吸光光度法15

1、上一页上一页下一页下一页主目录主目录1四川农业大学四川农业大学1第十五章第十五章 吸光光度法吸光光度法上一页上一页下一页下一页主目录主目录2四川农业大学四川农业大学15.1概述概述 利用溶液颜色的深浅来测定溶液中有色利用溶液颜色的深浅来测定溶液中有色物质的浓度，这种测定方法称为比色法。物质的浓度，这种测定方法称为比色法。 用仪器测定溶液对特定波长光吸收程度用仪器测定溶液对特定波长光吸收程度, ,以此确定溶液浓度的方法称为吸光光度法。以此确定溶液浓度的方法称为吸光光度法。吸光光度法吸光光度法紫外吸光光度法紫外吸光光度法红外吸光光度法红外吸光光度法可见吸光光度法可见吸光光度法上一页上一页下一页下一

2、页主目录主目录3四川农业大学四川农业大学化学分析化学分析：常量组分：常量组分(1%), Er 0.1%0.2% 依据化学反应依据化学反应, 使用玻璃仪器使用玻璃仪器 化学分析与仪器分析方法比较化学分析与仪器分析方法比较仪器分析仪器分析：微量组分：微量组分(1%), Er 1%5% 依据物理或物理化学性质依据物理或物理化学性质, 需要特殊的仪器需要特殊的仪器例例: 含含Fe约约0.05%的样品的样品, 称称0.2g, 则则m(Fe)0.1mg重量法重量法 m(Fe2O3)0.14mg, 称不准称不准容量法容量法 V(K2Cr2O7)0.02mL, 测不准测不准光度法光度法 结果结果0.048%0

3、.052%, 满足要求满足要求准确度高准确度高灵敏度高灵敏度高上一页上一页下一页下一页主目录主目录4四川农业大学四川农业大学2. 准确度较高，相对误差为准确度较高，相对误差为2% 5%。3. 快速快速简便简便。4. 应用广泛应用广泛。一、光的基本性质一、光的基本性质 光具有波粒二象性，即波动性光具有波粒二象性，即波动性，粒子性粒子性.吸光光度法的特点：吸光光度法的特点：1. 灵敏度高，下限为灵敏度高，下限为10-5 10-6 molL-1。适。适 用于微量分析。用于微量分析。上一页上一页下一页下一页主目录主目录5四川农业大学四川农业大学三者间关系为：三者间关系为： c /粒子性：光是由光子组成

4、的，光子的能量粒子性：光是由光子组成的，光子的能量 （E）决定于光的频率或波长：）决定于光的频率或波长： chhE 描述其波动性的主要参数是：描述其波动性的主要参数是： 波长波长，频率，频率 ，光速光速 c上一页上一页下一页下一页主目录主目录6四川农业大学四川农业大学根据波长的不同，可分为：根据波长的不同，可分为： 紫外光区：紫外光区：10nm 400nm 可见光区：可见光区：400nm 750nm 红外光区：红外光区：750nm 1000m1m106m109nm 同一波长的光称为同一波长的光称为单色光单色光, ,不同波长组不同波长组成的光称为成的光称为复合光。复合光。上一页上一页下一页下一页

5、主目录主目录7四川农业大学四川农业大学 白光（如日光）是复合光，由白光（如日光）是复合光，由400nm 750nm 混合而成。混合而成。1. 光的互补光的互补二、物质对光的选择性吸收二、物质对光的选择性吸收 两种颜色的光按适当比例混合，也可形两种颜色的光按适当比例混合，也可形成白光，这两种颜色称为成白光，这两种颜色称为互补色互补色。上一页上一页下一页下一页主目录主目录8四川农业大学四川农业大学白光白光绿蓝绿蓝蓝绿蓝绿黄绿黄绿黄黄橙橙红红紫紫蓝蓝对角线为互补色光对角线为互补色光 上一页上一页下一页下一页主目录主目录9四川农业大学四川农业大学2. 物质对光选择性吸收物质对光选择性吸收 当白光通过溶

