第六章 植物离体培养育种

1、 第六章第六章 植物离体培养育种植物离体培养育种 Tissue culture and breeding1 植物离体培养发展简史、意义和生物学原理组织培养的概念组织培养的概念组织培养（组织培养（Tissue culture）是指用无菌方法使植物体的离是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离培养技术的总称，也称之为离体培养（体培养（In vitro culture）。）。 利用植物体的器官、组织或细利用植物体的器官、组织或细胞，通过无菌操作接种于人工配胞，通过无菌操作接种于人工配制

2、的培养基上，在一定的光照和制的培养基上，在一定的光照和温度条件下进行培养，使之生长温度条件下进行培养，使之生长发育的技术称为组织培养发育的技术称为组织培养 按培养材料分为（按培养材料分为（Gamborg等等)：组织培养的类型组织培养的类型愈伤组织培养愈伤组织培养细细 胞胞 培培 养养器器 官官 培培 养养原生质体培养原生质体培养最为常见的组织培养最为常见的组织培养 悬浮细胞培养悬浮细胞培养 单细胞培养单细胞培养胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培养叶、花和幼果的部分组织的培养类别 依外植体的不同划分 胚胎培养 （embryo culture）未

3、成熟或成熟了的胚器官培养（organ culture）根尖、茎尖、子叶、叶片、叶原基、花原基、或花果的未熟部分组织培养或愈伤组织培养（狭义，tissue culture）维管束形成层、贮藏薄壁组织及愈伤组织等细胞培养 单个游离细胞 （分离出的体细胞/花粉细胞/卵细胞） 原生质体培养 除去细胞壁的原生质体 植物组织培养是二十世纪发展起来的新技术，近三十年来由于组织培养基础理论研究的深入，发展极为迅速，发表的文献浩如烟海，几乎以植物为研究对象的各个分支学科都在广泛进行组织培养。发展简史发展简史1838-1839年，德国科学家Schleide 和Schwann发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础

4、。1902年，德国植物学家Haberlandt 根据细胞学说，提出单个细胞的植物细胞全能性（totipotency）理论。1904年，Hanning 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。1922年，Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。1934年，White 用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，不但使细胞全能性理论得到证实，而且为组织培养的技术程序奠定了基础。1962年，Murashinge 和Skoog 在烟草培养中筛选出至今仍被

5、广泛使用的MS培养基。1964-1966年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。1972年，Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。发展简史发展简史植物组织培养在技术上的发展植物组织培养在技术上的发展q研究材料范围逐步扩大q培养方法逐步完善q培养基不断改进q实验手段逐步完备胚、胚轴、子叶、幼苗、茎尖、根、叶等；动物细胞+植物细胞/微生物原生质体固体培养发展到液体振荡或旋转培养悬浮培养、液滴培养、双层培养、包埋培养White培养基、培养基、MS培养基、培养基、MT培养基等培养基等植物组织培养在农业

6、上的应用植物组织培养在农业上的应用q倍性育种：花药培养、胚乳培养倍性育种：花药培养、胚乳培养q突变体筛选：愈伤组织培养突变体筛选：愈伤组织培养q创造新种质：细胞融合创造新种质：细胞融合 克服胚败育：胚培养克服胚败育：胚培养q植物性药物和生物制品的生产植物性药物和生物制品的生产组织培养的意义组织培养的意义 胚胎培养 主要克服远缘杂交中胚不能在种子中正常发育而早期败育的问题。胚珠和子房培养 进行试管内受精和杂种胚的分化成长，以克服不育性和不亲和性等障碍。细胞及组织培养 进行优良单系的快速繁殖，自交不亲和系、雄性不育系的无性繁殖，突变体的诱导与分离及种质的保存和运输等方面。花药及花粉培养 单倍体育种

7、，加速获得纯二倍体。原生质体培养 进行体细胞杂交、核移植和核置换等工作。 愈伤组织愈伤组织培养是最为常见的组织培养方式？培养是最为常见的组织培养方式？愈伤组织（愈伤组织（Callus）：）：原指植物在受伤后，于伤口表面形成的一团薄壁细胞。原指植物在受伤后，于伤口表面形成的一团薄壁细胞。在组织培养中，指在人工培养基上由外植体长出来的在组织培养中，指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。一团无序生长的薄壁细胞。原因：原因： 大部分组织培养经历大部分组织培养经历callus再生途径长出植株；再生途径长出植株； callus可以用于悬浮培养和原生质体培养。可以用于悬浮培养和原生质体培养

