李淑娟-六聚组氨酸融合蛋白纯化方法研究(西北大学硕士学位答辩PPT)2007.6

1、1 答辩人：李淑娟答辩人：李淑娟 专业：生物化学与分子生物学专业：生物化学与分子生物学 导师：崔亚丽导师：崔亚丽 教授教授答辩时间：答辩时间：2007.05.302007.05.30六聚组氨酸融合蛋白六聚组氨酸融合蛋白 纯化方法研究纯化方法研究西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩2答辩内容答辩内容v融合标签技术简介融合标签技术简介v金属螯合亲和层析介质用于六聚组氨酸融金属螯合亲和层析介质用于六聚组氨酸融 合蛋白纯化的研究合蛋白纯化的研究v抗六聚组氨酸多克隆抗体的制备及以磁性抗六聚组氨酸多克隆抗体的制备及以磁性微粒为载体六聚组氨酸融合蛋白的纯化微粒为载体六聚组氨酸融合蛋白的纯化西

2、北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩3西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第一部分第一部分融合标签技术简介融合标签技术简介融合标签技术融合标签技术：利用重组DNA技术在靶蛋白编码基因的3端或5端融合某种标签的编码基因，通过适宜的宿主来表达重组蛋白质，表达的重组蛋白质可以通过融合的标签与包被在固相基质上的特异配基结合而进行纯化。融合标签的种类融合标签的种类 v 大的蛋白质分子：GST、SPA、GFP 等。v 小的多肽片段：6His、HA、c-myc等。4融合标签技术的应用融合标签技术的应用v 用于蛋白质纯化 v 用于蛋白质固定v 用于蛋白质检测 第一部分第一部分西北

3、大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩常用的蛋白纯化标签常用的蛋白纯化标签v 六聚组氨酸(6His)v 谷胱甘肽巯基巯基转移酶(GST) v 表位标签(如HA，c-myc)利用融合标签和固相配体的相互作用5六聚组氨酸标签的优势六聚组氨酸标签的优势v 6His较小，所以基本上不影响蛋白的结构和功能。v 对金属离子如镍、钴有高度的选择性和亲和力。v 与金属离子的结合不受变性剂（尿素、胍）的影响。v 带有6His标签的融合蛋白与金属离子结合后具有温和多样的洗脱条件。六聚组氨酸融合蛋白纯化方法六聚组氨酸融合蛋白纯化方法v 金属螯合亲和层析法v 免疫亲和法第一部分第一部分西北大学硕士研究生论文

4、答辩西北大学硕士研究生论文答辩6西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第二部分第二部分 v 金属螯合亲和层析法介绍v 金属螯合亲和层析介质Co-CM-Asp-Sepharose 制备v 六聚组氨酸融合蛋白的诱导表达及细胞裂解液的制备 v 六聚组氨酸融合蛋白纯化条件的优化v Co-CM-Asp-Sepharose用于六聚组氨酸融合蛋白的大量纯化 v Co-CM-Asp-Sepharose与Ni-NTA-Agarose的比较 金属螯合亲和层析介质用于六聚组金属螯合亲和层析介质用于六聚组氨酸融合蛋白纯化的研究氨酸融合蛋白纯化的研究7西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第

5、二部分第二部分 金属螯合亲和层析法介绍金属螯合亲和层析法介绍固定化金属螯合亲和层析固定化金属螯合亲和层析(IMAC)原理：原理：利用蛋白质表面氨基酸与固定化金属离子亲合力不同对蛋白质进行分离。金属螯合亲和介质与蛋白质的作用 8西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第二部分第二部分 金属螯合亲和层析介质组成金属螯合亲和层析介质组成v 载体：软基质(琼脂糖、葡聚糖) 、硬基质(硅胶、多孔玻 璃) 、膜材料(纤维素、尼龙、聚乙烯、聚砜)及磁性材料。v 螯合配基：次氨基三乙酸(NTA)、亚氨基二乙酸(IDA)、三 羧甲基乙二胺(TED)及羧甲基天冬氨酸(CM-APS)。v 金属离子：Cu

