临床免疫学自身抗体检测及应用

1、第二十章自身抗体检测及应用本章考点1.概念2.自身抗体的特性、概念3.常见自身抗体的检测4.自身抗体检测的临床应用自身免疫：当机体免疫系统受某种因素作用使自身免疫耐受削弱或破坏时，免疫系统会对自身成分包括：正常或变性的组织、器官、细胞、蛋白质或酶类等自身抗原产生免疫应答反应，出现自身抗体或致敏淋巴细胞的这种现象称为自身免疫。自身免疫性疾病：当某种原因使自身免疫应答过分强烈时，也会导致相应的自身组织、器官损伤或功能障碍，这种病理状态称为自身免疫性疾病。自身抗体；血循环中针对自身组织、器官、细胞及细胞内成分的抗体称为自身抗体。正常人血清中可有多种微量的自身抗体或致敏淋巴细胞，它能清除体内衰老细胞而

2、起到免疫稳定的效应。第一节自身抗体的特性自身抗体是自身免疫性疾病的重要标志。每种自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗体谱。患者血液中存在高效价自身抗体是自身免疫性疾病的特点之一，也是临床确诊自身免疫性疾病的重要依据。产生自身抗体的抗原包括以下几种：化学修饰的组织抗原；与自身组织成分存在交叉反应的外来抗原；隐蔽抗原；自身细胞HLA-DR抗原的表达以及低分化的组织抗原等，在一定条件下，均可刺激机体产生自身抗体。自身抗体与疾病的关系：某些自身抗体对某种疾病的诊断具有高度特异性，已经成为该病的血清标记性抗体或特异性抗体；某些自身抗体与疾病的活动性有相关性；少数自身抗体参与了免疫病理性损伤。测定自身抗体的

3、意义：自身免疫性疾病的诊断；疾病活动性的判断；疗效的观察；指导临床用药等。第二节常见自身抗体的检测自身抗体种类很多，这里只是简单介绍几种常见的自身抗体的检测。一、类风湿因子（一）概念类风湿因子（rheumatoid factor，RF）是一种抗人或动物IgG分子Fc片段抗原决定簇的抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体。可与人或动物的变性IgG结合，而不与正常IgG发生凝集，最多见于类风湿性关节炎患者。Rose等1984年在RA（rheumatoid arthritis）患者血清中发现RF。RF有IgM、IgG、IgA和IgE型，IgM型为主要类型。（二）检测方法1.胶乳凝集试验：以IgG吸附

4、于聚苯乙烯胶乳颗粒上，如血清中含有RF，可与乳胶颗粒出现凝集反应。该法只能定性或半定量，灵敏度及特异性不高，只能检测IgM型RF。2.速率散射比浊法：定量检测、准确、快速，准确性和敏感性高于胶乳凝集实验。也只能检测IgM型RF。3.ELISA法：可检出不同Ig类型的RF，在酶标记抗体时，分别标记IgG、IgA或IgM。（三）临床应用RF主要见于类风湿，在类风湿性关节炎患者中的检出率很高，RF阳性支持早期RA的倾向性诊断，对年轻女性应进行RA和风湿热的鉴别；而对非活动期RA的诊断，需参考病史。但RF也像ANA一样，并不是RA独有的特异性抗体。在SLE患者约有50%RF阳性，在其他结缔组织病如SS

5、、硬皮病、慢性活动性肝炎以及老年人中均可有不同程度的阳性率。部分正常人也可出现。但RF滴度或含量一般较低（80IUml伴严重关节功能障碍者，提示预后不良。IgG型RF：与患者滑膜炎、血管炎和关节的症状密切相关。正常人以及非RA患者中很难检出。IgA型RF：10%RA可检出，为RA临床活动的指标，与骨质破坏以及关节炎症状的严重程度显著相关。IgE型RF：在关节液、胸水中高于血清水平。二、抗核抗体抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）是以自身真核细胞成分作为靶抗原的一组自身抗体的总称，泛指各种核成分的抗体，是一种广泛存在的自身抗体。迄今已发现20余种。性质主要是IgG，也有I

6、gM、IgA、IgD和IgE，可与不同来源的细胞核起反应，无器官特异性和种属特异性。ANA主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液以及尿液等体液中。ANA可见于多种疾病，主要存在于自身免疫性疾病患者血清中，如SLE、SS、MCTD、类风湿性关节炎等。也可见于慢性肝病、病毒感染以及正常老年人、妊娠妇女等。ANA阴性不能排除自身免疫性疾病的诊断；阳性也不一定是自身免疫性疾病。由于细胞核成分的复杂性，不同成分的抗原性也不同；因此就会有多种不同类型的ANA。ANA在不同的疾病中呈现不同的组合，不同的疾病有自己的抗核抗体谱。有些ANA只是针对某一特定成分，只在某一疾病中出现，成为该病的血清标志性抗体