8、。 按培养方法：固体培养、液体培养、看护培养、微室培按培养方法：固体培养、液体培养、看护培养、微室培养、包埋培养等养、包埋培养等 按培养过程：初代培养、继代培养按培养过程：初代培养、继代培养组织培养的类型组织培养的类型q外植体外植体（Explants）由活植物体上切取下来的可以用于组织培养的组织或器官由活植物体上切取下来的可以用于组织培养的组织或器官q初代培养（初代培养（Primary culture）q继代培养（继代培养（Subculture）指外植体的最初培养指外植体的最初培养将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中，这种反将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中，这种反复多次移植的培养，

9、称为继代培养复多次移植的培养，称为继代培养生物学原理生物学原理 植物的再生作用：植物的根、茎、叶等器官、组织和细胞都具有再生成完整植株的能力。其是无性繁殖的基础，它是受内源激素调控的。人工控制和调整培养基成分，可使其发育成完整的植株。细胞的分化和形态发生：指细胞在分裂过程中发生结构和功能方面的改变，从而在植物个体发育过程中形成各类组织和器官，完成整个生活周期。植物细胞的全能性（totipotent）：是指植物每个细胞都 具有该植物体的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。原理原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一

10、个活细胞都应该具有全能性。差异：差异：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。潜在全能性的原因潜在全能性的原因：基因表达的选择性 科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。 生物学原理生物学原理 植物细胞全能性的表达 脱分化脱分化（dedifferentiation)：将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。 再分化再分化（redifferentiation):经脱分化的组

11、织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。离体的植物离体的植物器官、组织、器官、组织、细胞细胞脱分化脱分化愈愈伤伤组组织织再分化再分化根根芽芽植植物物体体植物植物组织组织培养培养过程过程植物组织培养特点植物组织培养特点培养条件可以人为控制培养条件可以人为控制 组织培养摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气组织培养摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。定地进行周年培养生产。生长周期短，繁殖率高生长周期短，繁殖率高 植物组织培养是由于人为控制培养条

12、件，根据不同植物不植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。病毒种苗。管理方便，利于工厂化生产和自动化控制管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利

13、于自动化控制生产。高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。技术用途技术用途q快繁：人工种子、茎尖培养快繁：人工种子、茎尖培养q脱毒：微芽嫁接、茎尖培养脱毒：微芽嫁接、茎尖培养q克服杂交不亲和：花药培养、细胞克服杂交不亲和：花药培养、细胞 融合融合q种质资源保存和交换：愈伤组织培养、茎尖培养种质资源保存和交换：愈伤组织培养、茎尖培养MSMS培养基培养基 它是它是19621962年由年由MurashigeMurashige和和SkoogSkoog为培养烟草细胞为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例

14、较合适，可满足植物的营养衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。有些培养基是由它演变而来的。B B5 5培养基培养基 是是19681968年由年由GalmborgGalmborg等为培养大豆根细胞而设计等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植

15、物在生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B B5 5培养基上生长培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。一、目前国际上流行的培养基及特点一、目前国际上流行的培养基及特点2 2 植物离体培养需要的基本条件植物离体培养需要的基本条件White培养基培养基 是是1943年由年由White为培养番茄根尖而设计的。为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作年又作了改良，称作White改良培养基，提高了改良培养基，提高了MsSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。适于生根培养。N6培

16、养基培养基 是是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（和（NH4）2SO4含含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。培养和其他组织培养。KM8P培养基培养基 它是它是1974年为原生质体培养而设计的。其年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。广泛用于原生质融合的培养。 包括包括无机成分无机

17、成分和和有机成分有机成分。无机成分包括大量元素和微。无机成分包括大量元素和微量元素。有机成分主要包括糖类、维生素、氨基酸和酰胺量元素。有机成分主要包括糖类、维生素、氨基酸和酰胺类、含氮碱基、生长调节剂、自然复合物（如水解蛋白、类、含氮碱基、生长调节剂、自然复合物（如水解蛋白、酵母提取物、果肉和果汁等）以及其他成分如琼脂等。酵母提取物、果肉和果汁等）以及其他成分如琼脂等。培养基的基本成分培养基的基本成分 植物对无机盐类的需求具有广泛的一致性，偶然加植物对无机盐类的需求具有广泛的一致性，偶然加以变动。一般多采用蔗糖。维生素中最关键的是以变动。一般多采用蔗糖。维生素中最关键的是B1，一般用量为一般用

