医学教学课件：分子生物学研究法（上）-----DNA、RNA及蛋白质操作技术

1、分子生物学分子生物学研究法（上）研究法（上）-DNA、RNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术基本概念： 基因工程： 指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达。5.1 重组DNA技术回顾重组重组DNA技术发展史上的重大事件：技术发展史上的重大事件：1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；2. 50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；3. 50年代末至60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说,成功地破译了

2、遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。重组重组DNA技术史上主要事件技术史上主要事件 1869 F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。 1944 O.T. Avery证实DNA是遗传物质。 1952 A.D. Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。 1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。 1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。 1958 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留复制模型。 1959-

3、1960 S. Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。 1961Nirenberg破译了第一相遗传密码；F. Jacob和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。1964 C. Yanofsky和S. Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。 1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由“质粒”DNA所决定。 1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。 197

4、0H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。重组重组DNA技术史上主要事件技术史上主要事件 1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。 1975-1977 F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。 1977年完成了全长5387bp的噬菌体174基因组测定。 1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。 1980

5、美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。 1981R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。重组重组DNA技术史上主要事件技术史上主要事件 1982美、英批准使用第一例基因工程药物-胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。 1983 获得第一例转基因植物。 1984 斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。 1986 GMO首次在环境中释放。 1988 J. D. Watson出任“人类基因组计划”首席科学家。 1989DuPont公司获得转肿瘤基因小氧-“Onco

6、mouse”。 1992 欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb)重组重组DNA技术史上主要事件技术史上主要事件 1994第一批基因工程西红柿在美国上市。 1996完成了酵母基因组(1.25107bp)全序列测定。 1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。重组重组DNA技术史上主要事件技术史上主要事件1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选

7、出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。基因工程的主要内容或步骤基因工程的主要内容或步骤: :限制限制- -修饰体系修饰体系由限制性内切核酸酶与甲基化酶组成由限制性内切核酸酶与甲基化酶组成 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 EcoRI 5-GAATT C-3 3-C TTAA G-5 PstI 5-C TGCA G-3 3-G ACGT C-5 HpaI 5-GTT AAC-3 3-CAA TTG-5 amprterroriEcoR IpBR322质粒质粒DNAD

8、NA病毒病毒DNADNA载体载体噬菌体噬菌体DNADNAYACYAC（酵母（酵母人工染色体）人工染色体）自我复制自我复制克隆位点克隆位点选择标志选择标志DNA基本操作技术基本操作技术 将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极正极移动。1 1核酸的凝胶电泳核酸的凝

9、胶电泳(Agarose &Polyacrylamide)(Agarose &Polyacrylamide) 在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）-ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。Genome DNATotal RNA2.细菌细菌转化与目标转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖 细菌转化常用方法： CaCl2 法和电击法Ca 2诱导大肠杆菌转化法诱导大肠杆菌转化法 培养生命活动旺盛的菌体 菌种分纯活化，扩大培养，处于对数生长后期 沉淀菌体 冰水浴中预冷10分钟，4离心 化合物处理 含CaCl2 无菌预冷缓冲液处理

10、DNA分子转化感受态细胞CaClCaCl2 2 的诱导原因：的诱导原因： 在0的CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀， Ca 2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中部分核酸酶解离，诱导形成感受态。 Ca 2 能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；42 热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙。电穿孔电穿孔转化法转化法 基本原理： 利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，促进外源DNA的有效吸收。影响因素：电场强度，电脉冲时间，外源DNA浓度 菌体制备 冷却，离心，洗涤（降低离子强度） 10甘油

11、重悬细胞，-70 贮存 低温下（04 ）进行电穿孔转化MCSX-gal + IPTG蓝白斑蓝白斑3. 聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术 在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组因组DNA序列进行的体外扩增反应。序列进行的体外扩增反应。PCR仪仪PCRPCR技术原理技术原理类似于类似于DNADNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。端互补的寡核苷酸引物。模板模板DNADNA变性：变性：加热至加热至9494左右，双链左右，双链DNADNA解离成单链；解离成单链；模板模板DNADNA与引物的退火与引

12、物的退火( (复性复性) )：5555左右，引物与模板左右，引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；引物的延伸：引物的延伸：在在Taq DNATaq DNA聚合酶作用下，以聚合酶作用下，以dNTPdNTP为原料，为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双链；条新的双链；重复循环变性重复循环变性-退火退火-延伸三过程，使延伸三过程，使DNADNA扩增量呈指数扩增量呈指数上升。上升。 PCR productPCR product示例电泳结果示例电泳结果 1 2 3 4 5 MM：DNA marker

