种浓度的水样时，应从哪个浓度开始？为什么？应从哪个浓度开始？为什么？实验目的实验目的染色原理染色原理染色方法染色方法实验材料实验材料实验内容与步骤实验内容与步骤注意事项注意事项实验结果实验结果实验四实验四 革兰氏染色法革兰氏染色法一、实验目的一、实验目的 1. 学习微生物涂片，染色原理和染色的基本操作技术，从而掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。 2. 巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。二、染色原理二、染色原理 由于微生物细胞含有大量水分，对光线的吸收和反射与水

43、溶液的差别不大,机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差,在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。 微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。 经测定，细菌等电点pH在2-5之间，故在中性、碱性或偏酸性溶液中，细菌的等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的较多。微生物体内各结构

44、与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。 三、染色方法三、染色方法(一一)简单染色法简单染色法 简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态，用简单染色即可。(二二)复染色法复染色法 用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革革兰氏染色法和抗酸性染色法。兰氏染色法和抗酸性染色法。 革兰氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌革兰氏阴性细菌，用G

45、-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构细胞壁的成分和结构不同而造成的。四、实验材料四、实验材料1. 显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯等。2. 石炭酸复红染液、草酸铵结晶紫染液、碘液、95乙醇、番红（沙黄）染液3. 菌种：表皮球菌、变形杆菌五、实验内容与步骤五、实验内容与步骤(一一)细菌的简单染色步骤细菌的简单染色步骤 涂片干燥固定染色水洗干燥镜检1涂片涂片 取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种(表皮球菌或变形杆菌)与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布

46、面不宜过大涂布面不宜过大。2干燥 涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。过长，以防标本烤枯而变形。 3 3固定固定 固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过23次，共约23秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超不觉过烫为宜（不超过过60）,放置待冷后，放置待冷后，进行染色。4 4染色染色 在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种)一滴，使染色液覆盖涂片，

47、染色约1min。5 5水洗水洗 斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。洗下的水呈无色为止。6 6干燥干燥 用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，置于室温下自然干燥。用吸水纸时切勿将菌体擦掉。切勿将菌体擦掉。 7镜检 用显微镜观察，并用铅笔绘出细菌形态图。(二二)细菌的革兰氏染色步骤细菌的革兰氏染色步骤 涂片干燥固定初染水洗媒染水洗脱色水洗复染水洗干燥观察1取表皮球菌和变形杆菌(均以无菌操作)分别在同一张载玻片上做涂片、干燥、固定涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同。2用草酸铵结晶紫草酸铵结晶紫染色1min后水洗。3加碘液碘液媒染1min后水洗。4斜置载玻片，滴加95乙醇乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色 为止，大约需时2030s，随即水洗，随即水洗。5用沙黄沙黄染液复染1min，水洗。6用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明革兰氏染色的结果革兰氏染色的结果。六、注意事项六、注意事项1革兰氏染色成败的关键是脱色