18、量为0.1-0.4毫克毫克/升。氨基酸和酰胺只用于某些升。氨基酸和酰胺只用于某些组织培养，而在器官增殖阶段加入腺嘌呤也可能是需组织培养，而在器官增殖阶段加入腺嘌呤也可能是需要的。关键的有机成分主要是激素和细胞分裂素。要的。关键的有机成分主要是激素和细胞分裂素。培养基成分的性质培养基成分的性质 可以采用固体或者液体培养基，根据不同植物和不同培可以采用固体或者液体培养基，根据不同植物和不同培养阶段而定。固体培养基中以琼脂质量好，配制时可以通养阶段而定。固体培养基中以琼脂质量好，配制时可以通过调节过调节pH值来达到适合的凝胶状态即可。液体培养基养值来达到适合的凝胶状态即可。液体培养基养时也有固定和搅

19、动两种时也有固定和搅动两种。培养基的物理性质培养基的物理性质大量元素大量元素N、P、S、K、Ca、MgN：各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要成分各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要成分Ca：细胞壁稳定细胞壁稳定Mg：酶及辅酶的成分酶及辅酶的成分微量元素微量元素Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo用量少，过多容易导致中毒用量少，过多容易导致中毒激素激素v细胞分裂素细胞分裂素v赤霉素赤霉素v生长素生长素促进促进细胞分裂和分化不定芽细胞分裂和分化不定芽6-BA6-BA、KTKT、ZAZA、2iP2iP诱导细胞的分裂和根的分化诱导细胞的分裂和根的分化IBAIBA、IAAIAA、NAANAA、2,4-

20、D2,4-DIBAIBA、IAAIAA和和IAAIAA诱导生根，诱导生根，2,4-D2,4-D诱导愈伤组织诱导愈伤组织抑制愈伤组织形成，促进芽的形成抑制愈伤组织形成，促进芽的形成GAGA3 3 几种激素的配制方法几种激素的配制方法生长素生长素细胞分裂素细胞分裂素赤霉素赤霉素95%95%的酒精或的酒精或0.1mol/L0.1mol/L的的NaOHNaOH或或KOHKOH0.50.5或或1mol/L1mol/L的的HCl+HCl+微热微热溶于水，溶于水，pH5.7pH5.7但不稳定，用但不稳定，用95%95%的酒精的酒精IAAIAA母液（母液（stock solutionstock solutio

21、n）每周制备新鲜备用，容易见光分解（几天内），）每周制备新鲜备用，容易见光分解（几天内），也容易被植株组织在几小时到几天内分解。生长素也容易被植株组织在几小时到几天内分解。生长素110-120110-120 C C稳定保存稳定保存1 1小时，小时，但但IAAIAA可以被低可以被低pHpH、光、氧和过氧化物破坏。、光、氧和过氧化物破坏。NAANAA和和2,4-D2,4-D比比IAAIAA稳定。稳定。CTKCTK母液可以在冰箱中保存几个月，在长时间的实验中，也可能被分解。母液可以在冰箱中保存几个月，在长时间的实验中，也可能被分解。KTKT和和ZTZT在在120120 C C处理处理1 1小时仍能稳

22、定存在，小时仍能稳定存在，BA100BA100 C C时时2020分钟。分钟。在碱性条件下，在碱性条件下，GAGA变成无活性的异构体，在强酸性环境和高温下，变成无活性的异构体，在强酸性环境和高温下，GAGA也变也变成无活性的形式。成无活性的形式。GAGA热不稳定，热不稳定，114114 C C处理处理2020分钟降低其活性达分钟降低其活性达90%90%，母液，母液需制备新鲜的，并且采用过滤灭菌。需制备新鲜的，并且采用过滤灭菌。激素配比模式生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，伤组织、长根还是长芽

23、。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。素与细胞分裂素的比例。高 有利于根的形成和愈伤组织的形成;适中 有利于根芽的分化;低 有利于芽的形成;生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素生长调节物质的使用甚微，一般用生长调节物质的使用甚微，一般用mgL表示浓度。在组织表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.05-5mgL，细胞分