13、1：为阳性对照：为阳性对照2：为阴性对照：为阴性对照3-5：为扩增出的：为扩增出的DNA条带条带 引物引物 （primerprimer） 酶酶 （Taq DNA polymeraseTaq DNA polymerase） dNTP dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTPdATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板模板 （templatetemplate） MgMg2+ 2+ （magnesiummagnesium）反应五要素：反应五要素： 引物设计的原则引物设计的原则引物长度：15-30个碱基，常为20个碱基左右引物扩增跨度：以500bp为宜，特定条件下可扩增10kb的片段引物碱

14、基：G+C含量以40-60%为宜, ATGC最好随机分布避免引物内或引物间出现二级结构，避免两引物间互补，特别是 3端引物 3端的碱基要求严格配对，特别是最末及倒数第二个碱基引物中可以加上合适的酶切位点，要作酶切时加引物的特异性，引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 酶及其浓度酶及其浓度TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶注：无注：无33 5 5方向的校正活性方向的校正活性DNADNA复制复制1/101/109 9；PCR PCR 出错率出错率1/(21/(210104 4) 一个典型的一个典型的 PCR PCR 反应约需酶量反应约需酶量 2.5 U2.5 U 浓度过高可引起非特异

15、性扩增，浓度过低则浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少合成产物量减少dNTPdNTP 的质量与浓度的质量与浓度 dNTPdNTP使用注意：使用注意：1)1)保存：使用时应配成高浓度，小量分装，保存：使用时应配成高浓度，小量分装，- -2020冰冻保存。多次冻融会使冰冻保存。多次冻融会使dNTPdNTP降解；降解；2)2)使用量：在使用量：在PCRPCR反应中，反应中，dNTPdNTP应为应为20-200umol/L20-200umol/L。3)3)成分配比：注意成分配比：注意4 4种种dNTPdNTP的浓度要相等；的浓度要相等；模板（模板（templatetemplate） 模

16、板核酸的量与纯化程度，是模板核酸的量与纯化程度，是PCRPCR成败成败的关键环节之一。的关键环节之一。 Mg2+Mg2+浓度浓度1)Mg1)Mg2+2+对扩增特异性和产量有显著影响对扩增特异性和产量有显著影响: : MgMg2+2+浓度过高，反应特异性降低；浓度过低会降低浓度过高，反应特异性降低；浓度过低会降低 Taq DNADNA聚合酶活性，使反应产物减少。聚合酶活性，使反应产物减少。2)2)在一般的在一般的PCRPCR反应中，各种反应中，各种dNTPdNTP浓度为浓度为200mol/L200mol/L时，时，MgMg2+2+浓度为浓度为1.51.52.0 2.0 mmolmmol/L/L为

17、宜；为宜；热循环条件的选择热循环条件的选择 PCR反应条件反应条件:温度温度时间时间循环次数循环次数温度与时间的设置温度与时间的设置 设置变性设置变性- -退火退火- -延伸三个温度点：延伸三个温度点： 标准反应中采用三温度点法：标准反应中采用三温度点法： 1 1）93-9593-95变性；变性； 2 2）40-6040-60退火；退火； 3 3）70-7570-75延伸延伸 对于较短靶基因（长度为对于较短靶基因（长度为100100300bp300bp时）可时）可采用二温度点法，采用二温度点法， 一般采用一般采用9494变性，变性，6565左右退火与延伸左右退火与延伸 变性变性温度与时间：温度

18、与时间： 变性温度低，解链不完全是导致变性温度低，解链不完全是导致PCRPCR失败的最失败的最主要原因主要原因 一般一般939394 l min94 l min足以使模板足以使模板DNADNA变性变性 若低于若低于9393则需延长时间则需延长时间 但温度不能过高，高温环境对酶的活性有但温度不能过高，高温环境对酶的活性有影响。影响。退火退火( (复性复性) )温度与时间：温度与时间： 退火温度是影响退火温度是影响PCRPCR特异性的较重要因素特异性的较重要因素 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有模板的及其浓度，还有模板的长度当引物长

