医学标书例文

1、河南省科技攻关计划项目 姓 名: Luo Bin, jie 项目名称: miRNA与膀胱癌诊断，临床治疗的相关研究 单 位: 郑州大学 联系电话: 填报说明 请根据自己的专业及研究方向，针对某具体临床问题，结合所学习临床科研方法的 种或几种写出一份科研设计。完成后，文件以个人姓名命名，发至： o考核成绩依设计书优略评定。截至日期 2013年11月8日。 、项目的立项依据和意义（说明国内外相关领域技术发展水平和趋势等） 精品文档 全国肿瘤登记地区膀胱癌发病率为 7.49/10万，世界人口标化发病率（世标率） 为4.53/10万，膀胱癌居中国男性泌尿生殖系恶性肿瘤发病率第 1位,居中国 恶性肿瘤发

2、病率第8位，居中国男性恶性肿瘤发病率第 6位，全国肿瘤登记 人口膀胱癌发病率，呈现逐年增长趋势1。孙思邈千金要方卷一 诊候： “古之善为医者，上医医未病之病，中医医欲病之病，下医医已病之病。在医 学如此高速发展的今天，我们显然不会满足大多数“发现无痛性肉眼血尿- 进行膀胱镜检-再行手术切除一膀胱灌注”的这一套最常见的膀胱癌诊治流 程。介入科韩新巍教授说过未来医学是微创和介入医学的为主导的，内外科为 辅助的医学。显然对miRNA的探求能对膀胱癌的诊治带来前所未有的契机。微 小核糖核酸（microRNA, miRNA在转录后水平对基因的表达进行调控。miRNA 在膀胱癌的演进过程中发挥着类似于癌基

3、因或抑癌基因的作用。目前研究表 明，对miRNA的调控可为临床膀胱癌的诊治提供一个新的靶点，提高膀胱癌 患者的远期生存率和生活质量2。 1:关于miRNAmiRNAs是一类大小为19个25个碱基的单小分子RNA在细胞 核内，它本身不编码蛋白，但是可调节其他基因的翻译表达。 miRNA初级产物 在RNA聚合酶n作用下合成miRNA转录前体（Pri - miRNA ，然后经RNA聚 合酶m （Drosha酶）和DGCR蛋白加工后，形成发卡环结构的 miRNA前体 （Precursor miRNA premiRNA，最终被转运体Exportin 5 转运至细胞质， 由核酸酶Dicer剪切形成RNA诱

4、导的沉默复合体（RNA induced silencing comp lex , RISQ。miRNA通过与靶mRNA特异碱基配对而引起靶miRNA的降 解或翻译抑制，在转录后水平调控基因表达，从而调控肿瘤细胞的增殖和凋 亡。细胞可分泌含miRNA的复合物进入体液，如尿液、血液、唾液、母乳。 一种miRN阿靶向一个或者多个mRNA多种miRNA也可同时靶向一个mRNA因 此，异常表达的miRNA不仅能致癌而且有肿瘤抑制的功能。 2: miRN与膀胱癌的关系的研究趋势及范围 miRNA miRNA表达变化 表1:部分膀胱癌相关miRNAs的差异表达（数据来源于miRNAs在膀胱癌诊治中的研究进展

5、） 推测靶基因 miRNA-19 a 上调 P TEN miRNA-2 2 2 上调 miRNA -9 9 a/100 下调 FOXA1 miRNA-1 下调 In cRNA UCA1 miRNA-2 4-1 下调 FOXM1 miRNA-1 4 5 下调 P AK1 miRNA-1 0 1 下调 miRNA-1 2 6 下调 ADAM 9 miRNA-1 2 5 b 下调 SIRT7, MAL 1 表2： miRNA表达水平变化与膀胱尿路上皮癌的关系3 miRNA 水5牝睿配璋因 ffffl nR -7 0低 FCFE3 hK-IC* 畀ft FGHB nWHitt上眩e商 mJt l7-5