6、2+、 Ni2+、 Zn2+及Co2+，其中Cu2+对蛋白质结 合力最强，Ni2+次之，Co2+和Zn2+结合相对较弱。9西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第二部分第二部分 研究现状研究现状v Ni-NTA-resin(Qiagen) 、Ni-IDA-resin(Novagen)、Ni-TED-resin(Active motif)已被广泛用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化，但在纯化时会出现金属离子脱落、选择性低、蛋白结合能力弱等缺点。v 为提高纯化效果，国外研究者提出以CM-APS来制备IMAC介质，得到的介质对蛋白结合能力强、选择性高、金属离子不易脱落。v 目前，国内多用IDA

7、、NTA等合成IMAC介质，而用CM-APS作为螯合配基制备IMAC介质的研究未见报道。v 文献报道含镍螯合介质可与不含6His残基的蛋白结合，因而会表现出一定非特异性吸附。10西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第二部分第二部分 研究目的及意义研究目的及意义研究目的：研究目的：以CM-APS为螯合配基，Co2+为金属离子制备固定化金属螯合亲和层析介质Co-CM-Asp-Sepharose ，并将其用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化研究。研究意义研究意义：国内多用IDA、NTA等合成IMAC介质，而用CM-APS作为螯合配基制备IMAC介质的研究未见报道，本实验制备的固定化金属螯合亲

8、和层析介质Co-CM-Asp-Sepharose，得到的介质对蛋白结合能力强、选择性高、金属离子不易脱落，填补了国内此方面的空白。11西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第二部分第二部分 金属螯合亲和层析介质的制备金属螯合亲和层析介质的制备OHOCH2H2NCHCH2COOHOCH2CHOHCH2HNCHCOOHCH2COOHBrCH2COOHOCH2CHOHCH2NCOOHCH2COOHCH2COOHCOOHOClCo2+Co-CM-Asp-SepharoseO载体：Sepharose CL-6B 活化剂：环氧氯丙烷螯合配基： 羧甲基化天冬氨酸 金属离子：Co2+ 12西北大

9、学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第二部分第二部分 六聚组氨酸融合蛋白的诱导表六聚组氨酸融合蛋白的诱导表达及细胞裂解液的制备达及细胞裂解液的制备 六聚组氨酸融合蛋白六聚组氨酸融合蛋白CD155D1和和gp41的表达的表达v 挑取一个重组菌的单菌落，接入10 mL含Cam+, AMP+的LB培养液中，30过夜培养。v 取5 mL种子液转接到200 mL LB培养液中扩大培养，35，180 rpm，23 h，至OD为0.40.6，加入IPTG至终浓度100 g/mL，30，150 rpm，1.5 h，离心收获菌体。 细胞裂解液的制备细胞裂解液的制备v 细胞裂解液: 100 mmol/L

10、 NaH2PO4, 10 mmol/L Tris, 8 mol/LUrea, pH 8.0)13西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第二部分第二部分 v 介质用量介质用量v 孵育时间孵育时间v 清洗条件清洗条件v 洗脱液咪唑浓度洗脱液咪唑浓度六聚组氨酸融合蛋白纯化条件的优化六聚组氨酸融合蛋白纯化条件的优化14西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第二部分第二部分 介质用量介质用量00.10.20.3020406080100120140 Volume/LA280nm结论结论：纯化200 L细胞裂解液中的CD155D1蛋白需60 L 50%的Co- CM-Asp-Se

11、pharose悬浮液。v不同介质用量纯化后剩余溶液及洗脱不同介质用量纯化后剩余溶液及洗脱液中蛋白的液中蛋白的SDS-PAGE分析分析 v不同介质用量与洗脱液中融合蛋白在不同介质用量与洗脱液中融合蛋白在280 nm处吸光度值的关系处吸光度值的关系 1：标准蛋白；2：细胞裂解液；3-8：介质用量分别为20, 40, 60, 80, 100, 120 L 时纯化后的上清；9-14：介质用量分别为20, 40, 60, 80, 100, 120 L 时的洗脱液15西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第二部分第二部分 孵育时间孵育时间结论结论： 30 min内足以结合完细胞裂解液中的靶蛋