7、。ANA是一个重要的筛选试验。分类：按理化特性和抗原分布部位分为四大类。包括抗DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗非组蛋白抗体、抗核仁抗体。命名：1.根据抗原化学名称命名：例如抗dsDNA、抗RNP。2.以第一位检出患者命名：例如抗Sm、抗Ro、抗La抗体。3.以相关疾病命名：例如抗SSA、抗SSB抗体。（一）检测方法由于ANA的复杂性及多样性，故测定方法繁多。目前ANA常用的方法有免疫荧光法、放射免疫法、ELISA、免疫双扩散、对流免疫电泳及免疫印迹技术等。常用间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence，IIF）作为总的ANA筛选试验。鼠肝常用于检测抗核抗体，但近十年来多

8、被HEp-2细胞所代替，这是因为HEp-2细胞具有以下特点：人源性；细胞核大；分裂期细胞多；可大批量培养。当然，单个细胞不可能替代组织切片，所以鼠组织切片仍继续用于自身抗体的检测。放射免疫法：常用于检测抗DNA抗体，有Farr法及过滤法。Farr法的原理为用同位素标记DNA，被标记的DNA和被检血清的抗DNA抗体结合，经50%硫酸铵饱和液沉淀，然后比较沉淀物和上清液中的放射活性，从而得出DNA结合活性，一般结合率大于20%为阳性。过滤法是在分离结合物时用纤维素酯薄膜滤器（孔径为0.45m）进行过滤，游离的DNA被滤去而与抗体结合的复合物被阻留在滤膜上。ELISA法：临床上主要是应用间接ELIS

9、A检测抗dsDNA抗体，其重复性及敏感性均较对流免疫电泳及双扩散为高。目前已有试剂盒供应。免疫印迹（immunoblotting）法：先将混合抗原作凝胶电泳，分离开不同的区带，然后将这些带转印到硝酸纤维素膜上，最后用酶标抗体或放射性同位素标记抗体进行检测和分析。由于该试验不需纯化的单个抗原，可在同一固相上作多项分析检测，灵敏度高，特异性强。故目前已广泛用于自身免疫病患者血清中多种自身抗体的检测，如检测抗Sm抗体、抗RNP抗体、抗SS-A抗体及SS-B抗体等。另外，还可用传统的琼脂双向扩散法、对流免疫电泳法、间接血凝法和补体结合试验等。这些试验要求的实验条件比较低，但敏感性也比较低。均质型斑点型

10、核仁型核膜型（二）常见ANA荧光图形及临床意义1.均质型：多是由抗DNP抗体所引起。也可由核小体抗体和抗双链DNA抗体引起。主要见于SLE，药物性狼疮。2.斑点型：是由抗ENA抗体所引起。主要见于SLE、MCTD、PSS、SS等。高滴度的斑点型常见于MCTD。3.周边型（又称核膜型）：主要由抗dsDNA的抗体所引起。主要见于SLE。特别是活动期患者。4.核仁型：主要见于硬皮病。相关抗体是抗核仁特异的低分子量RNA等。5.着丝点型：主要见于局限性硬皮病及CREST综合征。主要的靶抗原是着丝点B抗原。（三）抗双链DNA抗体的检测方法检测抗DNA抗体的方法有多种，如ELISA、IIF、金标法、免疫印

11、记法、放免法等。其中最特异敏感的是应用锥虫或血鞭毛虫（如绿蝇短膜虫）作基质测定抗dsDNA抗体。因为这些血寄生虫的动基体内含大量的纯dsNDA，无其他抗原干扰；在阳性结果时，可见鞭毛一端的动基体显示清晰的荧光。因此该试验用于测定抗dsDNA抗体具有特异性强和敏感性高的优点。另外，短膜虫对人畜无害，可以人工养殖，来源方便，值得推广。抗dsDNA抗体是SLE的特征性标记抗体，是SLE活动期的重要指标。抗体滴度的动态检测对疗效的监测提供了有价值的实验室手段。抗dsDNA抗体对诊断SLE特异性较高；可达95%以上，但敏感性较低，仅为30%50%，因此，抗dsDNA抗体阴性不能排除SLE的诊断。抗dsD