24、裂素，细胞分裂素0.0510mgL。 Growth medium is optimised for regeneration of plantletsNo sucrose (0%)Sucrose reduced to 1%Sucrose increased to 5%The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant. No roots and no call

25、us.Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occuredShoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control mediumtissue culture in the African Violet No BAP BAP reduced to 0.1 mg. l-1 N

26、o NAAPoor shoot development and no roots. Extensive callus generationPoor shoot development and no rootsNAA reduced to 0.1 mg. l-1 More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse development of roots and a reduced numbe

27、r of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explantNo BAP BAP reduced to 0.1 mg. l-1 No NAAPoor shoot development and no roots. Extensive callus generationPoor shoot development and no rootsNAA reduced to 0.1 mg. l-1 More balanced development of roots and shoots. However,

28、undifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant 有机物质有机物质(Vitamins and amino acids)Vit B1Vit B6Vit B3Vit B5肌醇肌醇CHLHMEYE硫胺素硫胺素盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇烟酸烟酸泛酸钙泛酸钙水解酪蛋白水解酪蛋白(c

29、asein hydrolysate)水解乳蛋白水解乳蛋白(lactoalbumin hydrolysate)麦芽提取物麦芽提取物(malt extract)酵母浸出物酵母浸出物(yeast extract)促进细胞对培养基的反应固化剂（固化剂（gelling agent）v琼脂琼脂来于来于seaweedseaweed对植物组织有一定的生理作用对植物组织有一定的生理作用用量一般为用量一般为7-10g/L7-10g/L，即，即0.7-1%0.7-1%（W/VW/V）太大，培养基过硬；太大，培养基过硬；太小，培养基不易凝固太小，培养基不易凝固不同品牌的琼脂对外植体的反应也不一样。不同品牌的琼脂对外植

30、体的反应也不一样。v其它其它gelling agent：Gelrite（脱乙酰吉兰糖胶）：（脱乙酰吉兰糖胶）：透明，透明，Pseudomanas种发酵产物（多糖）种发酵产物（多糖）成分稳定。成分稳定。碳源碳源营养物质营养物质渗透压稳定剂渗透压稳定剂类型类型蔗糖蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、麦芽糖、淀粉等葡萄糖、果糖、山梨醇、麦芽糖、淀粉等浓度浓度2-5%2-5%（W/VW/V）低浓度适合于原生质体培养低浓度适合于原生质体培养高浓度适合于胚和花药培养高浓度适合于胚和花药培养作用作用蔗糖长时间高温处理会发生焦糖化，形成蔗糖长时间高温处理会发生焦糖化，形成 蛋白黑素，抑蛋白黑素，抑制细胞生长制细胞生长

31、pHpH计计培养基的培养基的pH pH值：值：5.56v6：the gel may be too firmv灭菌后灭菌后pH会降低会降低0.6-1.3v培养材料降低培养材料降低pH：产生有机酸，：产生有机酸，N利用利用测定方法测定方法vpH试纸试纸vpH计计pH调整方法调整方法v1N的的HCl和和NaOHv在加入在加入agar前调前调pH培养基的选择和配制培养基的选择和配制选择选择择材料和种类而异择材料和种类而异参考前人的研究参考前人的研究MS培养基最为基本：培养基最为基本：高浓度的高浓度的N、K和和NH4+自己试验自己试验配制配制配母液（配母液（Stock solution)取样取样加成分加

32、成分测测pHok母液的配制母液的配制大量元素大量元素微量元素微量元素v浓缩浓缩1010倍（量加大倍（量加大1010倍）倍）v在配制在配制1L1L培养培养基时，只取培养培养基时，只取100ml100mlv浓缩浓缩100100倍（量加大倍（量加大100100倍）倍）v在配制在配制1L1L培养培养基时，只取培养培养基时，只取10ml10ml以以KNO3为例为例1L培养基需要量为培养基需要量为19g。在配制母液时，增加在配制母液时，增加10倍量，为倍量，为190g。在母液。在母液中的浓度为中的浓度为190g/L，即，即0.19g/ml在配制培养基时，取在配制培养基时，取10ml，10ml0.19g/m

