珠子参多糖抗肝癌作用的实验研究

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减珠子参多糖抗肝癌作用的实验研究（作者：单位：邮编：）作者：陈涛，陈茂华，胡月琴，巩仔鹏【摘要】 目的观察珠子参多糖（Pa nax japlcus var Polysaccharide,PJPS）对小鼠H22肝癌移植瘤生长的抑制效应及其 机制。方法分别建立BALB/c小鼠H22肝癌移植实体瘤模型及腹水瘤 模型，将小鼠随机分为3组，即生理盐水组（阴性对照）、5-氟尿嘧啶 组（阳性对照）、珠子参多糖组。给药结束后比较各用药组的抑瘤率、 胸腺指数、脾指数、肿瘤组织细胞形态结构，肿瘤细胞超微结构、肿 瘤细胞凋亡率、CD4+/CD8値、外周血血清中血管内皮生长因子含量

2、及生命延长率。结果珠子参多糖组的胸腺指数、脾指数、CD4+/CD8+值，外周血血清中血管内皮生长因子含量及生命延长率均高于5-氟尿嘧啶组，珠子参多糖组的抑瘤率及肿瘤细胞凋亡率低于5-氟尿嘧啶组，珠子参多糖组的部分肿瘤细胞有坏死现象及凋亡学形态变化。结论珠子参多糖对H22肝癌小鼠具有抑制肿瘤生长、延长生命的作 用。提高机体细胞免疫功能，干扰肿瘤细胞周期，降低VEGF的表达可能是珠子参多糖发挥抗肝癌效应的机制。【关键词】 珠子参；多糖；肝癌；肿瘤抑制Abstract : ObjectiveTo observe the anti-tumor activity ofPanax japlcus var

3、Polysaccharide (PJPS) on transplanted tumor H22 in mice and its mechanism.MethodsH22 transplanted solid hepatocarc inoma model and the ascites hepatocarc inoma model were established.The BALB/c mice were ran domly divided into 3 groups:no rmalsali negroup (n egativecon trolgroup) ,5-fluorouracil gro

4、up(positive control group),and PJPS group.After adm ini strati on ,the in hibitory rate of tumor,the thymusin dex,the splee n in dex,tumor cellmorphology,a ndultrastructure,the rate of apoptosis of tumor cell,CD4+/CD8+ ratio,levelof VEGF and the rate of lifeextension weredeterm in ed. ResultsThe thy

5、mus in dex,splee nin dex,CD4+/CD8+ratio,level of VEGFand the rate of life extension in PJPSgroup were higher tha n those of 5-FU group,but the in hibit ing rate of tumor and the apoptosis rate of tumor cell were lower than those of 5-FU group.The tumor cells of PJPSgroup partly died . The tumor cell

6、 nu cleus of PJPS group concen trated, and tumor cells got smaller. ConclusionPJPS can inhibit the growth of hepatoma carcinoma cells of H22 tumor-bearing mice. Improving the cellular immunefunction, interfering with tumor cell cycle and reduc ing the expressi on of VEGF may be the mechamisms of an

7、titumor effect.Key words : Panax japlcus var ; Polysaccharide ; Livercan cer; Tumor suppressor珠子参Panax japlcus var,major又名扣子七，属五加科人参属植物，主要分布于东喜马拉雅至我国西部山区。其根茎为药材珠子参， 具有活血散瘀，补血止血，消肿止痛之功。我们在早期的研究中发现 珠子参水煎液有较好的抗肝癌作用1, 2,但珠子参多糖的抗肝癌 作用尚未有相关报告。而目前对多糖的诸多研究表明其有很好的抗肿 瘤活性37。本课题拟研究珠子参多糖治疗肝癌的作用机制，从 而为开辟抗肝癌新药提供新的

8、线索。1材料1.1动物及瘤株雄性BALB/c纯系小鼠，清洁级，68周龄，体 质量（20士 2） g，共80只，由湖北省实验动物中心提供，动物合格 证号为：SCXK鄂）2003-0005。小鼠肝癌H22瘤株（H22细胞）由三峡 大学医学院免疫教研室提供。1.2药品及试剂珠子参：购于宜昌市沿江中药房，经宜昌市药检 所鉴定，产地：神农架，批号：200703; 5-氟尿嘧啶（5-FU）针剂：上 海旭东海普药业有限公司，批号：20070123,灭菌生理盐水稀释至一 定浓度，避光常温保存；Mouse VEGF ELISA Kit上海船夫生物科技 有限公司；小鼠 CD3-FITC/CD4-PE CD3-FI

