新基因功能研究的策略与方法

1、新基因功能研究的策略与方法目 录 生物信息学预测 研究基因的时空表达模式 细胞及动物水平验证生物信息学预测 序列相似性分析 DNA序列的开放阅读框查找 蛋白质理化性质分析相似性(similarity)：是指一种很直接的数量关系同源性(homology)：指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白质序列具而共同祖先的结论，属于质的判断序列间的相似性越高，是同源序列可能性就更高序列相似性分析核苷酸序列相似性分析BLASTn 用查询序列逐一搜索核酸数据库中的序列氨基酸序列相似性分析BLASTx 核酸序列翻译成蛋白质之后逐一搜索蛋白质数据库中的序列序列决定结构，结构决定功能http:/www.ncbi.nl

2、/BLASTScore：使用打分矩阵对匹配的片段进行打分，这是对各对氨基酸残基（或碱基）打分求和的结果，一般来说，匹配片段越长、 相似性越高则Score值越大。E value:随机匹配的可能性Identities:匹配上的碱基数占查询到的序列长度的百分比1112DNA序列的开放阅读框查找预测其编码蛋白质的氨基酸序列/orffinder/ 限制性核酸内切酶切位点 外显子、内含子剪切位点分析蛋白质的理化性质分析/protparam 氨基酸组成、分子质量、预测等电点、疏水性、亲水性、极性、电荷分布等基

3、本理化特性疏水性分析ExPASy的ProtScale程序/cgi-bin/protscale.pl蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等为疏水性氨基酸，对蛋白质的三级结构有重要影响可用来计算蛋白质的疏水性图谱 蛋白跨膜结构分析 www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 信号肽预测与识别 www.cbs.dtu.dk/services/signalP 蛋白质卷曲螺旋预测 /software/COLIS_form.html 磷酸化位点预测与识别 研究基因的时空表达模式基因表达的时空

4、性是指基因的表达在个体发育的不同阶段以及在个体的不同组织和细胞类型中均不相同，是有机体发育、分化、衰老等生命现象的分子基础。基因表达的时空性特征为基因功能的研究提供了重要的信息：如果基因在某一特定的正常组织细胞中的表达水平较高，则往往表示其在维持正常生理状态中发挥着重要的作用；而如果基因在相应的病态组织细胞中表达异常，则提示其可能与该病理过程的发生、发展有关。研究基因的时空表达模式 mRNA水平的表达谱分析 蛋白水平的表达谱分析mRNA水平的表达谱分析 Northern Blotting 原位杂交 RT-PCR cDNA微阵列蛋白水平的表达谱分析 Western Bloting 免疫组化技术

5、双向凝胶电泳 生物质谱技术细胞及动物水平验证 基因过表达细胞模型 基因沉默细胞模型基因过表达细胞模型定义：通过载体将目的基因转入某一特定细胞中，使其过表达，观察该细胞生物学行为的变化，从而了解该基因的功能。应用：1）化学法 细胞感染 2）物理法 电穿孔法，效率高 3）生物法 应用病毒基因载体进行转基因，复制产生病毒蛋白导致机体免疫反应，从而影响目的基因表达。拟南芥中鉴定到一个F-box蛋白AtPP2-B11，在延长盐处理时间时，其转录水平和蛋白水平均出现显著诱导表达。过表达AtPP2-B11的转基因拟南芥表现出明显的高盐耐受性，而相应的RNA干扰株比野生株对盐胁迫更敏感。iTRAQ定量分析显示

6、，在盐胁迫下有4311个差异表达蛋白受到AtPP2-B11调控。基因沉默细胞模型 原理：采用反义核酸分子抑制、封闭或破坏靶基因组 反义寡核苷酸、核酶及RNA干扰基因沉默在人细胞作用模式 第一种为RNA-RNA 模型其主要特征是RNA 引导链与RNAPII 合成的低拷贝转录子结合, 从而导致沉默。 第二种为RNA-DNA 模型其主要特征是在转录过程中, RNA 引导链与靶标的一条DNA 形成二聚体, 从而导致沉默。反义技术原理：指通过碱基互补配对原理，利用人工或生物合成的特异互补性DNA或RNA片段（或其修饰产物），干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA剪接加工与输出、翻译等各个环节，抑制或封闭靶

7、基因的表达，从而调节细胞的生长分化等。分类：反义寡核苷酸技术（ASON） 核酶技术 小干扰RNAASON技术（反义寡核苷酸技术）是指人工合成能与DNA或RNA互补结合的特异性寡核苷酸链，使其专一性地抑制基因表达，以达到调控表达基因的目的。ASON一般设计在编码区或3非编码区，长度以1520nt较为合适。ASON包括反义DNA和反义RNA。RNAi技术 通过人为地引入与靶基因具有同源序列的dsRNA，诱导靶基因的mRNA降解，从而达到阻止基因表达、产生“功能失活”的目的。 优势（与ASON比较）：操作简单、投入少、周期短；用于研究特定基因在特定组织细胞的特定发育阶段中的功能。细胞内表达的长dsRNA或外源性长dsRNA在Dicer酶的作用下降解成小RNA；小RNA的双链解开，其中一条链被优先装载入RNA诱导沉默复合物（RISC）中； 装载了小RNA