6、p Wb iniH * Vk -3 MT? 不,抑制护喘审生世oTt viH -31 ffW 上 oR-燃 増111廉K上戳黄忤対靛 nR-IQI ETH* 促虚尿路上皮播1凰#堀阳皿 BiA f L 幵氏 HOX 丼宦怏 idH-IZH 媳加鳳ft IMfUffStt可能*克”TJ耶粽 iniRlZ6 律低 rCTT.7 促冼肿划1(主K牌4.4谢債軽力 nift-JZl 升A 1 LALNTl g SOW 蔚寻畢息扃匸 Tjfl - I33t 升 KITT 不弊權屬孰牛札町能 mihl4l 岸低 to械tt上皮儘性可te uR - 14 Rm 促讶神及增 iniR-HS 降低 促逬匿穂卜应

7、禅ff相建丘 wR-185 轉进卿)1唯 tBiH-LWi hull 革聊鼎W(d肿禺叙主坯呵龍 ut-皿z -血b、rn- gk n低 ERItrL唯疋図It上圧CWT S惶J*低ECFK拈抗昌上宝爱性町 (niR2l4 升ft 健进 uiH-Ztn 有护收 #在争少FStt上宙W更ft歩性可ft miR-益1 HA 1卯 WJtwnafiR 牛 tt niR-321 17崛 *加鳳|1丄皮叮能*口亠口胡标* iiR -n) L33J kirt - 45i ; 6 表3: miRNA家族的一些机制细分 nv尺NA relatJ b EMT iriASbn flnd Beats rni 咎 2

8、九 rniFMM, miF-iei rTtiR-40y.miR-23 iniR-200 Ccrelation wrh 帕 有尉內 ion of 9iowih reacts miR-20 miR-305 HypQx同 RUtivNiofi of ngiiD9onc 倍ctois： miR-124. irtiR-214 E麻4隈3 Oi tJnoontrolMir#i cvcIb miR农H MR吃*4 miR-5eO 2吨 加*1知 li Resistance to apoptoc： miR-2lH R29. niiR-214, nift-205 Dbrupdofi otariLgrofrfi

9、signaling. EiR/83. miRgJ IIIDl miR-205 Fi(L*re J hklirurcs gf 也対 oncer iKyand nifthJA perspective. Ahbrviarinns miPMA. rnrrifvJNA-門T Pfiih：4iil_rneT+i/nal in 询E 3.国内外相关研究成果 I : miRNA与膀胱癌早期诊断的一些研究发现 Tolle等在血液中和尿液中不同表达的 miRNAs来发现膀胱癌，采用数据库 来源于the Sa nger database v 14 的基因芯片分析，在血液中，miRNA-2 6 b -5 p、miRN

10、A-14 4-5 p、miRNA- 3 7 4 - 5 p 在浸润性膀胱癌中 高表达，而且miRNA-2 6 b -5 p特异度为9 4% ，敏感度为65% 。在尿 液中miRNA-6 18、miRNA-1 2 5 5 b -5 p在浸润性膀胱癌中高表达，而 且miRNA 1 2 5 5 b -5 p特异度为6 8% ，敏感度为85% 。由此推断， 根据血液、尿液中一些特异的miRNAs来诊断浸润性膀胱癌成为一种可能 4。 Zha ng等检测9 7例膀胱癌患者手术标本的癌组织和邻近正常组织miRNA, - 2 2 2表达水平，分析它们与临床病理参数和预后评估相关性。结果显示 肿瘤组织miRNA

11、-2 2 2的表达水平显著高于相应的非癌组织(P V0 .0 0 01)。Kaplan - Meier分析表明，具有较高miR- 2 2 2表达水平的患 者与低表达水平患者相比较，5年生存率分别为2 9.5 3 %和52 . 7 5%。其中包括miRNA- 2 2 2过表达，肿瘤病理分级，肿瘤分期和肿瘤数 目的多变量Cox回归分析，miRNA 2 2 2的过表达与较差存活率独立相关 1 0.39, P V 0.0 ,并且可以被用来作 (HR5 .17,95% CI :2.33 0 1)。miRNA- 2 2 2的过表达提示膀胱癌预后不良 为警示预后不良的生物标志物5。 0 对患者的膀胱癌 mi