12、白，实验中优选的介质与细胞裂解液孵育时间为30 min。00.10.20.30.4010203040506070Time/minA280nmv 不同孵育时间下剩余溶液及洗脱液中不同孵育时间下剩余溶液及洗脱液中蛋白的蛋白的SDS-PAGE分析分析 v不同孵育时间与洗脱液中融合蛋白在不同孵育时间与洗脱液中融合蛋白在280 nm处吸光度值的关系处吸光度值的关系 1：细胞裂解液；2-7：孵育时间分别为10, 20, 30, 40, 50, 60 min 时纯化后的上清； 8：标准蛋白； 9-14：孵育时间分别为10, 20, 30, 40, 50, 60 min时的洗脱液16西北大学硕士研究生论文答辩

13、西北大学硕士研究生论文答辩第二部分第二部分 清洗条件清洗条件结论结论：该介质在纯化时无需pH梯度清洗，用A液即可。A液：100 mmol/L NaH2PO4, 10 mmol/L Tris, 8 mol/LUrea, pH 8.0B液：100 mmol/L NaH2PO4, 10 mmol/L Tris, 8 mol/L Urea, pH 6.3C液：100 mmol/L NaH2PO4, 10 mmol/L Tris, 8 mol/L Urea, pH 5.9 v不同条件清洗介质后剩余溶液及不同条件清洗介质后剩余溶液及 洗脱液中蛋白的洗脱液中蛋白的SDS-PAGE 1：标准蛋白；2：细胞裂解

14、液；3：纯化后的上清；4-5：用A液、B液、C液清洗后的洗脱液；6-7：用A液清洗后的洗脱液17西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第二部分第二部分 洗脱液咪唑浓度洗脱液咪唑浓度结论结论：选用C液(pH 5.9 ) 和200 mmol/L的咪唑作为系统优选的洗脱剂。 00.10.20.30.4050100150200250300Concentration/mMA280nmv 不同咪唑浓度与洗脱液中融合蛋白不同咪唑浓度与洗脱液中融合蛋白 在在280 nm处吸光度值的关系处吸光度值的关系 18西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第二部分第二部分 优化的条件优化的条件

15、介质用量：60 L Co-CM-Asp-Sepharose （50%悬浮液）孵育时间：30 min清洗液：A液洗脱液： C液(pH 5.9 ) 和200 mmol/L的咪唑200 L细胞裂解液（含CD155D1，39 KD）纯化体系19西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第二部分第二部分 Co-CM-Asp-SepharoseCo-CM-Asp-Sepharose用于六聚组用于六聚组氨酸融合蛋白的大量纯化氨酸融合蛋白的大量纯化 介质体积： 1.5 mL 50%细胞裂解液体积：5 mL 结论结论：Bradford法测定蛋白浓度并计算可知1.5 mL 50%的 Co-CM-Asp-

16、Sepharose悬浮液纯化得到4.6 mg六聚组酸融合蛋白CD155D1(39 KD)，即1 mL净介质可纯化分子量为39 KD的蛋白6.13 mg。20西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第二部分第二部分 与与Ni-NTA-Agarose的比较的比较 结论结论: Co-CM-Asp-Sepharose对融合蛋白选择性高，非特异性吸附降 低，因而表现出较好的纯化效果。 v SDS-PAGE对对Co-CM-Asp-Sepharose和和 Ni-NTA-Agarose纯化融合蛋白的结果比较纯化融合蛋白的结果比较 1：标准蛋白；8：细胞裂解液；7：用Co-CM-Asp-Sephar

17、ose纯化后的上清；5-6：用Co-CM-Asp-Sepharose纯化后的洗脱液；4：用 Ni-NTA-Agarose纯化后的上清；2-3：用 Ni-NTA-Agarose纯化后的洗脱液蛋白选择： gp4121西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第二部分第二部分 小结小结v 以以Sepharose CL-6B 载体，羧甲基化天冬氨酸为螯合配基，载体，羧甲基化天冬氨酸为螯合配基， Co2+为金属离子，为金属离子，环氧氯丙烷为活化剂制备了金属螯合亲和层析介质环氧氯丙烷为活化剂制备了金属螯合亲和层析介质Co-CM-Asp-Sepharose。v 对纯化对纯化200 L细胞裂解液中靶