6、液时，溶液吸收某些波当白光通过溶液时，溶液吸收某些波长的光，其余波长的光则透过。溶液呈现长的光，其余波长的光则透过。溶液呈现的颜色正是透过这部分的光。的颜色正是透过这部分的光。例例：KMnO4吸收吸收黄绿黄绿色光，因此色光，因此KMnO4溶溶 液呈现液呈现紫紫色。色。CuSO4吸收吸收黄黄色光而其溶液呈色光而其溶液呈蓝蓝色。色。各种物质对不同波长的光吸收程度不同各种物质对不同波长的光吸收程度不同.上一页上一页下一页下一页主目录主目录10四川农业大学四川农业大学三、吸收曲线三、吸收曲线 1. 透光率透光率T与吸光度与吸光度A 一束平行单色光照射溶液时，光部分被一束平行单色光照射溶液时，光部分被吸

7、收，部分透过溶液，部分被器皿反射。吸收，部分透过溶液，部分被器皿反射。 若入射光强度为若入射光强度为Io，吸收光的强度为，吸收光的强度为Ia ,透过光强度为透过光强度为It，反射光的强度为，反射光的强度为Ir，它们的，它们的关系是：关系是：Io = Ia + It + Ir上一页上一页下一页下一页主目录主目录11四川农业大学四川农业大学 吸光光度法中，采用同质同型比色皿，吸光光度法中，采用同质同型比色皿，反射相同而抵消反射相同而抵消: : Io = Ia + It 透过光强度透过光强度It与入射光强度与入射光强度Io之比称为之比称为透光度透光度或或透光率透光率。用用T 表示：表示：toITI上

8、一页上一页下一页下一页主目录主目录12四川农业大学四川农业大学吸光度吸光度：toIITAlg1lg 光全部透过：光全部透过：Io= It ，A = 0， T = 100%若全部吸收：若全部吸收：It = 0 ， A = ， T = 0 2. 吸收曲线吸收曲线 将不同波长的光透过某一定的溶液，测将不同波长的光透过某一定的溶液，测定不同波长下溶液对光的吸光度。以吸光度定不同波长下溶液对光的吸光度。以吸光度对波长作图可得一曲线，称为吸收曲线。对波长作图可得一曲线，称为吸收曲线。上一页上一页下一页下一页主目录主目录13四川农业大学四川农业大学KMnO4溶液的吸收曲线溶液的吸收曲线400480560 6

9、40720 nm0.40.81.21.6ADCBA A、B、C、D代表代表不同浓度下的吸收曲线。不同浓度下的吸收曲线。 最大最大 = 525 nm动画动画上一页上一页下一页下一页主目录主目录14四川农业大学四川农业大学15.2 溶液对光的吸收定律溶液对光的吸收定律 实验证明：若保持入射光的波长不变实验证明：若保持入射光的波长不变,溶液对光吸收的程度与溶液对光吸收的程度与溶液的浓度溶液的浓度、液层液层厚度厚度有关。有关。一、朗伯一、朗伯-比尔比尔(Lambert-Beer)定律定律 1. 1.朗伯定律朗伯定律：当：当 、c、温度、温度 一定时，一定时，溶液的吸光度与液层的厚度成正比。溶液的吸光度

10、与液层的厚度成正比。(动画动画)上一页上一页下一页下一页主目录主目录15四川农业大学四川农业大学2. 比尔定律比尔定律：当当 、b 和温度一定时，溶液和温度一定时，溶液 的吸光度与溶液的浓度成正比。的吸光度与溶液的浓度成正比。(动画动画) 其数学表达式：其数学表达式：A = K2 c3. 光吸收定律（朗伯光吸收定律（朗伯比尔定律）比尔定律） 其数学表达式其数学表达式： A = Kcb 其数学表达式：其数学表达式： A = K1b K1：比例系数，：比例系数，与与 、c、温度、温度有关。有关。 b：溶液厚度：溶液厚度上一页上一页下一页下一页主目录主目录16四川农业大学四川农业大学 朗伯朗伯比尔定