12、RNA19 a 水 Feng等利用Taqman探针茎 环法PCR精确测量10 组织、相邻的非肿瘤组织、膀胱癌患者和正常人对照的血浆 平。用miRNA19 a模拟和抑制剂转染膀胱癌细胞。结果发现miRNA19 a在 膀胱癌组织中显著上调，而且 miRNA-19 a的表达水平与癌细胞的侵袭能力 相对应。同时，获得或丢失miRNA19 a的功能性试验印证了它可能在膀胱 癌的发展中起癌基因作用。此外，膀胱癌患者的血浆中检出的miRNA19 a支 持发展为膀胱癌的潜在诊断标记物。另一组研究者利用互补的反义核酸转染到 原先上调的miRNAs发现其表达明显受到抑制，并检测出肿瘤细胞增殖明显减 缓6。 Zhu

13、 等通过小干扰RNA(siRNA)和miRNA14 5 介导的IGF- IR的敲除 实验揭示了 miRNA-14 5促进癌细胞凋亡，进一步分析发现主要通过影响的 IGF - IR信号传导，以抑制IGF - IR的表达，抑 制癌细胞增殖和迁移，起到抑癌基因的作用。另一组研究者发现膀胱癌中miRNA -34 a、miRNA-100、miRNA149、miRNA- 3 4 0 均体现为抑癌 基因的作用。他们采用转染的方式上调其表达，发现癌细胞增殖、分化能力明 显受抑制，而且侵袭、迁移能力也减弱，印证了它抑癌基因作用的推测7. (检测出来了说明对于膀胱癌患者是好的) ll:miRNA与膀胱癌的治疗 L

14、i等研究发现，以顺铂为基础的化疗诱导了miRNA3 4 a的启动子去 甲基化，增加miRNA-3 4 a的表达，反过来 增强了肌层侵入性膀胱癌细胞对 顺铂的敏感性，降低了癌细胞侵袭性和增殖能 力8。 Kozinn等根据miRNAs的变化来预测是否对吉西他滨有抵抗性，研究结果 提示 miRNA- 1 2 9 0、miRNA-13 8、miRNA- let -7 i、miRNA- let -7 b通过调节黏蛋白4 ，使吉西他滨产生耐药性。由此设想，通过调控的 特定miRNAs的表达或者影响其上游基因信息传递通路，可以增强膀胱癌化疗 的敏感性以及减少其耐药性9。 把表达p5 3基因的腺病毒载体和靶向

15、于 CDKN A基因的人工miRNA转染 进入癌细胞可增加癌细胞对阿霉素的化疗敏感性 ；miRNA5 2 1的表达增加 可通过靶向DNA修复酶位点增强肿瘤细胞在辐射中的敏感性 10. 为解决临床膀胱癌患者对顺铂耐药的问题，Drayton等研究发现SLC7 A1 1基因的表达与 miRNA2 7 a的表达呈负相关，当 miRNA-2 7 a高表达或 者通过siRNA、柳氮磺胺吡啶降低SLC7 A11基因的活性时，耐药的膀胱癌 细胞株的致敏性得以恢复，由此可推测miRNA-2 7 a可作为治疗膀胱癌患者 对顺铂耐药的一条途径11。 4:选取自己感兴趣的mi-RNA家族成员进行研究 相关研究表明mi

16、-RNA99a作为一个肿瘤抑制因子，在膀胱癌中水平降低，有降 低尿路上皮癌侵袭性可能。其他相关研究：mi-RNA在人类可以通过靶基因mTOR 促进食管鳞状细胞的凋亡12, mi-RNA的低表达也能促进口腔鳞癌细胞的 增殖13。那么它的高表达是否意味着膀胱癌患者癌细胞同样受到抑制，提 示着患者预后较好？或者依据 miRNAs表达的时序性和组织特异性特征，可以 探索膀胱癌各个发展阶段中的特定miRNA表达谱，用于判断膀胱癌恶性程度 和临床分期？或者是提前通过测量其相关调控基因产物预测患者患膀胱肿瘤 风险？或者是了解它的表达是否能增强治疗膀胱肿瘤药物的敏感性及耐药性 等？ 我选取一个比较小的研究点：

