分子荧光方法

1、分子荧光分析方法分子荧光分析方法制作人：杨文丽制作人：杨文丽第一节第一节 概述概述n一、分子荧光的定义及发展一、分子荧光的定义及发展n二、分子荧光的特点及应用二、分子荧光的特点及应用n三、分子荧光与紫外三、分子荧光与紫外可见分光光度法的异同可见分光光度法的异同第二节第二节 分子荧光法的基本原理分子荧光法的基本原理n一、荧光的产生一、荧光的产生n二、二、激发光谱和荧光光谱激发光谱和荧光光谱n三、三、荧光与物质的分子结构荧光与物质的分子结构 已经知道，荧光是在一定波长光照射下，某些分子受已经知道，荧光是在一定波长光照射下，某些分子受到激发后发出光量子所致。对一种特定的分子来说：到激发后发出光量子所

2、致。对一种特定的分子来说： 哪些波长光使之激发产生荧光？哪个波长激发后所产哪些波长光使之激发产生荧光？哪个波长激发后所产 生的荧光最强？生的荧光最强？ 激发光谱激发光谱 一定波长的激发光使其产生的荧光哪个波长下最强？一定波长的激发光使其产生的荧光哪个波长下最强？ 荧光光谱荧光光谱 可由实验测定物质分子的激发光谱与荧光光谱来说明。可由实验测定物质分子的激发光谱与荧光光谱来说明。激发光谱与荧光（发射）光谱激发光谱与荧光（发射）光谱n一、荧光的检测一、荧光的检测n光源发出的紫外可见光通过光源发出的紫外可见光通过激发单色器分出不同波长的激发单色器分出不同波长的激发光，照射到样品溶液上，激发光，照射到样

3、品溶液上，激发样品产生荧光。样品发激发样品产生荧光。样品发出的荧光为宽带光谱，需通出的荧光为宽带光谱，需通过发射单色器分光后再进入过发射单色器分光后再进入检测器，检测不同发射波长检测器，检测不同发射波长下的荧光强度下的荧光强度F F。由于激发由于激发光不可能完全被吸收，可透光不可能完全被吸收，可透过溶液，为了防止透射光对过溶液，为了防止透射光对荧光测定的干扰，常在与激荧光测定的干扰，常在与激发光垂直的方向检测荧光发光垂直的方向检测荧光（因荧光是向各个方向发射（因荧光是向各个方向发射的）的）。 吸收池吸收池光源光源检测器检测器单色器单色器信号显信号显示系统示系统单色器单色器荧光激发光谱与荧光（发

4、射）光谱荧光激发光谱与荧光（发射）光谱1. 1.激发光谱激发光谱excitation spectrumexcitation spectrum：将激发荧光的光源用单色器分光，连将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度溶液发射的荧光强度 ( (F F ) ) ，作，作F F 光谱图称激发光谱。光谱图称激发光谱。 从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长exex，选用选用 exex可得到强度最大的荧光。可得到强度最大的荧

5、光。 二、激发光谱和荧光光谱激发光谱和荧光光谱荧光激发光谱与荧光（发射）光谱荧光激发光谱与荧光（发射）光谱2. 2. 荧光光谱荧光光谱fluorescence spectrumfluorescence spectrum：选择选择exex作激发光源，用另作激发光源，用另一单色器将物质发射（发射光谱）一单色器将物质发射（发射光谱） 的荧光分光，记录每一波的荧光分光，记录每一波长下的长下的 F F，作，作 F - F - 光谱图称为荧光光谱。光谱图称为荧光光谱。 荧光光谱中荧光强度最强的波长为荧光光谱中荧光强度最强的波长为 emem 。 exex 与与 emem一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长。

6、一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长。200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱n激发光谱激发光谱: :固定测量波长固定测量波长( (选选最大发射波长最大发射波长), ),化合物发射的化合物发射的荧光荧光( (磷光磷光) )强度与照射光波强度与照射光波长的关系曲线长的关系曲线 （图中曲线（图中曲线I I ）n 激发光谱形状与吸收光激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！二者完全相同！ n发射光谱：发射光谱：固定激发光波长

7、固定激发光波长( (选最大激发波长选最大激发波长), ), 化合物发化合物发射的荧光射的荧光( (或磷光强度或磷光强度) )与发与发射光波长关系曲线射光波长关系曲线( (图中曲线图中曲线II II或或III III) )。荧光激发光谱与发射光谱的特征荧光激发光谱与发射光谱的特征a.Stokes位移位移荧光波长比激发光谱的波长较长荧光波长比激发光谱的波长较长 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为StokesStokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，