33、l=19g无菌室无菌室培养室和接种室培养室和接种室室内灭菌可用室内灭菌可用2%2%新洁尔敏擦洗新洁尔敏擦洗75%75%乙醇喷雾乙醇喷雾UVUV照射照射2020分钟分钟培养基培养基灭菌方法灭菌方法v高温高压蒸气灭菌高温高压蒸气灭菌v过滤灭菌过滤灭菌121121C C，1.1kg/cm1.1kg/cm2 2,15-20,15-20分钟，时间过长，培养基成分钟，时间过长，培养基成分易变性失效分易变性失效在高温高压下易分解的培养基和激素类在高温高压下易分解的培养基和激素类器皿和接种工具的灭菌器皿和接种工具的灭菌解剖刀、镊子、剪刀等工具采用干热灭菌法，解剖刀、镊子、剪刀等工具采用干热灭菌法，用烘箱灭菌，

34、用烘箱灭菌，120 120 C C时时1 1小时小时外植体的灭菌原则外植体的灭菌原则 充分灭菌，但不能损伤外植体充分灭菌，但不能损伤外植体 不同外植体，灭菌要求不一样不同外植体，灭菌要求不一样常用方法常用方法v75%乙醇乙醇v氯化汞（升汞）氯化汞（升汞）v次氯酸钠次氯酸钠表面杀菌，具湿润和杀菌作用，浸表面杀菌，具湿润和杀菌作用，浸3030秒秒常用浓度常用浓度0.1%0.1%处理处理5-105-10分钟，有残毒分钟，有残毒浓度浓度2-10%2-10%，时间，时间15-3015-30分钟，对植物无害分钟，对植物无害 培养所需环境条件培养所需环境条件 光照强度光照强度：一般而言，愈伤组织的形成并不需

35、要光照； 培养前期1000-4000lx，后期10000 lx。 光照时数光照时数：不同培养的组织其光照时间不同，如烟 草愈伤组织采用1000 lx 16小时/日培养； 而花椰菜组织培养则以4000 lx 9小时/日 光照为宜。 光质光质：一般采用日光灯作为光源。组织培养中关键 的器官形成作用，是种光形态发生现象， 是受光敏色素控制的。 温度温度：一般习惯将培养物置于恒温下，通常应用的温度 为25OC 左右。光光3 通过花药及花粉培养的单倍体育种 单倍体植物在育种上的意义单倍体植物在育种上的意义 概念：凡是具有配子体的染色体数的植物称为单倍体植物。单倍体一倍体，是一个“半倍体”。单倍体在自然界

36、普遍存在，1922年发现了曼陀罗的单倍体植株，但自然发生率很低（0.0020.02%）。 人工诱导单倍体在育种上的用途人工诱导单倍体在育种上的用途 从单倍体的染色体加倍即可获得纯合的二倍体，也可获得纯合的多倍体，育种途径快速。 有利于远缘杂种新类型的培育和稳定。 单倍体植物与诱变育种相结合，可以加速诱变育种的进程。花药及花粉培养工作的进展花药及花粉培养工作的进展 起始于20世纪40年代，最初研究目的是调节和控制从花粉母细胞到成熟花粉的生长发育。大约经过半个世纪的发展，通过花药和花粉培养诱导形成单倍体植物，目前在世界范围内已得到普及，已从170多种植物成功地诱导形成花粉起源植株或愈伤组织，以茄科

37、、十字花科蔬菜作物研究居多。在曼陀罗、番茄、麝香百合、银杏、烟草、矮牵牛等植物上都较早诱导成功单倍体植物。 花药和花粉培养技术花药和花粉培养技术 1.花药培养技术流程图花药培养技术流程图切下花蕾切下花蕾消毒消毒1010分钟分钟 冲洗两次冲洗两次花药接种培养花药接种培养愈伤组织或胚状体愈伤组织或胚状体再生培养再生培养完整植株完整植株 花药和花粉培养技术花药和花粉培养技术花粉培养花粉培养 的花粉分离和培养方法的花粉分离和培养方法机械分离培养法机械分离培养法（包括液体培养基培养法和固体培养基培养法）；2.散落花粉散落花粉（shed pollen）培养法培养法。花药培养和花粉培养之比较花药培养和花粉培

