红景天与葛根水提取物对微粒体LPO模型的影响

1、红景天与葛根水提取物对微粒体 LPO模型的影响作者：李嘉琳，海春旭，梁欣，刘瑞，于洋【关键词】红景天；葛根；抗氧化；脂质过氧化；氧电极Effects of Rhodiola and Pueraria on peroxidative damage model in microsome【Abstract 】AIM: To investigate the antioxidativeaction of the waterextracts of Rhodiola and Pueraria, and the doseeffect relati on ship. METHODSBpragueDawley r

2、ats were killed and then the livers were removed to prepare homoge nate and isolate the microsome by calcium ion precipitation.The water extracts of Rhodiola and Pueraria were extractedby decoct ing. Three lipid peroxidati on models were in duced by Vc/Fe2+,CHP and NADPHADP/Fe2+The 2 different extra

3、cts were added into the 3 models respectively to obtain the final concentrations of 25, , , , mg/mL. Then the contents of malon dialdehyde （MDA） were exam ined for an alyz ing the an tioxidative acti on of extracts in the Vc/Fe2+, CHP stimulated models. Oxygraph electrode was used to determ ine the

4、in hibiti on rate of oxyge n uptake in NADPHADP/Fe2model. RESULTS:n Vc/Fe2+ model, the 2 extracts showed the highest inhibitionrate at the concentration of mg/mL. In theCHP model, the content of MDA in groups with to 25 mg/mL of Pueraria extract decreased significantly（ P） . In NADPHADP/Fe2+ model,

5、thehighest in hibiti on rates of the Rhodiola and Pueraria water extracts reached %and %. CONCLUSION:he 2 water extracts have good antioxidative effects. The Pueraria water extract has a paratively stro nger effect in the models in the presenee of enzymes, conversely, Rhodiola water extract has a st

6、ron ger effect in the models in the abse nee of en zymes.【Keywords rhodiola ； pueraria; antioxidative;lipid peroxidation;electrode oxygraph【摘要】目的：探讨红景天与葛根水提物的抗氧化作用及其剂量反应关系.方法：煎煮法制备红景天和葛根水提物.钙沉淀法提取雄性SD大鼠肝微粒体. 采用三种激发剂Vc/Fe2+,CHP和NADPHADP/Fe2建立微粒体脂质过氧化（LPO 模型，加入不同浓度的红景天、葛根的水提物，观察两种中药的抗氧化作用.在 Vc/Fe2+，CH

7、P模型中通过比色法测定对丙二醛的抑制作用，NADPHADP/Fe模型通过氧电极法测定对耗氧量的抑制作用结果：在Vc/Fe2+模型中，两者在浓度 为mg/mL时有最大抑制率.在CHP莫型中，葛根水提物在25 mg/mL范围内其 MDA含量低于对照组（P）.在NADPHADP/Fe模型中，红景天、葛根水提物的 抑制率分别达到和 .结论：两种中药的水提取物都具有较强的抗氧化作用， 并存在一定的剂量效应关系其中葛根水提物对酶参与性反应的抑制作用强于 红景天水提物，而在非酶参与性反应中，红景天水提物的作用更强研究结果为 两种中药在自由基损伤保护作用的机制提供了实验依据【关键词】 红景天；葛根；抗氧化；脂

8、质过氧化；氧电极0引言随着自由基医学的不断发展，人们逐渐意识到自由基在人类多种疾病的发 生发展过程中扮演着重要的角色与此同时，寻找有效、无毒副作用的自由基清 除剂也成为人们关注的问题其中具有生物学活性的自由基清除剂筛选模型， 包 括Vc/Fe2+,过氧基异丙苯（CHP和四氯化碳（CC14）的刺激模型被成功应用， 尤其是在中药提取物的抗氧化活性的测定中发挥了重要作用.本实验提取了红景天、葛根的水提物，应用多种微粒体抗氧化剂筛选模型研究两种提取物的抗氧 化剂量反应关系.1材料和方法材料二级雄性SD大鼠20只，体质量180200 g，第四军医大学实验动物中心提供.硫代巴比妥酸（thiobarbitu

9、ric acid,TBA ），CHP,NADPH,AD均为 Sigma产品；MDA标准品为 Merck产品；考马 斯亮蓝，牛血清白蛋白为华美试剂公司产品；其他化学试剂均为AR试剂；3K30型台式高速冷冻离心机（Sigma） ； CY2型测氧仪及氧电极（上海新华仪器厂）；501 型超级恒温器（重庆实验设备厂）；722型光栅分光光度计（山东高密分析仪器厂） 台式自动平衡记录仪（上海大华仪表厂）.大花红景天、葛根一级品，各 500 g， 购于西安万寿路药材市场.方法微粒体及提取物的制备钙沉淀法制备大鼠肝脏微粒体1.采用煎煮法制备红景天、葛根水提物2.取中药材，加入8倍重量的水煎煮h后，过滤， 药渣再