19、度为长度当引物长度为15-2015-20个碱基时，在高离子强度中反应（如个碱基时，在高离子强度中反应（如1M 1M NaClNaCl） Tm = 4Tm = 4（G+CG+C）2 2（A+TA+T） 复性温度复性温度=Tm=Tm值值 - -（5 51010）一般一般3060 sec，足以使引物与模板间完全结，足以使引物与模板间完全结合合延伸延伸温度与时间：温度与时间：温度：温度： 一般一般70707575，常用温度为常用温度为7272。时间：时间： 根据待扩增片段长度而定根据待扩增片段长度而定, ,1Kb1Kb以内的以内的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min1min。 特异性强特异

20、性强反应特点：反应特点：灵敏度高灵敏度高简便、快速简便、快速 对模板的纯度要求低对模板的纯度要求低常见问题与对策常见问题与对策 无扩增产物1. 模板:含有抑制物，含量低2. Buffer对样品不合适3. 引物设计不当或者发生降解4. 退火温度太高，延伸时间太短 现象现象：正对照有条带，而样品则无正对照有条带，而样品则无 非特异性扩增PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致；或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。1. 引物特异性差, 2. 模板或引物浓度过高3. 酶量过多4. Mg2+浓度偏高5. 退火温度偏低6. 循环次数过多 拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态 M 1 21. 模板

21、不纯或降解2. Buffer不合适3. 退火温度偏低4. 酶量过多5. dNTP、Mg2+浓度偏高6. 循环次数过多 假阳性假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况（筛选转基因、检测基因表达情况) )原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物1. 操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2. 除不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。3. 各种试剂先进行分装，低温贮存。4. 4. 实时定量实时定量PCRPCR 由于PCR技术具有极高的敏感性，扩增产物总量的变异系数常常达到10%-30%。 2

22、0世纪90年代末期出现了实时定量PCR技术，利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中的扩增DNA的积累素来绘制动态变化图，从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数的问题。 实时定量PCR反应在带透明盖的塑料小管中进行，激发光可以直接透过管盖，使其中的荧光探针被激发。 荧光探针事先被混合在PCR反应液中，只有与DNA结合后，才能够被激发出荧光。随着新合成目的DNA片段的增加，结合到DNA上的荧光探针，即被激发产生的荧光相应增加。4. 实时定量实时定量PCR例如：荧光染料例如：荧光染料SYBR GreenSYBR Green仅能与双链仅能与双链DNADNA结合，被激发结合，被激发出绿色荧光，

23、其荧光强度反映出绿色荧光，其荧光强度反映PCRPCR产物的产量。产物的产量。SYBR GreenSYBR Green做探针的实时定量做探针的实时定量PCRPCR实验实验SYBR GreenSYBR Green做探针的实时定量做探针的实时定量PCRPCR实验实验5. 5. 基因组基因组DNADNA文库的构建文库的构建 把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。 汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆，这样的克隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。基因组文库的用途： 分离特定的基因片段； 分析特定基因结构； 研究基因表达调控； 用于全基因无理图谱的构建和全基因组序

24、列测定等。 建立基因组文库的一般程序建立基因组文库的一般程序1 1载体载体DNADNA片段的制备片段的制备 DNA分离纯化 限制酶切 脱磷酸化反应2 2供体供体DNADNA片段的制备片段的制备总DNA分离纯化 机械剪切法 分离特定大小DNA片段 酶法 部分酶切 分离特定大小DNA片段 完全酶切 3. 供体与载体供体与载体DNA连接连接 要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓度和两种DNA分子的克分子比率。 4. 重组重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增分子的转移和基因组文库的扩增 利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能发生

25、变化） 5. 基因组文库质量的评价基因组文库质量的评价 1）文库规模-随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。 2）重组频率-频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。克隆载体：均用与基因组文库的构建 噬菌体载体 克隆能力15-20kb 柯斯质粒 45kb 细菌人工染色体（BCA） 70-1000kb P1源人工染色体（PAC） 70-1000kb 酵母人工染色体（YAC） 70-1000kb优点：可以插入大片段的DNA基因文库B a m H IM b o IO HPO HH O脱 磷 酸 化重 组 D N AT 4 连 接 酶转

26、 化 E . c o l i基 因 组 文 库总 D N AH i n d I I IB a m H IS a l IE c o R IP s t IS c a IT cA m pRRp B R 3 2 2( 4 . 3 6 k b )O r iH i n d I I IE c o R IP s t IS c a IA m pRO r iS a l I利用质粒载体构建基因组文库利用质粒载体构建基因组文库RNA基本操作技术基本操作技术总总RNA的提取的提取Total RNA 1. 制备制备RNA的关键的关键防止内外源防止内外源RNase的作用的作用 1) RNase的特点：抗酸抗碱的特点：抗酸抗