17、 研究可以反其道而行之，根据临床上已经确诊的膀胱癌的标本或者细胞株来测 量mi-RNA的含量，同时测量一定标本正常人群 mi-RNA的含量，来推测膀胱尿 路上皮癌各个发展阶段中的特定 miRNA表达谱是否与膀胱癌恶性程度和临床 分期存在着某些统计学上的联系。 :1:韩苏军，张思维，陈万青，李长岭。中国膀胱癌发病现状及流行趋势分析。中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研 究所，泌尿外科。 :2:梁敏，王海峰，王剑松。miRNAs在膀胱癌诊治中的研究进展。医学与哲学 527 期。 :3孙阳综述，郭剑明审校.miRNA调控与膀胱癌的关系研究进展。International 2015年6月第36卷第6B期总第

18、Journal of Urology and Nephmlogy。 4 Tolle A , Jung M, Rabenhorst S , et for the detection of urinary bladder cancer al . Identification of microRNAs in :J . Oncol Rep , 2013 , 30 blood and urine as tumour markers (4) :1949 - 1956 . :5 Zhang D Q , Zhou C K , Jiang X W , prognosis in bladder cancerJ .

19、 World J Surg Oncol :6张 明，魏 巍，刘禄成，等反义微小 RNA- 21对人膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响 版，2010 , 36 (3): 450 - 452 . :7张 超，姚志勇，朱鸣阳，等. microRNA- 34a通过Notch 1对膀胱肿瘤细胞株 T24增殖的影响J.解放军医 学杂志，2012 , 37 (5): 426 - 430 . et al . Increased expression of miRNA ,2014 , 12 : 241 222 is associated with poor J .吉林大学学报：医学 :8: Li H , Yu G ,

20、Shi R , cancer cells to chemothera py et al . CispIatin- induced epigenetic activation of miR :J. Mol Cancer , 2014 , 13 (1): 8 . -34 a sensitizes bladder :9: Kozinn S I , Carcinoma Cell Line Harty N J :J: ,Delong J M , et al . MicroRNA Profile to Predict Gemictabine Resistance in Bladder .Genes Can

21、cer , 2013 , 4 ( 1 /2 ): 61 -69. 10 Josson S , J. Prostate Sung S Y ,2008 , ,Lao K , et al . Radiation modulation of microRNA in prostate cancer cell lines 68 (15): 1599 - 1606 . E , Peter S , et 11 Drayton R M , Dudziec in Bladder Cancer by Targeting the Cystine 20 (7): 1900 - 2000 al . Reduced Exp

22、ression of miRNA- 27 a Modulates Cisplatin /Glutamate Exchanger SLC 7 All J. Clin Cancer Res Resistance ,2014 , :12 Sun J, Chen Z, Tan X, Zhou F, Tan F, by targeting mTOR in human esop hageal squamous cell carcinoma. Med Oncol 2013, 30:411. 13 Yan B, Fu Q, Lai L, Tao X, Fei Y, Shen J, Chen 乙 WangQ:

23、Downregulation of microRNA 99a in oral cell carcinomas contributes to the growth and survival of oral cancer cells. Mol Med Rep 2012, 6:675 Gao Y, Sun N, Xu X, Shao K, He J:MicroRNA-99a/100 p romotes apop tosis squamous -681. Jan 201 1 . V01. 31 NO. I 二、项目创新点、主要研究开发内容及目标(实施方案、技术关键、技术路线和技术经济指标等) 精品文档