10、经5倍重量水煎煮1 h,得水提液.得到水提液趁热过滤，过滤液继续加 热，蒸发掉水分得到水提稠膏经 80C烘干，备用，检测水分小于 5%.置于干燥 器内保存.微粒体Vc/Fe2+脂质过氧化激发模型采用本科室的常规方法.反应体系中的基本缓冲液为Tris / HCI （ mol/L , pH=）与KCI （ mol/L ）按1 ：2比例混合配 制.700 mL/L乙醇溶解红景天提取干粉，制成5个剂量组，浓度为25, , , mg/mL. 每组3个平行样.同时，设空白对照及阳性对照（用蒸馏水替代红景天提取物， 阳性对照设3个平行样）.反应体系中含缓冲液 mL，50卩mol/L FeS04 mL，5 m

11、mol/L抗坏血酸mL,微粒体悬液和不同浓度的提取物各 mL, 37C水浴15 min, 100 g/L三氯醋酸 mL终止反应，3000 r /min离心10 min，取上清2 mL加入2 mL g/L TBA , 100C水浴15 min，流水冷却，以空白对照调“零”，E535 nm比色，读取OD值.同时用不同浓度的MDA标准品作标准曲线，拟合标准直线方 程，由此计算各组的MDA含量.微粒体CHPB旨质过氧化激发模型缓冲液的配制、分组及步骤同 反应体系中含缓冲液1 mL, 1 mmol/L CHP mL，微粒体悬液mL和不同剂量的提取物 mL.微粒体NADPHADP/Fe体系中耗氧量氧电极法

12、的测定参考文献3-4 ，采 用CY2型测氧仪及氧电极连接台式自动平衡记录仪，自制 3 mL反应池，循环水 温度37E，磁力搅拌速度恒定在 60 r/min，灵敏度1/8.反应体系：NADPH: 卩 mol/L ； ADP:卩 mol/L ； Fe2+:卩 mol/L ;微粒体 mg protein/mL （以上浓 度均为终浓度），用基本缓冲液补足3 mL.设3个剂量组，每组设3个平行样.耗氧量及抑制率的计算5 MDA生成抑制率（） = （阳性对照 MDA样品 MDA /阳性对照MD从100;耗氧量（卩mol/g ? min）= 241（卩mol/L） X斜率 （mm/mi n）/扩展（mmx蛋

13、白浓度（g/L ）；耗氧抑制率（） = （阳性对照耗氧 量-样品耗氧量）/阳性对照耗氧量X 100.统计学处理：所有数据用xs表示，数据处理采用SPSS统计分析软件进 行，浓度与抑制率之间的关系采用线性回归分析.多组间比较采用KruskalWallis H 检验，两两比较采用 Wilcoxon秩和检验.P认为有统计学差 异.2结果/Fe2+激发的LPO模型与阳性对照组相比，红景天、葛根提取物各给药浓度 下MDA含量显著降低（P）,分别在和mg/mL浓度下有最大抑制率.红景天组在 各个给药浓度下其MD/抑制率均显著高于葛根组（P，表1）.表1红景天、葛根提取物对 Vc/Fe2+, CHP NAD

14、PHADP/Fe激发的LPO模型的 影响（略）aPv, bP vs阳性对照；cPv,dP红景天vs葛根.激发的LPO模型与阳性对照组相比，红景天、葛根提取物各给药浓度下 MDA 含量显著降低（P）,葛根组（P）,分别在和25 mg/mL浓度下有最大抑制率.红 景天组在两个较低给药浓度下其 MD/抑制率显著高于葛根组（P）,而其他三个浓度下均显著低于葛根组（P）.其各给药浓度与抑制率之间的决定系数R2分别为和（表1）./Fe2+激发的LPO模型在,25 mg/mL三个给药浓度下两种提取物对 NADPHADP/Fe激发的LPO模型的耗氧量抑制率均显著低于对照组.红景天组在 两个较低给药浓度下其耗氧