18、蛋白所需细胞裂解液中靶蛋白所需Co-CM-Asp-Sepharose介质用量，介质用量，Co-CM-Asp-Sepharose与细胞裂解液的孵育时间，介质清洗条件及靶蛋白洗脱时与细胞裂解液的孵育时间，介质清洗条件及靶蛋白洗脱时所需咪唑浓度等进行了优化所需咪唑浓度等进行了优化 。结果表明：对。结果表明：对200 L细胞裂解液纯化体系，细胞裂解液纯化体系， Co-CM-Asp-Sepharose（50%悬浮液）的优选体积为悬浮液）的优选体积为60 L，最佳孵育时间为最佳孵育时间为30 min，洗脱液最佳咪唑浓度为洗脱液最佳咪唑浓度为200 mmol/L ，清洗缓冲液选用清洗缓冲液选用A液。液。v

19、开展了从开展了从5 mL细胞裂解液中放大规模纯化融合蛋白的研究，并通过细胞裂解液中放大规模纯化融合蛋白的研究，并通过Bradford法测定蛋白浓度并计算可知法测定蛋白浓度并计算可知1.5 mL 50%的的 Co-CM-Asp-Sepharose悬浮液纯化悬浮液纯化得到得到4.6 mg六聚组酸融合蛋白六聚组酸融合蛋白CD155D1(39 KD)，即即1 mL净介质可纯化分子量净介质可纯化分子量为为39 KD的蛋白的蛋白6.13 mg。v 比较了比较了Co-CM-Asp-Sepharose与与Ni-NTA-Agarose (Qiagen公司公司)两种螯合介质两种螯合介质对融合蛋白的纯化效果对融合蛋

20、白的纯化效果 ，发现，发现Co-CM-Asp-Sepharose介质具有选择性好，清介质具有选择性好，清洗条件简单，得到的靶蛋白纯度高等优点。洗条件简单，得到的靶蛋白纯度高等优点。22西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第三部分第三部分 抗六聚组氨酸多克隆抗体的制备及以磁性微抗六聚组氨酸多克隆抗体的制备及以磁性微粒为载体六聚组氨酸融合蛋白的纯化粒为载体六聚组氨酸融合蛋白的纯化v免疫亲和纯化法介绍v抗原合成v抗体的制备和纯化v抗体纯化后效价测定v抗6His多克隆抗体用于纯化6His融合蛋白的初步研究 v金磁微粒介导的多克隆抗体中抗KLH（血蓝蛋白）抗体的去除 23西北大学硕士研究

21、生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第三部分第三部分 免疫亲和纯化法免疫亲和纯化法免疫亲和纯化技术原理：免疫亲和纯化技术原理：利用抗原抗体特异性可逆结合的特性，根据抗原抗体的高选择性，从复杂样品中提取目标化合物。 免疫亲和纯化技术应用免疫亲和纯化技术应用v 利用固定化抗体纯化抗原 1.采用活化微珠固定抗体 2.蛋白A或G微珠固定抗体v 利用固定化抗原纯化抗体 1.利用固定化抗原纯化所需抗体 2.利用固定化抗原去除不需要的抗体 24西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第三部分第三部分 影响免疫亲合纯化的关键因素影响免疫亲合纯化的关键因素v 载体选择：理想的载体应该易活化、机械强度

22、好，化学稳定性 好、非特异性吸附低、价格低。 v 抗体选择：理想的抗体是对抗原有高亲和力，与抗原结合后可 被简单且温和的方法解离。v 抗原的浓度：因为使用亲和介质也有某些内在的背景限制，如 果所纯化的蛋白质抗原非常少，免疫亲和纯化必须与其他方法 相结合，才能获得均质性产物。 25西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第三部分第三部分 研究现状研究现状v 标签融合蛋白可通过抗标签的单克隆抗体和多克隆抗体来纯化。v 多数免疫亲和纯化都使用单克隆抗体，目前已有商品化的特异性针 对标签的单克隆抗体，但价格都比较昂贵。v 两种类型的多克隆抗体可用于免疫亲和纯化，即针对合成肽(如6His、F

23、LAG标签等)或某种抗原的特定区域产生的抗体。在这两种情况下，由于结合到固定化抗体上的抗原位点局限在一个很小的区域，因此可实现有效的洗脱。v 由于磁性微粒超强的富集和快速的分离能力、较大的比表面积及表面结合抗体抗原的相互识别，可用于免疫检测，免疫亲和纯化等。研究目的研究目的制备抗6His的多克隆抗体，以磁性微粒为载体，初步开展6His融合蛋白的纯化研究。26西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第三部分第三部分 抗原合成抗原合成EDC法法OOHC NNNONHC NNHNOONH2C NNHNOO半抗原：6His 载体：KLH、BSA免疫原： 6His-KLH， 包被抗原： 6H