24、 mi-RNA含量，同时测量一定标本正常人群 miRNA表达谱是否与膀胱癌恶性程度和临 iv: vi: 值） vii: 值） 实施方案：通过实验测量膀胱癌标本不同临床分期，病理分期 mi-RNA的含量，来推测膀胱尿路上皮癌各个发展阶段中的特定 床分期存在着某些统计学上的联系。 1：技术经济指标 哺乳动物血清中循环核酸表达水平稳定，检测的可重复性良好，具有作为肿瘤标志物的潜力 1o尿液、粪便甚至毛发，也是临床上易于获得的检测样本。如果能找到相应的miRNAs表 达谱，又具有较高的敏感性和特异性，来作为膀胱癌诊断的生物标记物，替代目前的有创性 检查，将是巨大的突破。 最终我们希望通过大量实验证实：

25、可以依据 miRNAs表达的时序性和组织特异性特征，探索 膀胱癌各个发展阶段中的特定 miRNA表达谱，用于判断膀胱癌恶性程度和临床分期，从而 为诊治提供依据。 2:技术路线 i:选取实验对象：选取我院住院患者中40例（便于统计学检验）正常膀胱粘膜上皮组织（可 取材于成人尿道下裂手术），选取50例已经确诊为膀胱癌患者的手术标本 （可非浸润性1,1111 级各10例，浸润性标本20例，需由病理科配合完成）。沟通患者签署研究知情同意书，研 究方案交医院伦理委员会批准。 ii:组织总RNA的提取及质量检测：从上述组织标本中取50100 mg组织块以提取总RNA 组织块在液氮中研磨成粉末状后倒入匀浆器

26、中，加 1 ml TRIzol （TRIZOl是一种新型总RNA 抽提试剂）处理，然后倒入Ep管中，12 000 r /min ,4C离心20 min后取上清，按照Invitrogen 公司的TRIzol使用说明书提取总RNAo甲醛变性胶电泳检测总 RNA质量. iii:逆转录cDNA合成，定量PCR:采用50卩l反应体系:5卩l模板（逆转录产物），4卩l引 物混合物（10 Pmol / 卩 1）,25 卩 l 2 X SYBR Green16 卩 l 水。反应条件:95C 15 min;95C 15 s，56C 20 s, 68C 20 s,扩增 40 个循环;95C 1 min, 56C

27、1 min, 95C 1 min,采集熔解 曲线. 实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR检测miRNA-99a的相对表达量 基因表达水平计算：以2 - CT （ CT =标本目的基因CT值-标本内参基因CT 表示样本中目的基因的相对表达量，CT越高，表达量越低。 统计学处理：用SPSS软件对数据进行统计，对其肿瘤组织中mi-RNA99a表达量（Ct 进行独立样本的t检验。相关性采用Spearman相关分析。对肿瘤恶性程度（G1-G2和 G3）,肿瘤的临床分期（I-II和III-IV）分组不同的无进展生存期差异,进行log-rank检验, 并分别采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线

28、；多因素分析釆用Cox比例风险回归模型进行 分析。将单因素分析中有统计学意义的临床病理因素：临床分期、mi-RNA99a表达量纳入Cox 可简单绘制如下统计表格： RT-qPCR检测膀胱上皮癌和正常膀胱上皮组织中差异mi-RNA99a基因的表达（x s） 标本分组 正常 分级 I级 II级 III级 分型 浸润性 非浸润性 标本数 20 10 10 20 mi-RNA99a基因的表达检测值 比例风险回归模型进行综合分析，变量筛选采用逐步向前回归法，以PS 0. 05为纳入标准， P0. 10为剔除标准。 三、实施本项目已具备的条件（说明已具备的试验手段、技术力量、前期科研基础情况） 8 精品文

29、档 1 :检测 miRNA的方法：目前已经开发出多种miRNAs的表达检测手段，如Northem blotting、实时定量 PCR (RT- PCR基因芯片技术等。Northern blotting是基于分子杂交 的检测技术，它是最先运用于 miRNAs的半定量检测，视作该检测的金标准1。RT PCR 是现今miRNAs应用得最广泛的定量检测方法，其中常用的有polyA聚合酶加尾法和茎环 法(stemlooP) 2o通过对比这两类基于PCR技术的miRNAs定量检测方法的基本原理和 试验流程，比较了它们技术间的异同，认为茎环引物法能够检测到10 pg miRNAs而加尾法 能检测到2 5 p