15、量抑制率显著低于葛根组（P）.其各给药浓度与抑制率之间的决定系数R2分别为和（表1）.3讨论红景天（Rhodiola）和葛根（Puerariaa ）是两种富含黄酮类5和异黄酮 类的中草药.它们作为抗氧化剂应用在多种疾病的治疗与预防中6-7.目前 的研究多为针对两者的活性成分单体如红景天苷、百脉根苷8和葛根素9进行抗氧化作用研究.但是，由于自由基反应具有链式的特性，而使单一的抗氧 化剂在体内体外实验中都无法达到预期的效果.另外，筛选和测定抗氧化活性也 受到试验模型的限制.整体实验不能说明具体机制，化学反应又不代表生物体系 的实际情况，本研究采用微粒体脂质过氧化模型，不仅能观察到被测物质在生物体内

16、的反应性，量效关系，而且还能知道具体的反应机制.因 此具有明显的优点.本实验主要针对红景天和葛根水提物在体外微粒体脂质过 氧化模型中的反应性，测定抗氧化作用的活性强度，以及剂量效应关系，为进一 步探讨其药理作用及联合应用提供实验与理论依据.微粒体是细胞内质的碎片，含有混合功能氧化酶系统包括细胞色素氧化酶 P450（CYP450,黄嘌呤氧化酶等多种同功酶，参与内源性和外源性化合物代谢.生物体在需氧代谢过程中的氧化还原反应伴有超氧阴离子自由基、羟自由基等生成，可以引发生物膜多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应从而导致一些疾病（衰老、心血管病、炎症、肿瘤等）的发生，因而研究中药有效成分的抗氧化作用对 预

17、防、治疗这些疾病可能发挥重要作用.本研究采用的三种微粒体LPO模型分别代表了不同的激发体系，Vc/Fe2+， CHP激发体系代表非酶参与性反应，其中 Vc/Fe2+代表无机物激发剂，CHP弋表 有机物激发剂；NADPHADPFe2+代表酶参与性反应，此体系中包括黄嘌呤氧化酶， NADP脱氢酶等酶促反应.维生素C与二价金属离子，通过Fenton反应，生成 超氧阴离子自由基和羟自由基.脂质过氧化反应的结果是自由基攻击多不饱和脂肪酸（polyu nsaturated fatty acids, PUFA ）裂解生成MDA等终产物，同时伴随氧的消耗.因此测定脂质过氧化终产物MDA或耗氧量的变化能较好地反

18、映脂质过氧化的水平结果表明，红景天和葛根水提物对三种LPO模型都有一定的抑制作用两种提取物虽然对非酶与酶参与性反应均有较强作用，但是作用机制并不相同与葛根提取物相比，红景天能更好的清除超氧阴离子自由基和羟自由基但是在 CHP莫型中，虽然两者的最高抑制率接近，但是葛根有较好的剂量反应关 系. 但是，葛根对耗氧量的抑制作用要强于红景天，表明葛根对NADP参与的酶参与性反应有较强的作用，NADPH!微粒体LPO链式反应的必需环节10: NADPHFP CytP45X Fe2i FH LPO的启动环节，推断葛根水提物的抗氧化作 用机制在于抑制了 NADP氧化酶的活性.实验结果表明，红景天和葛根都是有效

19、 的抗氧化剂，联合应用于抗自由基损伤疾病中，可能会有好的疗效实验再一次 证明应用微粒体脂质过氧化模型是筛选抗氧化剂的可靠的技术平台.【参考文献】1 Kim HJ, Cha ng EJ, Cho SH,et al. An tioxidative activity ofresveratrol and its derivatives isolated from seeds of Pae onia lactifloraJ . Biosci Biotechnol Biochem, 20XX,66(9): 1990-1993.2李仪奎,王钦茂，周金黄，等.中药药理实验方法学M .上海：上 海科学技术出版社

20、，1991 : 36.3张文清，海春旭，龚书明.锌对大鼠肝微粒体脂质过氧化模型抗氧 化作用的实验研究J .解放军预防医学杂志，1998，16 (4): 250-254.4海春旭，张文清.微粒体NADPHADP/Fe体系中耗氧量氧电极法的测 定及铁、铜、锌对耗氧量的影响J.第四军医大学学报，1992,13 (3): 194-196.5Akgul Y, Ferreira D, Abourashed EA,et al. Lotaustralin fromRhodiola rosea roots J .Fitoterapia,20XX,75(6):612-614.6 Xu ME,Xiao SZ, SunYH, et al. The study of antimetabolic syndrome effect of Puerarian in vitroJ . Life Sci, 20XX,4(25):3183-3196.7Bo J, Mi ng BY, Gan gLZ, et al. Protectio n by Pueraria n ag