12、NA抗体在SLE的发病机制中起到重要作用。如狼疮肾炎；血管炎；皮肤的蝶形红斑等均与该抗体有关。三、抗ENA抗体谱（一）概述ENA（extractable nuclear antigens）是可提取性核抗原的总称。ENA是细胞内许多小分子的RNA和多肽组成的非组蛋白的酸性核蛋白颗粒。ENA主要包括Sm、RNP、SSA、SSB、Jo-1、Scb-70等抗原。不同的自身免疫病可以产生不同的抗ENA抗体。ENA抗体的检测对自身免疫性疾病的诊断和鉴别诊断具有重要意义。（二）检测方法检测方法有多种，如免疫印迹法（immunoblotting，IBT）、ELISA、对流免疫电泳、双扩散、金标法等。这里主要介

13、绍免疫印迹技术。免疫印迹技术属于膜载体酶免疫技术，其固相载体为吸附有抗原的硝酸纤维膜。其基本原理为从小牛或兔胸腺提取ENA，经过SDS-PAGE电泳分成区带，然后转印至硝酸纤维膜上，将待检血清（含抗ENA抗体）加在硝酸纤维膜上，抗ENA抗体与ENA抗原结合，形成Ag-Ab复合物，加入酶标抗人IgG，形成Ag-Ab-酶标Ab复合物，然后加入底物显色。与标准条带对比判读，可以确定不同的抗ENA抗体。免疫印迹技术不需纯化抗原，灵敏度高，特异性强，操作简便，是广泛采用的检测抗ENA抗体的技术。图1 ENA自身抗体谱标准对照带（三）抗ENA抗体的临床意义1.抗Sm抗体：是SLE的血清标志抗体，阳性率30

14、%40%。阴性不能排除SLE的诊断。抗Sm抗体水平与SLE活动性没有相关性，也不与临床表现相关，治疗后的SLE患者也可呈现抗Sm抗体阳性。抗Sm抗体的检测对早期或不典型的SLE以及治疗后的SLE的回顾性诊断具有帮助。2.抗核RNP抗体：高滴度的抗核RNP（nRNP）抗体是MCTD诊断的重要依据。因其抗原为含有U1RNA的核蛋白复合物，故称U1RNP。MCTD阳性率可高达95%。也可见于其他自身免疫性疾病。因为Sm与RNP为同一分子复合物（RNA-蛋白质颗粒）中的不同抗原位点，因此两种抗原具有相关性，常伴随出现，单一的抗Sm抗体阳性者较少见。3.抗SSARo抗SSBLa：是干燥综合征（SS）最常

15、见的自身抗体，抗SSB特异性较SSA高。两者同时检测可提高SS的诊断率，抗SSA抗体也可见于SLE和其他自身免疫病，亚急性红斑狼疮患者、补体缺陷的SLE患者、新生儿狼疮患者可以出现抗SSA抗体。IgG类抗SSA抗体通过胎盘进入胎儿后，可引起新生儿狼疮综合征，出现典型的SLE皮损。抗SSA抗体与胎儿的心脏传导系统结合，可以造成先天性心脏传导阻滞。4.抗Jo-1抗体：最常见于多发性肌炎（polymyositis，PM）。在其他AID一般为阴性。PM与硬皮病重叠者阳性率较高。5.抗Scl-70抗体：几乎仅见于进行性系统性硬化病（progressive systemic sclerosis，PSS），

16、阳性率40%60%，其他AID少见，是PSS的标志性抗体。正常人为阴性。四、抗中性粒细胞胞浆抗体（一）概念抗中性粒细胞胞浆抗体（antineutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）是一组以人中性粒细胞胞浆成分为靶抗原，与临床多种小血管炎性疾病密切相关的自身抗体，是系统性血管炎的血清标志抗体，对血管炎的诊断、分类及预后具有重要意义。ANCA主要有两型：胞浆型（cANCA）和核周型（pANCA）。cANCA针对的靶抗原是蛋白酶3（PR3），pANCA针对的靶抗原主要是髓过氧化物酶（MPO），其他还有乳铁蛋白等。PR3和抗MP0抗体在参与小血管炎的发病中起重要作用。