24、is-BSA27西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第三部分第三部分 抗体的制备和纯化抗体的制备和纯化饱和硫酸铵沉淀免疫兔子抽血测效价28西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第三部分第三部分 抗体纯化后效价测定抗体纯化后效价测定包被抗原 BSA-6His KLH抗体稀释度空白 阴性阳性空白 阴性阳性1:1000 0.0260.0501.97 0.0230.1291.921:50000.0381.470.0621.751:100000.0281.080.0301.561:200000.0230.620.0201.56结论结论：纯化后抗6His多克隆抗体的效价大于2

25、0000。29西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第三部分第三部分 抗抗6His多克隆抗体用于多克隆抗体用于6His融合蛋白纯化的初步研究融合蛋白纯化的初步研究载体：氨基磁粒固定化抗体量：2.8 mg、5.6 mg、8.4 mg细胞裂解液体积：4000 L清洗液： 1PBST洗脱液：200 L甘氨酸盐酸(pH 2.8)结论结论：制备的抗6His多克隆抗体可用于纯化6His融合蛋白 ，但还需进一步摸索。v 抗抗 6His抗体纯化后的抗体纯化后的SDS-PAGE电泳鉴定结果电泳鉴定结果 1：标准蛋白；2：细胞裂解液；3-5：洗脱液30西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文

26、答辩第三部分第三部分 金磁微粒介导的多克隆抗体中抗金磁微粒介导的多克隆抗体中抗KLH抗体的去除抗体的去除 金磁微粒金磁微粒- -KLH和多克隆抗体最佳结合比例的确定和多克隆抗体最佳结合比例的确定 00.511.522.51/10001/5000 1/10000 1/20000多克隆抗体的稀释度OD450值123451. 去除前2-5. 去除后2. 50:163. 50:114. 50:65. 50:3结论结论：金磁微粒-KLH与多克隆抗体的质量比例大于50:3时 可稳定地完全地去除多克隆抗体中抗KLH抗体。 v KLH-金磁微粒去除多克隆抗体中抗金磁微粒去除多克隆抗体中抗KLH抗体抗体后抗后抗

27、KLH抗体效价测定抗体效价测定 31西北大学硕士研究生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩第三部分第三部分 金磁微粒去除抗金磁微粒去除抗KLH抗体效果的检测抗体效果的检测结论结论：去除后，KLH抗体效价明显下降，而6His抗体效价则无大的变化，表明金磁微粒对抗KLH抗体的 去除非常有效。00.511.522.51/10001/50001/100001/20000多克隆抗体稀释度OD450值123 41.去除前抗6His抗体 2.去除后抗6His抗体3.去除前抗KLH抗体 4.去除后抗KLH抗体v 去除前后抗去除前后抗6His抗体和抗抗体和抗KLH抗体的抗体的效价比较效价比较 32西北大学硕士研究

28、生论文答辩西北大学硕士研究生论文答辩 小结小结v 以以6His为半抗原，为半抗原，KLH为载体蛋白，碳二亚胺为载体蛋白，碳二亚胺(EDC)为偶联为偶联剂合成了完全抗原剂合成了完全抗原6His-KLH 。v 以以6His-KLH免疫动物得到抗免疫动物得到抗6His的抗体，结果表明的抗体，结果表明制备的制备的抗抗6His抗体可用于纯化六聚组氨酸融合蛋白，但还需进一步抗体可用于纯化六聚组氨酸融合蛋白，但还需进一步摸索和完善。摸索和完善。v 通过饱和硫酸铵沉淀抗血清后，测效价大于通过饱和硫酸铵沉淀抗血清后，测效价大于20000。 v 以金磁微粒为载体固定以金磁微粒为载体固定KLH，尝试通过免疫亲和法去除多克隆尝试通过免疫亲和法去除多克隆抗体中抗载体蛋白抗体中抗载体蛋白KLH的抗体，得到了纯度较高的针对的抗体，得到了纯度较高的针对6His的