8、也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。发射之间产生了能量损失。b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 分子被激发到高于分子被激发到高于S1S1的电子态的更高振动能级，然而由于内转换和的电子态的更高振动能级，然而由于内转换和振动弛豫的速率很快，很快损失多余的能量而衰变到振动弛豫的速率很快，很快损失多余的能量而衰变到S1S1电子态的最低振电子态的最低振动能级动能级 尽管分子受激到达不同能级的激发态，不管激发波长如何，电子都尽管分子受激到达不同能级的激发态，不管

9、激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层，而与是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层，而与荧光体被激发至哪一个电子态无关。荧光体被激发至哪一个电子态无关。无论激发波长是无论激发波长是11还是还是22，荧光的波长都是，荧光的波长都是2 2激发光谱的形状与发射波长也无关激发光谱的形状与发射波长也无关200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IF c. 镜像规则镜像规则 通常荧

10、光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。成镜像对称关系。 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的各振动能级之间的跃迁和反跃迁基态上的零振动能级与第一激发态的各振动能级之间的跃迁和反跃迁几率相等几率相等200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱 荧光光谱与激发光谱形状极为相似，且二者成镜像对称荧光光谱与激发光谱形状极为相

11、似，且二者成镜像对称激光光谱与荧光光谱的应用n1 1、定性分析、定性分析n将荧光物质的激发光谱和荧光光谱图的形状、将荧光物质的激发光谱和荧光光谱图的形状、位置与标准溶液的光谱图进行比较。跟紫外可位置与标准溶液的光谱图进行比较。跟紫外可见吸收光谱法相比，因参照图更多，可靠性更见吸收光谱法相比，因参照图更多，可靠性更好。好。n2 2、定量分析、定量分析n根据荧光光谱中最大激发波长根据荧光光谱中最大激发波长exex和最大荧光和最大荧光波长波长emem，可得到定量分析的最佳条件。，可得到定量分析的最佳条件。荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系分子荧光产生的必备条件分子荧光产生的必备条件分子必须能够

12、吸收激发光分子必须能够吸收激发光分子必须具有一定的荧光量子产率分子必须具有一定的荧光量子产率)()(affII吸收的光强度荧光强度吸收的光量子数发射的光量子数ifffkkk影响因素：荧光产生过程中，影响因素：荧光产生过程中， 辐射和无辐射过程；辐射和无辐射过程； 与每一过程的速率常数有关；与每一过程的速率常数有关； k kf f 分子结构决定（内因）；分子结构决定（内因）； 主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。 n 振动弛豫振动弛豫激发激发 n荧光荧光（1 1）跃迁类型：）跃迁类型：具有具有 电子跃迁类型的结构电子跃迁类型的结构 跃迁是产生荧

13、光的主要跃迁类型跃迁是产生荧光的主要跃迁类型特点：较大的摩尔吸光系数较短的激发态寿命10-710-9s串越至三重态几率小（2）具有大的共轭键结构共轭度越大，荧光越强。共轭度越大，荧光越强。原因原因 ：化合物化合物exmax(nm)205286365390580emmax (nm)278321400480640 F0.110.290.460.600.52（3）具在刚性平面结构 0.9210.18化合物化合物苯苯苯酚苯酚苯胺苯胺苯基氰苯基氰苯甲醚苯甲醚 emmax (nm)278310285365310405280390285345相对荧光强度相对荧光强度1018202020ONO2NCH3H3C

14、-O3SNCH3H3CSO3-CCHHCCHHNCH3H3C-O3SNCH3H3CSO3-CCHHNCH3H3C-O3SCCHHNCH3H3CSO3-CCHHNCH3H3C-O3S思考题：思考题：一、什么是分子发光？分子发光有哪几类？一、什么是分子发光？分子发光有哪几类？二、分子荧光或磷光是如何产生的？二、分子荧光或磷光是如何产生的？三、什么是荧光激发光谱？什么是荧光发射光谱？各有何特点和作三、什么是荧光激发光谱？什么是荧光发射光谱？各有何特点和作用？用？四、为什么荧光发射光谱与激发光波长无关？四、为什么荧光发射光谱与激发光波长无关？五、何谓五、何谓StokesStokes位移？位移？StokesStokes位移是如何产生的？位移是如何产生的？六、分子产生荧光的必备条件是什么？六、分子