肠上皮CaCC氯离子通道抑制作用是龙血竭抗轮状病毒所致分泌性腹泻的分子药理学机制

1、肠上皮CaCC氯离子通道抑制作用是龙血竭抗轮状病毒所致分泌性腹泻的分子药理学机制分泌性腹泻是每年影响全球数百万人健康的临床医学问题。 近年来研究发现Ca2+v/sup活氯离子通道(calcium-activated chloridecha nn els,CaCCs)在轮状病毒和细菌毒素所致分泌性腹泻病理机制中均发挥重要 作用 , 是潜在的药物作用靶点。小分子调节剂是研究离子通道门控机制重要的药理学工具。 CaCCs不但能够 在细胞和离体组织模型上区分和未知 CaCCs的活性，而且还能为CaCCs的生 理功能和病理生理机制研究提供有效的分子探针。寻找CaCCs选择性小分子调节剂是相关领域研究的重

2、点内容之一。结肠癌细 胞系HT29表达一种分子身份未知的CaCC(肠上皮CaCC ,在本研究中我们利用 稳定表达绿色荧光蛋白突变体 YFP-H148Q/I152L的HT29细胞建立荧光淬灭功能 筛选模型(HT29/YFP-H148Q/I152L),得到龙血竭的主要成分龙血素 A、龙血素B 和龙血素C对肠上皮CaCC氯离子通道具有抑制作用。在 HT29/YFP-H148Q/I152L FRT/TMEM16A/YFP-H148Q/I152和 FRT/CFTR/YFP-H148Q/I152I上,利用荧光淬灭实验和短路电流实验分析活性化 合物的根本分子药理学性质 , 利用小鼠结肠离体组织短路电流实验、

3、幼鼠轮状病 毒腹泻模型实验、 小鼠胃肠蠕动实验以及小鼠肠道平滑肌收缩实验等对化合物的 体内活性进行分析。本研究的目的是获得亲和力高、体内活性好的肠上皮 CaCC 氯离子通道抑制剂，为揭示肠上皮CaCC氯离子通道的生理病理功能提供小分子 探针,为以肠上皮CaCC氯离子通道为靶标分泌性腹泻治疗提供先导化合物和新 的治疗思路。实验结果:1.利用HT29/YFP-H148Q/I152L功能测定筛选模型检测到龙血素 A、龙血素B和龙血素C能够以剂量依赖的方式抑制肠上皮 CaCC氯离子通道活性。 在HT-29细胞上进行的短路电流实验分析结果显示龙血竭、龙血素A、龙血素B和龙血素C均能在HT-29细胞顶膜侧

4、抑制肠上皮CaCCK离子通道活性。2.小鼠结肠粘膜短路电流测定结果显示，龙血竭、龙血素A、龙血素B和龙 血素C对小鼠结肠粘膜侧CaCCR离子通道有抑制作用。3.轮状病毒所致幼鼠腹 泻模型实验结果显示，龙血竭和龙血素C均可以抑制轮状病毒感染的新生小鼠的 水样腹泻和受试幼鼠胃肠蠕动。小鼠肠道平滑肌收缩实验结果显示龙血素 A对平滑肌收缩没有影响，而龙血 竭,龙血素B和龙血素C能减弱平滑肌的收缩强度。4.利用FRT/TMEM16A/YFP-H148Q/I152功能测定模型研究发现龙血素 C能够以剂量依赖 的方式抑制TMEM16氯离子通道，且抑制作用具有快速、可逆的特点；进一步的短 路电流测定结果显示龙

5、血素 C能够抑制TMEM16介导的氯离子电流。5. 利用FRT/CFTR/YFP-H148Q/I152LM定模型发现龙血素C能够以剂量依赖 的方式激活CFTR氯离子通道，且激活活性具有快速、可逆的特点；进一步的短路 电流测定结果显示龙血素C对CFTF介导的氯离子电流具有微量的激活作用。小 鼠结肠粘膜短路电流结果显示龙血素 C对小鼠结肠粘膜上皮CFTR氯离子通道有 激活作用但是不显著。6. 龙血素C对小鼠结肠浆膜侧Na+v/sup-K+v/sup-ATPase没有 作用,而对小鼠结肠浆膜侧K+v/sup通道有微量的抑制作用。7. Ca2+v/sup浓度测定结果显示,龙血素C能够抑制由ATP,卡巴胆碱(CCh及离子霉素(ionomycin )引起的细胞内钙离子浓度升高，说明龙血素C对肠上皮CaC氯离子通道的抑制作用是通过抑制细胞内钙离子浓度升高实现的综上所述,研究结果提示肠上皮CaCCR离子通道抑制作用是龙血竭抗轮状病毒所致分泌性腹泻的分子药理学机制之一 , 研究对于揭示中药活性的物质根底 和分子