11、律比尔定律：一束平行一束平行单色光单色光通过通过溶液，当溶液，当波长和温度波长和温度一定时，其吸光度与溶一定时，其吸光度与溶液的浓度和液层厚度成正比。液的浓度和液层厚度成正比。4. 吸光系数与摩尔吸光系数吸光系数与摩尔吸光系数 吸光系数吸光系数(a)：c用用gL-1表示，表示，b用用cm表表示时，示时，K用用a表示，表示， a称为吸光系数，其量称为吸光系数，其量纲为纲为Lg-1cm-1，朗伯，朗伯比尔定律为：比尔定律为：A = a b c上一页上一页下一页下一页主目录主目录17四川农业大学四川农业大学吸光度与光程的关系吸光度与光程的关系 A = bc 光源光源检测器检测器0.00吸光度吸光度检

12、测器检测器b样品样品光源光源0.22吸光度吸光度光源光源检测器检测器0.44吸光度吸光度b样品样品b样品样品上一页上一页下一页下一页主目录主目录18四川农业大学四川农业大学吸光度与浓度的关系吸光度与浓度的关系 A = bc 吸光度吸光度0.00光源光源检测器检测器 吸光度吸光度0.22光源光源检测器检测器b 吸光度吸光度0.42光源光源检测器检测器b上一页上一页下一页下一页主目录主目录19四川农业大学四川农业大学 摩尔吸光系数摩尔吸光系数:c用用molL-1表示，表示，b用用cm表示时，表示时，K用用表示，表示， 称为摩尔吸光系称为摩尔吸光系数，其量纲为数，其量纲为Lmol-1cm-1。则：。

13、则：A =b c当当 c = 1molL-1，b = 1cm 时时, A = 是有色物质在一定波长下的特征常数是有色物质在一定波长下的特征常数,用它衡量物质吸光的灵敏度。用它衡量物质吸光的灵敏度。值越大，吸值越大，吸收能力愈强，显色反应愈灵敏。收能力愈强，显色反应愈灵敏。上一页上一页下一页下一页主目录主目录20四川农业大学四川农业大学最大最大 5104 , 灵敏的显色反应灵敏的显色反应 在吸收曲线上，与最大吸收波长相对应的在吸收曲线上，与最大吸收波长相对应的摩尔吸光系数用摩尔吸光系数用最大最大 表示。表示。例：例：Fe2+浓度为浓度为500 gL-1的溶液，与邻的溶液，与邻二二氮氮菲反应菲反应

14、, 生成橙红色配合物，在波生成橙红色配合物，在波长长510nm,比色皿厚度为比色皿厚度为2cm时测得吸光度为时测得吸光度为0.19，计，计算三算三邻邻二二氮菲氮菲合合铁铁()在此波长在此波长的的 。上一页上一页下一页下一页主目录主目录21四川农业大学四川农业大学解：解： Fe 的原子量为的原子量为55.85 c(Fe2+) = 50010-6 / 55.85 = 8.9510-6 molL-1 根据根据 A =b c)cmmolL(101 . 11095. 8219. 01146 上一页上一页下一页下一页主目录主目录22四川农业大学四川农业大学因为因为cbTA 1lg 在吸光光度法中，在吸光光

15、度法中，b一定时，一定时，c与与A成正成正比，而不与比，而不与T 成正比。成正比。cA上一页上一页下一页下一页主目录主目录23四川农业大学四川农业大学吸光度吸光度A、透光率、透光率T与浓度与浓度c的关系的关系ATc-kbcT = 10A=kbc上一页上一页下一页下一页主目录主目录24四川农业大学四川农业大学二、二、对朗伯对朗伯- -比尔定律的偏离比尔定律的偏离 1. 物理因素物理因素 cA标准工作曲线图标准工作曲线图正误差正误差负误差负误差 单色光不纯，导致负偏差单色光不纯，导致负偏差.上一页上一页下一页下一页主目录主目录25四川农业大学四川农业大学散射光的影响，胶体、乳浊液或悬浊液由散射光的