38、养之比较 统计表明，通过花药培养获得单倍体的植物种类或品统计表明，通过花药培养获得单倍体的植物种类或品种较多；设备上要求简单。花粉培养有花药培养不能比拟种较多；设备上要求简单。花粉培养有花药培养不能比拟的优点的优点完全排除了花药组织的干扰，避免花粉与花药完全排除了花药组织的干扰，避免花粉与花药组织的体细胞形成分裂和增殖的竞争，更有利于花粉植株组织的体细胞形成分裂和增殖的竞争，更有利于花粉植株的形成，所诱导形成的胚状体、愈伤组织及植株均来自花的形成，所诱导形成的胚状体、愈伤组织及植株均来自花粉，可省略对其鉴定的程序；在诱导形成单倍体的同时，粉，可省略对其鉴定的程序；在诱导形成单倍体的同时，若结合

39、突变体筛选和进行基因操作研究时，花粉培养更具若结合突变体筛选和进行基因操作研究时，花粉培养更具优势。优势。花药培养技术花药培养技术1964年年Guha&Maheshwari南洋金花花药培养发育成胚；南洋金花花药培养发育成胚；1967年年Bourgin&Nitsch花药培养获得烟草植株；花药培养获得烟草植株；花药培养方法：花药培养方法： 接种了花药的培养基一般在24-27OC，光照为2000lx ，每天14小时培养。大约经过20-30天，即可发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。将愈伤组织转移至分化培养基上培养，便可以进一步分化再生出完整植株来。花药材料的选取花药材料的选取 选材关键在于选取

40、花粉处于合适发育期的花药，离体选材关键在于选取花粉处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雌发育。核期的花药，均有可能诱导离体孤雌发育。 大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期。核期，或单核中晚期。花药培养技术步骤花药培养技术步骤选幼年树花蕾选幼年树花蕾取下花蕾取下花蕾3-5度低温冷处度低温冷处理理3-10天天取花药取花药镜检镜检消毒接消毒接种培养种培养再生再生花粉培养花粉培养 50年代开始裸子植物花粉培养，

41、获得愈伤组织；年代开始裸子植物花粉培养，获得愈伤组织； 50、60年代被子植物花粉培养失败；年代被子植物花粉培养失败； 1974年年Nitsch等次曼陀罗和烟草花粉获得植株等次曼陀罗和烟草花粉获得植株花粉培养的优点花粉培养的优点q 从少量花粉获得大量花粉植株；从少量花粉获得大量花粉植株；q 避免花药壁产生的体细胞愈伤组织干扰，直接观察小孢子避免花药壁产生的体细胞愈伤组织干扰，直接观察小孢子发育过程；发育过程；花粉培养技术步骤花粉培养技术步骤v药壁向花粉提供营养物质；药壁向花粉提供营养物质；v通过药壁吸收、贮存和转化培通过药壁吸收、贮存和转化培养基中的外源物质养基中的外源物质选幼年树花蕾选幼年树

42、花蕾取下花蕾取下花蕾（镜检）（镜检）预培养数天预培养数天取花药取花药接种接种分离分离花粉花粉低温预处理低温预处理消毒消毒过滤离心过滤离心再生再生影响花药（粉）培养的因素影响花药（粉）培养的因素q供体基因型差异和发育差异供体基因型差异和发育差异 甜椒、天竺葵甜椒、天竺葵 旺盛植株，早期花蕾旺盛植株，早期花蕾q花药（花粉）的生理状态花药（花粉）的生理状态q花粉发育期花粉发育期四分体期、小孢子早期、中期和四分体期、小孢子早期、中期和晚期（单核靠边期）晚期（单核靠边期）、有丝分裂期和双核花粉期有丝分裂期和双核花粉期 利用花粉和花药培养于育种时，需足量供选择单倍体植利用花粉和花药培养于育种时，需足量供选

43、择单倍体植株。故如何提高诱导形成率十分重要。培养条件很关键株。故如何提高诱导形成率十分重要。培养条件很关键。q培养前低温预处理培养前低温预处理q培养基与培养方式的影响培养基与培养方式的影响花药、花粉培养前和培养初期的短期高温、低温、离心、花药、花粉培养前和培养初期的短期高温、低温、离心、减压等。减压等。 3-53-5 C3-10C3-10天，提高小孢子反应能力：曼陀罗、天，提高小孢子反应能力：曼陀罗、天仙子、柑桔天仙子、柑桔 花药培养采用最多的培养基为花药培养采用最多的培养基为MSMS。我国科学工作者研制。我国科学工作者研制的的N6N6和马铃薯培养基；和马铃薯培养基； 液体悬浮培养比固体培养基