17、（二）ANCA的检测方法ANCA的检测一般应用IIF和ELISA。IIF检测采用酒精或甲醇固定的中性粒细胞涂片作为抗原。在荧光显微镜下，胞浆型（cANCA）和核周型（pANCA）分别显示特定的荧光染色模型。ELISA法采用纯化的PR3和MP0包被固相反应板，分别检测两种抗体。（三）ANCA的临床应用ANCA是原发性小血管炎的特异性血清标志物。cANCA产生弥漫性细胞浆染色，是针对PR3的抗体，常见于Wegener肉芽肿病（WG），特别是肾和肺受累的病人。pANCA产生核周染色，是针对MP0的抗体，主要见于系统性血管炎病人。ANCA检测是原发性小血管炎患者的诊断、疗效观察、判断病情活动和复发的一

18、项重要指标。WG患者活动期抗体滴度升高；缓解期下降。ANCA阳性还可见于继发性血管炎、炎性溃疡、RA、SLE、自身免疫性肝病等。五、抗心磷脂抗体（一）概念抗心磷脂抗体（anti-cardiolipin antibody，ACLA）是抗磷脂抗体之一，是最有代表性的一种。所针对的抗原是血浆中的磷脂结合蛋白。ACLA与自身免疫病和抗磷脂抗体综合征有密切关系。ACLA可以分为IgG型、IgA型和IgM型。（二）检测方法常用方法为ELISA。可以进行分型。（三）临床应用ACL抗体阳性常见于SLE、RA、急性脑血管病、反复自然流产、血栓形成、抗磷脂抗体综合征等。六、抗平滑肌抗体抗平滑肌抗体（anti-sm

19、ooth muscle antibody，ASMA）是抗肌动球蛋白的自身抗体。一般采用IFA法，以大鼠胃作为抗原基质，阳性可见胃壁平滑肌呈现亮绿色荧光。ASMA是自身免疫性肝炎的血清学标志抗体。在其他肝病例如肝外胆汁淤滞、药物诱发性肝病、急性病毒性肝炎以及肝癌患者中检出率很低。其他疾病如传染性单核细胞增多症、SS、RA、支原体肺炎、肿瘤和病毒感染者也有不同程度的阳性率。正常人中仅有2%阳性。七、抗角蛋白抗体抗角蛋白抗体（anti-keratin antibody.AKA），是抗丝集蛋白抗体之一。主要见于类风湿性关节炎患者，阳性率较低，但特异性较高。目前更为经常检测的是抗环瓜氨酸抗体（ACCP）

20、，其敏感性和特异性均较AKA为好。AKA主要采用IIF检测。ACCP抗体采用ELISA检测。八、抗乙酰胆碱受体抗体抗乙酰胆碱受体（anti-acetylcholine receptor，AchR）抗体是重症肌无力患者的标志抗体。抗乙酰胆碱受体（AchR）抗体可结合到横纹肌细胞的乙酰胆碱受体上。引起运动终板的破坏，使神经-肌肉之间的信号传导发生障碍，导致骨髓肌运动无力，称为重症肌无力（myasthernia gravis，MG）。疾病可发于任何年龄，最先出现的症状常是眼肌无力，进而累及其他部位，常呈进行性加重。抗AchR抗体多用较敏感的ELISA方法进行检测：以-银环蛇毒素包被酶标板，并与骨骼肌

21、匀浆（含AchR）作用，再加入待测血清和对照血清，最后加酶标抗体。试验的正常结果为阴性或0.03mmolL。抗AchR抗体的检测对MG具有诊断意义，且特异性和敏感性较高，大约90%的MG患者阳性；伴有眼肌症状的病人，抗体效价低于普通症状的病人；同时还用来监测对该疾病免疫抑制治疗的效果。肌萎缩侧索硬化症患者用蛇毒治疗后可出现假阳性。九、抗线粒体抗体（AMA）检测抗线粒体抗体（AMA）所针对的抗原是内层线粒体膜，无器官特异性和种属特异性。该抗体主要是IgG，与PBC相关，但对肝细胞或胆管没有直接的损伤效应，在疾病中的作用尚不明确。AMA用免疫荧光法进行检测，用大鼠肾的冰冻切片作基质；也可用ELIS

22、A来检测。正常结果为阴性或效价在1:5以下。PBC患者可有79%94%为阳性反应或效价l：160；长期持续性肝阻塞、慢性活动性肝炎、原因不明性肝硬化等也可呈阳性反应。但是肝外性黄疸一般为阴性。第三节自身抗体检测的临床应用一、一般原则某些自身抗体敏感性高，特异性不强，具有筛选意义而不具有诊断价值。另一些则敏感性低，但对某种AID诊断的特异性较高，相关性强。可以先以ANA作筛查，然后再作其他检测。二、方法的选择与结果的确认首选间接免疫荧光法，因为IIF是以细胞组织成分作抗原基质，免疫荧光定位分析最为客观，为检测自身抗体的经典试验。对单一抗原成分检测，常用ELISA和Western-Blot法。因包