16、影响，胶体、乳浊液或悬浊液由 于散射的作用使吸光度增大，或入射光不于散射的作用使吸光度增大，或入射光不 是垂直通过比色皿产生正偏差。是垂直通过比色皿产生正偏差。朗伯朗伯-比尔比尔 定律只适用于均匀体系。定律只适用于均匀体系。2. 化学因素：化学因素：吸光质点的相互作用，浓度较大时，产生吸光质点的相互作用，浓度较大时，产生 负偏差，负偏差， 朗伯朗伯-比尔定律只适合于稀溶液比尔定律只适合于稀溶液 (c 上一页上一页下一页下一页主目录主目录43四川农业大学四川农业大学(%)cc 0.20.40.60.81.002468T(2) T = 36.8%(A = 0.434)，相对误差最小相对误差最小。(

17、1) T在在65%20% (A= 0.2 0.7)范围，相对范围，相对 误差较小。误差较小。上一页上一页下一页下一页主目录主目录44四川农业大学四川农业大学2. 控制吸光度在适宜的范围内控制吸光度在适宜的范围内(A= 0.2 0.7). (1) 控制溶液浓度。控制溶液浓度。 (2) 选择不同厚度的比色皿。选择不同厚度的比色皿。15.5 比色分析和吸光度的测量比色分析和吸光度的测量 一、一、单一组分的测定单一组分的测定 1. 目视比色法目视比色法：用眼睛比较溶液颜色深：用眼睛比较溶液颜色深 浅以确定物质含量浅以确定物质含量.上一页上一页下一页下一页主目录主目录45四川农业大学四川农业大学系列标准

18、溶液系列标准溶液待测溶液待测溶液观察方向观察方向方便、灵敏，准确度差。常用于限界分析。方便、灵敏，准确度差。常用于限界分析。上一页上一页下一页下一页主目录主目录46四川农业大学四川农业大学目视比色法的优点：目视比色法的优点：1. 仪器简单，操作简便。仪器简单，操作简便。2. 胶体溶液也可进行测定。胶体溶液也可进行测定。3. 复合光复合光(白光白光)下进行测定，野外也可操作下进行测定，野外也可操作.目视比色法的缺点是：目视比色法的缺点是： 依靠人的眼睛来观察颜色深浅，相对误依靠人的眼睛来观察颜色深浅，相对误差较大，可达差较大，可达520%。 上一页上一页下一页下一页主目录主目录47四川农业大学四

19、川农业大学 2. 吸光光度法吸光光度法 原理：原理：光电池产生光电流的大小与照射光电池产生光电流的大小与照射光的强度成正比。光的强度成正比。 当一束单色光通过一定厚度的溶液时，当一束单色光通过一定厚度的溶液时，溶液浓度越大，吸光度越大，透光度越小，溶液浓度越大，吸光度越大，透光度越小，光电流越小。光电流越小。 通过检测光电流的大小来确定溶液的吸通过检测光电流的大小来确定溶液的吸光度，根据朗伯光度，根据朗伯比尔定律得出其浓度比尔定律得出其浓度.上一页上一页下一页下一页主目录主目录48四川农业大学四川农业大学测量方法：测量方法：(1) 工作曲线法工作曲线法 步骤：步骤： 配制系列标准有色溶液配制系

20、列标准有色溶液 c1、c2 、 c3、c4、 c5 。测其吸光度，因为。测其吸光度，因为A=bc，以，以 A对对c 作图得一直线，称为标准工作曲线作图得一直线，称为标准工作曲线. 相同条件下测未知液的吸光度相同条件下测未知液的吸光度Ax. 在工作曲线图上找到在工作曲线图上找到Ax所对应的浓度所对应的浓度cx.上一页上一页下一页下一页主目录主目录49四川农业大学四川农业大学Axcxc浓度的单位可以是浓度的单位可以是（ mg/mL ）或）或mol/L 0 1 2 3 4 mg/mlA。 。 。 。*0.80.60.40.20上一页上一页下一页下一页主目录主目录50四川农业大学四川农业大学(2) (