30、g的miRNAs，前者的灵敏性更高。基因芯片技术(DNA microarray)，其 工作原理也是通过分子杂交进行定性与定量分析。但是基因芯片可以一次性分析数万个基 因，进行miRNAs高通量筛选和分析。并可以经实时定量基因扩增荧光检测系统(QRPCR 验证膀胱癌组织差异表达的 miRNAso最近，也有研究者运用荧光 DNA探针技术来分析成 熟miRNAs3。现今miRNA调控与膀胱癌的关系研究着眼于表达谱研究 (miRNA profile)及 功能性实验(fun ctio nal exp erime nt)。表达谱研究指已知正常组织细胞中表达的特定多个 miRNA,比较相关肿瘤组织(如膀胱内

31、正常尿路上皮对应尿路上皮癌组织)内这些miRNA表达 水平的变化4。功能性实验旨在确定某些 miRNA是否调控已知原癌或者抑癌基因的表达， 即确定miRNA调控的靶点5。 2:科研技术力量：郑州大学河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室为河南省 级医学研究实力较强的科研机构，成立以来每年可支配大量科研经费，拥有许多具有硕士 或博士学位的专业技术人员和完成该实验所需的大型仪器。 统计处理方案方面可以请教公共卫生学院的各位资深统计学者作指导。 医学院研究方面与一附院合作紧密。通过病理科资深专家和泌尿外科手术室的协助， 可谓是如虎添翼。 3:前期科研基础： 人员：资深病理学家对膀胱癌患者标本的采集

32、，专业从事mi-RNA基础研究的基础医学院学 者，专业的公共卫生学院的统计学者，娴熟泌尿外科手术专家 财政：可以申请专门的实验经费来完成这个项目，国家自然基金，青年基金，学校科研部 门经费的支持等。 硬件环境：专业的现代化分子研究实验室，各种现代化研究大型仪器 已完成科研成果：相关专家对于mi-RNA家族其它部分成员有深刻的研究，对于试验中发现 的新的生化指标应用于临床诊治有着一套熟悉的流程，科学的推断，严谨的论证。这些资 料可以通过文献获得。 1 Cissell K A，Deo S K . Trends in microRNA detection J. Anal Bioanal Chem ，

33、2009，394 (4): 1109 1016 :2陈新，曾长英，卢 诚，等.基于PCR技术的miRNA定量检测方法JD。中国生物工程杂志，2010， 30 (11): 88-93 . 3 Kato Y . An efficie nt fluoresce nt method for selectivedetecti on of mature miRNA sp ecies J . Nucleic Acids SympSer (Oxf)，2008，52(1): 71-72. 4 Volinia S，Calin GA. Liu CG。el a1. A microRNA expression sigu

34、ature of human solid tumors de?nes cancer 9 gene targets. Proc Nail Acad Sci USA 2006。103: 2257 226I. 5 Lindow M . Gorodkin J. Principles and limitations of computational microRNA gene and target?nding . DNA Cell Biol。2007。26: 339 351. 精品文档 四、项目的预期经济、社会和环境效益 10 精品文档 目前，膀胱癌的发病率在世界范围内有上升趋势，这种变化在我国尤其明 显。关于癌症发病机制、转移、复发等基础方面的研究发展迅速。miRNAs在 膀胱癌中抑制或者促进癌症演变的报道越来越多，其具体作用机制尚不了解。 但是，随着基因芯片和生物信息学技术的发展， 为miRNAs的研究提供了难得 的机遇。研究方向上，深入探讨 miRNAs作用机制仍是主要任务之一，应注重 系统性研究，确定重要 miRNAs的位点基因，研究不同 miRNAs的协作机制