23、被时需用纯化抗原，才能保证结果的准确与特异性，因此，限制了其应用。三、自身抗体检测的质量控制一般应在每次实验时，同时设立阴性阳性对照，以监测结果的准确性。应该参加室间质控；选择符合标准的试剂盒；建立规范化的实验流程等。习题93 检测ANA最常用的方法是A.ELISAB.免疫印迹法C.间接免疫荧光法D.间接血凝技术E.乳胶凝集试验答疑编号1正确答案C第二十一章MHC与HLA检测及应用本章要点1.MHC的一般特性2.HLA分型3.HLA分型的实际应用组织相容性是指器官或组织移植时供者与受者相互接受的程度，如相容则不互相排斥，不相容就会出现排斥反应。诱导同种移植排斥反应的抗原称为组织相容性抗原，也称

24、为移植抗原。一组对人和各种哺乳动物中诱导排斥反应起决定性作用的抗原称为主要组织相容性抗原（MHA）。控制主要组织相容性系统（MHS）的基因包括几个不同位点，集中分布于各种动物某对染色体上的特定区域，是一组紧密连锁的基因群，这组基因群称为主要组织相容性复合体（MHC）。第一节MHC的一般特性概念：主要组织相容性复合体（MHC）是一组存在于各种脊椎动物某对染色体特定区域的基因。MHC编码的基因产物为主要组织相容性抗原（MHA）。人类的MHC即HLA基因复合体位于人的第6对染色体的短臂上，是目前已知最复杂的人类基因系统。、三类基因。HLA由400万碱基组成，传统上分为、三类基因。类：包括经典的HLA

25、-A、B、C，非经典的HLA-E、F、G、H、X等；类：包括经典的HLA-DP、DQ、DR，非典型的HLA-DN、D0、DM等；类：位于HLA-、类之间，由一些与补体和某些炎症因子编码相关的基因组成。截止到l999年，已知的HLA等位基因数已超过l000个，且数量仍在继续增加。HLA基因复合体所表达的基因产物，除直接构成同种异体移植排斥反应的靶抗原外，在免疫应答的过程中发挥着重要调控作用，也反映着自身免疫性疾病的基因易感性。一、MHC-类分子MHC-类抗原是一组由非共价键连接的异二聚体分子，在人类包括HLA-A、B、C、HLA-E、F、G、H、X等。类分子可广泛地表达于各种组织的有核细胞上，以

26、淋巴细胞、白细胞表面的表达密度最高，肝、肾、皮肤、主动脉和肌细胞次之，成熟的红细胞、神经细胞及滋养层细胞不表达。血清与其他体液中少量存在。类分子的表达受到多种因素的调节，如IFN-、等细胞因子可促进其表达；肿瘤细胞表面类分子表达的减少或缺失，即为肿瘤细胞逃避机体的免疫监视的重要机制。 二、MHC-类分子人类MHC-类分子是由两条非共价键结合的多肽链组成的异二聚体。链和链均系HLA基因表达的产物。包括抗原多肽结合区和Ig样区，由l、2、l、2四个结构域组成。MHC-类分子的分布较窄，主要存在于B细胞、单核-巨噬细胞、DC等细胞上，血清、精液及乳汁等体液中也可检测到。胰岛细胞和甲状腺细胞在病理情况

27、下亦能表达。胰岛素、甲状腺素、雄激素、TNF-、IFN-、IL-1、IL-2、IL-6、GM-CSF等，可促进类分子的表达；而前列腺素、糖皮质激素等则可抑制其表达。三、MHC-类分子至少有36个基因定位于MHC-类区内，表达产物主要包括两类，一类是与免疫应答相关的C4、C2、Bf、TNF、HSP70等蛋白分子，可参与炎症和应急反应，与内源性抗原的加工提呈相关。另一类是与免疫无明显关联的缬氨酰tRNA合成酶、类固醇21-羟化酶及一些富含脯氨酸的蛋白质分子。类分子不是表达于细胞表面的膜分子，而是分布于血清及其他体液中的可溶性分子。第二节HLA分型HLA的多态性通过一系列特异性抗体确定，检测方法有血