44、好；液体悬浮培养比固体培养基好； 细胞分裂素有利于花粉胚形成；细胞分裂素有利于花粉胚形成； 早期要求高蔗糖浓度：早期要求高蔗糖浓度：5-10%5-10%再生植株倍性和单倍体植株的保存及其加倍再生植株倍性和单倍体植株的保存及其加倍 在通过花药培养花药培养获得的再生植株中，除单倍体植株外，非单倍体出现的频率与植物种类、再生途径以及培养基的成分有关。一般来说，在通过胚状体途径获得的再生植株中，其单倍体植株占有率较高。但种类不同也存在差异。例如从烟草花药再生植株几乎全部是单倍体植株，而在大白菜和油菜上，单倍体植株则分别占74%和22%。在经过愈伤组织、器官分化途径所获得的再生植株中，倍性变化更为常见。

45、如在水稻的花药培养中，再生植株的倍性变化为x5x。1. 再生植株的倍性再生植株的倍性 随着培养基中植物激素浓度的增加也会降低从中再生植株的单倍体占有率。为什么有此倍性变化？为什么有此倍性变化？单倍体植株当然来自花粉。二倍体或多倍体植株则较复杂，可能是花粉的自然加倍，可能来自花药组织的体细胞及其变异。鉴定方法：观察后代遗传性状是否分离；同工酶分析；分子标记技术等。 花粉培养再生的植株倍性也有变化花粉培养再生的植株倍性也有变化，但由于操作上完全排除了体细胞的干扰，形成二倍体或多倍体均来自花粉的自然加倍。所以，可直接用于育种实际。2. 单倍体植株的保存和加倍 单倍体植株不能正常结实，为了保持所获得的

46、单倍体材料，常用的方法是将无菌苗的茎尖培养在无激素或低浓度激素的培养基上并定期转移。然而，单倍体非最终育种目标，需要染色体加倍。方法有：A.单倍体植株组织培养再生 切取单倍体植株的茎、叶等组织进行培养，可获加倍植株。B.人工处理诱导加倍 常用秋水仙素处理，洗静后转移到新培养基中诱导植株再生。具体方法有培养细胞的处理；试管小苗的处理；顶芽、腋芽处理；花轴处理等。4 组织和器官培养 组织和器官培养是植物离体培养中研究最早和比较广泛的。1904年就有十字花科的萝卜、辣根的胚培养苗问世。茎尖培养近年发展快，观赏植物如兰花、非洲菊和经济作物如甘蔗采用组织培养进行生产性的大量繁殖。果树上利用茎尖和腋芽培养

47、进行砧木的快速繁殖，如苹果矮化砧的1茎尖，8月可繁殖60000株。石刁柏、花椰菜、木立花椰菜等快繁，比传统方法大大提高繁殖系数。 自交不亲和系也可通过组织培养方式大量繁殖，可免蕾期授粉之人工和防止自交衰退。 无性繁殖作物的“无病苗”生产，据此取得重大进展。马铃薯、芋、大蒜、姜、柑橘等茎尖脱毒。 组织培养技术进行种质资源的保存可节省空间，方法简便，繁殖潜力大，避免田间种植的天然杂交，结合低温和超低温的冷冻贮藏，对于保存遗传资源和运输、交换都很方便。组织培养技术的主要阶段组织培养技术的主要阶段 组织和器官培养技术包括实验室设计、建造和设备；培养基的配制；表面灭菌和接种；试管苗出瓶移栽及后期管理。整

48、个过程分三个阶段：1.无菌培养的建立无菌培养的建立 主要考虑选择外植体、培养基和环境条件的性质。2.培养再生植株养再生植株 利用诱导产生愈伤组织和利用茎尖培养诱生不定新梢等途径。3.准备将再生植株移栽入土准备将再生植株移栽入土 包括新梢插条的生根、植株的锻炼和使植株由异样状态变为自养状态。是指植物某一器官的全部或部分或器官原基的培养，包括茎是指植物某一器官的全部或部分或器官原基的培养，包括茎段、茎尖、球茎、叶片、子叶、花序、花瓣、子房、花药、段、茎尖、球茎、叶片、子叶、花序、花瓣、子房、花药、花托、果实、种子等。花托、果实、种子等。此处指形成层组织、分生组织、表皮组织、薄壁组织和各种此处指形成