9、TC/CD8-PE苏州生物基 因有限公司；RPMI-1640培养液:Gibco公司，批号：1342878。2方法2.1药物及试剂制备2.1.1珠子参多糖水提醇沉法提取珠子参粗多糖，经活性炭脱 色、链霉蛋白酶-Sevag法除蛋白、透析袋去除小分子杂质后得到珠 子参精制糖。2.1.2 5-FU在超净工作台避光条件下，无菌生理盐水稀释5-FU针剂至一定浓度后分装于 EP管并用锡纸遮盖保存于4 C冰箱。2.2动物模型的制作将浓度为 5.0 X 106个/ml的肝癌细胞悬液 注射至健康BALB/c小鼠右腋皮下，每只0.2 ml，建立实体瘤模型； 按上法小鼠腹腔内接种H22细胞悬液建立腹水瘤模型。2.3动

10、物分组及给药造模后随机分组，每组 10只小鼠。从第2 天起分组给药：生理盐水组（normal saline,NS ）（阴性对照）：灌胃 0.2 ml生理盐水+腹腔注射0.2 ml生理盐水，1次/d ,连续给药11 d;5-氟尿嘧啶组（5-fluorouracil,5-FU）（阳性对照）:腹腔注射0.2 ml5-FU+灌胃0.2 ml生理盐水，剂量为25 mg/kg体重，隔日1次，共 6次。间隔期间以生理盐水替代5-FU腹腔注射；珠子参多糖组（panax japlcus var polysaccharide,PJPS ）:灌胃 0.2 ml 珠子参多糖 + 腹腔 注射0.2 ml生理盐水，1次/

11、d。剂量为50 mg/kg体质量，连续给药 11 d。2.4指标测定2.4.1抑瘤率给药结束后实体瘤模型眼球取血处死小鼠，计算公式如下：抑瘤率（% =（1-实验组肿瘤质量模型组肿瘤质量）X 100%2.4.2胸腺指数及脾指数无菌条件下剥离小鼠胸腺及脾脏，称 重。按下列公式计算胸腺指数及脾指数：胸腺指数二胸腺重量（mg小鼠重量（g）脾指数二脾重量（mg）小鼠重量（g）243观察肿瘤组织细胞形态结构的变化取各组小鼠肿瘤组织，10 %甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察肿瘤生长、坏死及对周围组织的浸润等情况。244观察肿瘤细胞超微结果的变化经取材、固定、脱水、浸透、包埋和切片染色

12、后用于透射电子显微镜观察。2.4.5肿瘤细胞周期分析利用 PI标记的方法，通过流式细胞仪 对细胞内DNA勺相对含量进行测定，分析细胞周期各时相的百分比及 凋亡细胞所占比例。2.4.6 T细胞亚群的检测利用流式细胞仪检测小鼠脾脏中CD3+CD3+CD4+ CD3+CD8+ T田胞亚群数量。2.4.7荷瘤小鼠血清中VEGF含量测定小鼠眼球取血，用干净试 管收集血液，室温凝固2 h,离心2 000X g 15 min,收集血清。ELISA 检测血清中VEGF含量。2.4.8观察对小鼠生存时间的影响从第 13天起停止给药，记录 小鼠存活天数。给药后生存时间不足 5 d的予以排除。按下列公式计 算生命延

13、长率：生命延长率（ILS）=用药组平均生存天数-阴性对照组平均生存天数阴性对照组平 均生存天数X 100%2.5实验数据统计采用士 s表示，多组之间比较采用单因素方差 分析，组间两两比较采用独立样本 t检验,统计数据采用SPSS 10.0处理3结果3.1各组小鼠肿瘤生长情况的比较小鼠接种7 d后各组可触及右腋皮下肿块，阴性对照组小鼠肿瘤生长迅速，局部肿胀，有明显触摸 感，用药组肿瘤生长相对迟缓。用药组抑瘤率检测结果见表1。表1珠 子参多糖对H22实体瘤小鼠瘤重的影响（略）3.2对小鼠免疫器官的影响各用药组的胸腺指数及脾指数见表2。表2珠子参多糖对H22实体瘤小鼠胸腺及脾指数影响（略）3.3光镜

14、观察肿瘤细胞形态结构的变化光镜下阴性对照组 肿瘤细胞的形态结构见图1，珠子参多糖组的肿瘤细胞形态结构见图 2。3.4肿瘤细胞超微形态观察电镜下阴性对照组的肿瘤细胞超微 形态结构见图3,珠子参多糖组肿瘤细胞超微形态结构见图4，5-FU组肿瘤细胞超微结构见图5。3.5流式细胞仪检查肿瘤细胞DNA含量并进行周期分析的结果各用药组肿瘤细胞周期及凋亡率见表 3。表3珠子参多糖对H22实体 瘤小鼠肿瘤细胞周期及凋亡率的影响（略）3.6对CD4+ CD8+T细胞亚群水平的影响 结果见表4。表4珠 子参多糖对H22实体瘤小鼠脾脏中T细胞亚群的影响（略）3.7对荷瘤小鼠血清中VEGF浓度的影响试剂盒标准品吸光值

15、 A与浓度 C 的线性方程：A = 0.004 1C + 0.240 1（ r = 0.999 6 ）。各 组小鼠血清中VEGF表达情况如表5。表5珠子参多糖对H22实体瘤 小鼠血清VEGF水平的影响（略）3.8对荷瘤小鼠生存状况的影响除 5-FU组外，其他各组小鼠接 种后5天左右腹部膨大，手触摸明显比接种前柔软，同时小鼠活动开 始减少，食欲减退，毛发蓬松。5-FU组小鼠接种后7d左右出现腹水 征。用药组生存时间观察结果见表 6。表6珠子参多糖对H22腹水瘤 小鼠生存时间的影响（略）4讨论在本实验中，珠子参多糖组小鼠的瘤重量低于阴性对照组，且差异 有显著的统计学意义。其抑瘤率为 34.44%,

16、虽然低于5-FU组，但仍 显示出该药对H22荷瘤小鼠肿瘤生长有较强的抑制作用。另外荷瘤小 鼠生存状况优于5-FU，生存时间与5-FU相比差异虽无统计学意义， 但其值高于5-FU组，说明中药提取物在抑制肿瘤生长方面效果不如 传统化疗药物，但在改善荷瘤小鼠生存质量及延长生命方面具有优 势。4.1提高小鼠免疫功能肿瘤的存在可抑制机体的免疫功能。胸 腺、脾脏作为重要的免疫器官，其重量的降低往往伴随免疫功能的衰 退。实验结果显示，珠子参多糖组的胸腺指数、脾指数均高于阴性对 照组，提示珠子参多糖能有效阻止肿瘤机体免疫器官的萎缩，从而起到免疫激活作用，但其保护免疫器官的具体作用机制还有待进一步的 研究。T细

17、胞是构成机体免疫系统的主要细胞群体之一，淋巴细胞 CD4+/CD8比值是反应机体免疫紊乱的敏感指标，当免疫功能受抑制时，CD4+/CD8比值减少8。在本实验中，珠子参多糖组 CD4+/CD8+ 比值高于阴性对照组（PV 0.05）,这说明珠子参多糖能够改善荷瘤小 鼠的细胞免疫状况。同时，珠子参多糖组脾脏中CD4+T细胞数量、CD4+/CD8比值均高于5-FU组（Pv 0.01 ）,显现出与化疗药相比其在 提高荷瘤机体免疫力方面的优势。4.2干扰肿瘤细胞的生长周期及诱导肿瘤细胞凋亡细胞周期是 反映细胞生存状况的重要指标之一，在细胞周期调控机制中有两个 重要点，分别位于G1期与S期。肿瘤细胞G0/

18、G1期阻滞，是拮抗肿瘤 细胞发展的一个重要机制9。本实验中与阴性对照组比较，珠子参 多糖组G0/G1期细胞增多，S期细胞比例减少，表明珠子参多糖可使 肿瘤细胞停留于细胞周期的 G0/G1期，阻止其进入S期，使DNA勺合 成受到抑制和阻断，从而有效地控制癌细胞的增殖，促进其凋亡。凋亡受阻是肿瘤发生的可能机制。本实验的结果表明，与阴性对照 组比较，珠子参多糖能加重肿瘤细胞凋亡，其凋亡率为14.25%，高于阴性对照组，且差异有统计学意义。电镜超微结构显示，珠子参多 糖组细胞体积变小，细胞质浓缩。部分细胞染色质出现早期凋亡的空 泡结构；部分细胞核裂解为碎块，包膜内陷并包裹胞内成分形成凋亡 小体；胞浆内

19、线粒体肿胀变形，呈现凋亡的特征性形态改变。4.3影响肿瘤血管相关细胞因子的生成研究表明， 肿瘤的增殖和 转移依赖于血管形成10。VEGF被认为是最强的血管形成促进因子:11,而在肝癌细胞中，VEGF勺表达比邻近组织明显升高，VEGF在 肝癌新生血管中起关键作用12。本实验结果显示与阴性对照组相比各用药组VEGF表达水平均下降，差异有统计学意义。其中以5-FU组水平最低。表明珠子参多糖可以有效抑制VEGF表达，从而影响肿瘤血管的生成，但作用效果不如 5-FU。【参考文献】:1陈涛，陈龙飞，金国琴，等.珠子参体外诱导人肝癌 细胞凋亡效应及机制研究J.肿瘤，2006, 26(2) : 144.:2陈涛，胡卫，崔帮平，等.珠子参对小鼠H22肝癌抑制作用及机制J.世界华人消化杂志，2007, 15(24) : 2597.:3罗荣城，韩焕兴.肿瘤的免疫应答M.北京：人民卫生出版社，2006: 57.4 ChowLW,LoCS,Loo WT.et al.Polysaccharide peptidemediates apoptosis byup-regulati ngP21 gene anddown-regulating cyclin Di gene J .Am J Chin Med.2003,31(1):1.:5赵永