28、清学分型、细胞学分型和分子生物学分型方法。HLA分型使HLA复杂的多态性更得以显露，推动了HLA与群体及自然选择关系的研究，促进了人们对疾病本质的认识。HLA分型应用于器官移植、法医鉴定、遗传学研究以及探讨与疾病的相关性等领域。一、血清学分型法方法：补体依赖的微量细胞毒试验（CDC）。分型抗原：SD抗原，包括HLA-A、B、C、DR、DQ。（一）原理标准血清+淋巴细胞，形成抗原抗体复合物，加入补体，在补体的作用下，细胞被溶解。溶解的细胞可被加入的染料（台盼蓝、伊红）着染，即为阳性反应，计数死细胞数，作出结果判断。（二）技术要点1.CDC试验的关键在于获得标准抗血清，与AB0血型抗体不同，主要获

29、自经产妇。2.抗血清种类应覆盖本民族、本地区80%以上的抗原。3.类抗原，仅分布于B细胞或巨噬细胞表面，故检测类抗原应分纯B细胞。4.注意下列假象：粒细胞和单核细胞能够非特异性地，吞噬染料而造成着染假象，应注意细胞形态的区别。血小板与淋巴细胞竞争，结合HLA抗体而导致假阴性结果，可用玻璃珠脱纤维抗凝。红细胞沾染易致假阳性。单克隆抗体复合物不能激活补体，不能用于CDC，可改用ELISA、FCM。（三）临床应用1.HLA配型可用于器官移植与相关疾病的诊断研究。2.HLA交叉配型即用CDC法检测受体血清有无针对供者HLA的抗体，以监测排斥反应的发生或估价受体的敏感性。3.群体反应性抗体的检测（PRA

30、）PRA用于判断器官移植时受体的敏感程度。二、细胞学分型法细胞学分型法是以混合淋巴细胞培养（MLC）或称混合淋巴细胞反应（MLR）为基本技术的HLA分型法。能用本法分型的抗原称为LD抗原，包括HLA-D、DP。（一）单向MLC1.阴性分型法：又称为纯合子分型细胞试验（HTC）。纯合子是指细胞内一对同源染色体上两个HLA单倍型完全相同，只表达一种抗原，可从近亲婚配的子代中寻找。2.阳性分型法：又称为预致敏淋巴细胞分型法（PLT），预备：选择只有一个单倍型不同的两个个体，ab和ac，刺激细胞ab加反应细胞ac共育作单向MLC，得到针对b特异免疫应答能力的PLT。依此类推，可得到一系列识别各种已知L

31、D抗原的一套PLT。（二）双向MLC遗传型不同的两个个体淋巴细胞在体外混合培养时，由于两者HLA不同，能相互刺激导致对方淋巴细胞分裂增殖和分化，称为双向混合淋巴细胞培养。三、分子生物学分型法又称DNA分型法：灵敏度高，陈旧微量标本可检测，克服CDC和MLC的不足，前景广阔。（一）聚合酶链反应与SSP分型法方法采用一系列设计的特异性引物，作HLA基因PCR扩增，一对特异性引物只能扩增出结构与其互补的基因片段，根据引物扩增结果，能确定检样的基因型。评价：只需作PCR扩增及PCR产物检测，快速简便（二）PCR-SS0分型法序列特异性寡核苷酸-聚合酶链反应（PCR-SSO）是PCR与杂交相结合的技术。

32、关键：预先知道类基因的核苷酸序列，设计出恰当的探针。评价：需合成大量DNA探针，操作步骤多，适合大规模分型和配型。（三）RFLP与PCR-RFLP分型法限制性片段长度多态性（RFLP）分析，是最早建立的研究HLA多态性的DNA分型技术。方法：PCR扩增的基因片段等位特异的内切酶消化切成长度不一、数量不等的基因片段电泳分离，根据一系列内切酶解格局可确定PCR扩增产物的基因型。关键：预知类基因的核苷酸序列，并据此找到合适的内切酶。评价：不需同位素，简便，适合小规模分型。（四）PCR-SSCP分型法单链构象特异性-聚合酶链反应（PCR-SSCP），是以待测基因PCR扩增为基础，对扩增的DNA单链进行多态性分析的HLA分型方法。该法简单、快速、精确，已初步应用于异基因骨髓移植的配型工作。（五）SBT分型法基于序列的HLA分型法，是一种通过对扩增后的HLA基因片段进行核酸序列测定，从而判断HLA型别的方法。方法：PCR扩增出的HLA基因片段纯化，自动测序仪测序。评价：直接、精确、价格昂贵，主要用于新等位基因的鉴定。第三节HLA分型的实际应用一、HLA与器官移植HLA分型的应用首先与器官