49、层组织、分生组织、表皮组织、薄壁组织和各种器官器官 组织以及愈伤组织的培养。组织以及愈伤组织的培养。器官培养（器官培养（Organ culture ）组织培养（组织培养（Tissue culture）茎尖培养茎尖培养1、类型、类型q小茎尖：小茎尖：q大茎尖：大茎尖：材料体积小，不带叶原基的培养难，成苗所需时间长，体材料体积小，不带叶原基的培养难，成苗所需时间长，体积大的则易于成功。积大的则易于成功。2、作用、作用无性系快速繁殖；无性系快速繁殖；培养无病毒苗，品种改良；培养无病毒苗，品种改良；理论基础研究理论基础研究10-100 m的茎尖分生组织（脱毒）的茎尖分生组织（脱毒）几十几十mm茎尖或更

50、大的芽（快繁）茎尖或更大的芽（快繁）3、建立无菌材料及培养、建立无菌材料及培养健康植株上选健壮的枝梢健康植株上选健壮的枝梢去叶片用自来水冲洗去叶片用自来水冲洗 再生再生培养培养MS培养基培养基75%酒精酒精1分钟分钟次氯酸钠次氯酸钠5-10分钟分钟0.1%升汞升汞4、茎尖培养的发育方向、茎尖培养的发育方向v腋芽萌发腋芽萌发v脱分化后产生胚状体脱分化后产生胚状体v脱分化后直接产生不定器官脱分化后直接产生不定器官v脱分化后形成愈伤组织脱分化后形成愈伤组织离体繁殖离体繁殖建立悬浮系或分化建立悬浮系或分化胚状体及不定芽胚状体及不定芽影响发育方向的因素影响发育方向的因素q 外植体大小外植体大小q 培养条

51、件培养条件q 培养基生长调节剂种类和浓度培养基生长调节剂种类和浓度微形外植体或分生组织易产生愈伤组织微形外植体或分生组织易产生愈伤组织细胞分裂素和生长素的配比是关键细胞分裂素和生长素的配比是关键技术上的问题技术上的问题 愈伤组织往往经过多次继代以后，其分化器官的能愈伤组织往往经过多次继代以后，其分化器官的能力日衰力日衰,甚至丧失；甚至丧失； 如何使愈伤组织分化的植株保持遗传性的稳定性。如何使愈伤组织分化的植株保持遗传性的稳定性。 污染、褐变与玻璃化污染、褐变与玻璃化真菌污染长孢子真菌污染长孢子真菌污染长孢子真菌污染长孢子污染的情况污染的情况细菌污染长菌落细菌污染长菌落细菌污染长菌落细菌污染长菌

52、落初代培养外植体的褐变初代培养外植体的褐变 外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。所接种外植体的培养。褐褐 化化褐变的主要原因褐变的主要原

53、因植物品种植物品种 在不同品种间的褐变现象不同。多酚氧化酶活性上的差异。在不同品种间的褐变现象不同。多酚氧化酶活性上的差异。因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。生理状态生理状态 由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。一般幼龄期的植物材料褐变程度较浅，成年的植株采收的外植体，不同。一般幼龄期的植物材料褐变程度较浅，成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。幼嫩的组织在接种后褐变程由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。幼嫩的组织

54、在接种后褐变程度并不明显，老熟的组织较为严重。度并不明显，老熟的组织较为严重。培养基成分培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。从而使褐变现象加深。培养条件不当培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。减轻褐

55、变现象发生的方法减轻褐变现象发生的方法选择合适的外植体选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。合适的培养条件合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。使用抗氧化剂使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸、在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸、PVPPVP等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变

56、现象。另外，使用褐变现象。另外，使用0.1%-0.5%0.1%-0.5%的活性炭对防止褐变也的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。有较为明显的效果。连续转移连续转移 对容易褐变的材料可间隔对容易褐变的材料可间隔1224h1224h的培养后，再的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d7-l0d后，褐变后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。现象便会得到控制或大为减轻。 继代培养时材料的玻璃化继代培养时材料的玻璃化实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数大为降低。在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度大为降低。在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异。当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易也有所差异。当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻璃