考马斯亮蓝测蛋白实验报告

1、考马斯亮蓝测蛋白实验Doc$JU98YTUU8CBUUUTent serial number实验二：分光光度计的学习之考马斯亮蓝 G-250 法(Bradford 法) 测定蛋白质含量定一实验目的 学习分光光度计的根本原理和使用方法，并使用考马斯亮蓝G-250 法测 定蛋白质含量。二实验原理考马斯亮蓝G250 (Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量 属于染料结合 法的一种。考马斯亮蓝 G-250在游离状态下呈红色，最大 光吸收在488nm:当它 与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。 其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此

2、可 用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马 斯亮蓝 G-250 结合在 2min 左右 的时间内到达平衡，完成反响十分迅速；其结合 物在室温下lh内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作 简便快捷，反 应非常灵敏，灵敏度比 Lowry 法还高 4倍，可测定微克级蛋白质含 量，测定蛋白质浓度范围为0? 1 000 ug/mL,是一种常用的微量蛋白质快速 测定 方法。三实验材料1. 实验材料:未知浓度的牛血清样品2. 主要仪器:试管、移液枪、分光光度计等3. 试剂：蛋白试剂考马斯亮蓝 G-250的配制：称取lOOmg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL90%乙醇中，参加85%

3、 (W/V)的磷酸1 OOmL,最后用 蒸饰水定容到1 OOOmLo此溶液在常温下可放置一个月。四实验步骤标准曲线制作：取6支10mL干净的试管，按表1取样。摇匀后放置2min ,用lcm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录测定的光密度 0D595nm, 并做标准曲线。表1低浓度标准曲线制作管号012345lmg/ml标准蛋白 (ml)0蒸饰水(ml)0考马斯亮蓝G-250 (ml)555555蛋白浓度(mg/ml)00D595nm0上图数据标准曲线如下0D1 F00.02y = 7.7329X+0.1142 R2 =0.9277? OD值线性QD值拟合标准方程：y二+2. 未知蛋白质浓度

4、的测定另取2支10mL试管，按下表取样。吸取测定液，蒸懈水 mL放入试管 中，加 入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置 2min后用lcm光径比 色杯在595nm下比色，记录光密度0D595nm,并通过标准曲线查得待测品提 取液中蛋白质的含量X Pg o以标准曲线0号试管做 空白。五实验结果待测样品的吸光度1为，待测样品的吸光度2为，平均值为。代入标准 曲线得知x为，所以浓度为mg /mlo六、实验分析一经测量得每毫升测定液中蛋白质的含量很低，是样品本身蛋白含 量少还是实验操作造成，还需进一步分析。二考马斯亮蓝法测定未知蛋白浓度： 优点：1、灵敏度高;2、测定快速、简便，只需要参加一种试剂 3、干扰物质少。 缺点：一般分光光度法都有较大的机器误差重复性较差，为了数据 准确，需要每次进行标准曲线的测定。七、本卷须知1. 在测量前应把分光光度计预热半小时，翻开开关时，先确定开关按钮 的置，切不可凭直觉乱摸。2. 称量样品前，电子天平要归零，称量时要精准。3. 溶液一定要配制准确，以防影响实验效果，保证点在一条直线上。4. 在作标准曲