21、2) 标准比较法标准比较法 同条件下分别测定未知液与标准溶液的同条件下分别测定未知液与标准溶液的吸光度吸光度 Ax和和 A标标，根据朗伯，根据朗伯-比尔定律，应有比尔定律，应有下式：下式：xxcbA 标标标标cbA 标标标标ccAAxx/ 标标标标cAAcxx 上一页上一页下一页下一页主目录主目录51四川农业大学四川农业大学例例：以：以MnO4- 形式测定合金中的锰。溶解形式测定合金中的锰。溶解0.500g 合金并将锰全部氧化为合金并将锰全部氧化为MnO4- 后，后，将溶液稀释至将溶液稀释至500ml，用，用1cm比色皿在比色皿在525nm处测得该溶液的处测得该溶液的A=0.400; 而浓度为

22、而浓度为1.00 10-4 molL-1KMnO4溶液在相同条件下测溶液在相同条件下测A= 0.585。设。设KMnO4溶液在此范围内服从溶液在此范围内服从光的吸收定律光的吸收定律, 求合金中求合金中Mn的质量分数的质量分数.上一页上一页下一页下一页主目录主目录52四川农业大学四川农业大学解解：根据：根据标标标标cAAcxx )Lmol(1084.61000.1585.0400.0-154 xcsmMVcw1000)%Mn(MnMnOMnO44 上一页上一页下一页下一页主目录主目录53四川农业大学四川农业大学%376. 000376. 0 500. 010009 .545001084. 65

23、二、高含量组分测定二、高含量组分测定示差法示差法 1. 1. 原理原理 参比溶液参比溶液：浓度稍低的标准溶液浓度稍低的标准溶液 cs。上一页上一页下一页下一页主目录主目录54四川农业大学四川农业大学 用用cs 调节调节T%为为100（A = 0.00），若被），若被测溶液的浓度为测溶液的浓度为 cx ，测其，测其Ax。 ssbcA xxbcA A = Ax As = Ax=cb 结论：结论：两溶液的吸光度差两溶液的吸光度差A与浓度差与浓度差 c成正比。成正比。上一页上一页下一页下一页主目录主目录55四川农业大学四川农业大学2. 测定方法测定方法 (1) 工作曲线法工作曲线法 标准溶液标准溶液c

24、s、c1、c2c5。以。以cs作参比，作参比，调调A=0. 测测c1、c2c5的的A，A对对c作图作图. 同条件下测同条件下测Ax，从示差工作曲线中，从示差工作曲线中查出查出cx， cx = cx + cs上一页上一页下一页下一页主目录主目录56四川农业大学四川农业大学AcAxcx示差工作曲线示差工作曲线上一页上一页下一页下一页主目录主目录57四川农业大学四川农业大学(2) 比较法比较法 以以cs作参比，调作参比，调A = 0，测另一标准溶液，测另一标准溶液 c1 的的A1，再测未知液再测未知液 cx 的的Ax 。 11ccAAxx 11AAccxx xsxccc 11cbA xxcbA 上一

25、页上一页下一页下一页主目录主目录58四川农业大学四川农业大学 一、分光光度计的主要部件一、分光光度计的主要部件 1. 光源光源：应有足够的发射强度而且稳定，：应有足够的发射强度而且稳定，常用钨灯或碘钨灯。常用钨灯或碘钨灯。TA1lg T = 100% A = 0 T = 0 A = 15.6 分光光度计分光光度计上一页上一页下一页下一页主目录主目录59四川农业大学四川农业大学 2. 单色器单色器：分光系统，一般由狭缝、透镜、：分光系统，一般由狭缝、透镜、 分光元件组成，常用的分光元件分光元件组成，常用的分光元件 有棱镜或光栅获得单色光。有棱镜或光栅获得单色光。 3. 吸收池吸收池：又称比色皿，厚度有：