27、碱,具很广具很广pH作用范围作用范围; 抗高温严寒抗高温严寒(065均具均具活性）；抗变性剂活性）；抗变性剂 2) 解决办法：外源解决办法：外源RNase低温，焦磷酸二乙酯低温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处理处理 所有溶液所有溶液（TrisHCl除外）和器皿，操作者带手套除外）和器皿，操作者带手套 内源内源RNase高温抽提，强蛋白质变性剂，高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，抑制剂，蛋白酶蛋白酶K等等 2. 总总RNA的制备的制备 根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法：根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法： 1）热苯酚抽提法）热苯酚抽提法 2）胍盐法：异硫氰

28、酸胍和硫氰酸胍）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍 3）LiCl/尿素法尿素法 实验室常用方法：异硫氰酸胍实验室常用方法：异硫氰酸胍-苯酚抽提法苯酚抽提法 Trizol试剂是使用最广泛的抽提RNA专用试剂，主要有苯酚和异硫氰酸胍组成。 Trizol试剂可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并是核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整。使用Trizol试剂提取RNA具体实验过程材料处理材料处理液氮研磨，匀浆，加Trizol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分氯仿抽提，离心，分离水相和有机相氯仿抽提，离心，分离水相和有机相收集水相收集水相异丙醇沉淀，得到比较纯的异丙醇沉淀，得

29、到比较纯的RNARNA的浓度和纯度可以通过测定其OD和OD 来判断260280 OD 为1时， 相当于浓度为40g/mL OD /OD 如果在1.8-2.0，表示所提取的RNA纯度较好 OD /OD 低于1.8，样品中则混有蛋白质或酚污染 260260260280280mRNA的纯化 真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有 实验中常用寡聚（dT）-纤维素柱色谱法获得高纯度mRNA。5端帽子结构m G3端polyA尾巴7 寡聚（dT）-纤维素柱色谱法获得高纯度mRNA 当RNA流经寡聚（dT）-纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性结合在柱子上， 再用低盐溶液会蒸馏水洗脱mRN

30、A。 经过两次寡聚（dT）-纤维素柱后可得到较高纯度的mRNA.cDNA的合成 主要包括第一链和第二链cDNA的合成。 第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录成cDNA，由反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用的引物是oligo dT。 oligo dT引物一般包含12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后面加一个连接引物（通常是Xho等酶切位点）以便于克隆构建.cDNA的合成的合成4、cDNA文库的构建 cDNA文库的特点文库的特点 1. 基因特异性基因特异性 常来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗常来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的

31、基因的遗传信息：传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：15% mRNA，8085% rRNA，1015% tRNA 2. 器官特异性器官特异性 不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所所组建的组建的cDNA文库也就不同文库也就不同4. 不均匀性不均匀性 在同一个在同一个cDNA文库中，不同类型的文库中，不同类型的cDNA分子的数分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库

32、中的单拷贝基因均具有相同的来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。克隆数相较，这是两种文库的另一差别。 5. 各各cDNA均可获得表达均可获得表达（一般选用的载体都是表达（一般选用的载体都是表达型的）型的）3. 代谢或发育特异性代谢或发育特异性 处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同亦不相同 建立建立cDNA文库的一般程序文库的一般程序 1. 载体载体DNA片段的制备片段的制备 2. 多聚（多聚（A）RNA的分离与纯化的分离与纯化 3. 双链双链cDNA 的合成的合成 1）单链）单链cDNA 的

33、合成：反转录法的合成：反转录法 2）第二条）第二条cDNA 的合成：碱解或酶解的合成：碱解或酶解（RNaseH）法除去）法除去RNA分子分子 2）同聚物加尾：可大大减少载体）同聚物加尾：可大大减少载体DNA自身连接自身连接 3） cDNA的定向插入的定向插入5. 重组重组cDNA分子的转移和文库的建立分子的转移和文库的建立 选用载体为质粒，可直接转化选用载体为质粒，可直接转化E.coli；若为；若为载载 体体，则需进行体外包装、感染等。，则需进行体外包装、感染等。4. ds- cDNA与载体与载体DNA 相连相连 1）人工接头：要求具平端）人工接头：要求具平端ds- cDNA，酶切时，酶切时可

34、能导致某些可能导致某些cDNA链断裂链断裂与 载 体 相 连12人 工 接 头 I I人 工 接 头 IR E IR E I I与 载 体 相 连3重 组 c D N A 甲 基 化 酶T d T d C T PR E文库构建文库构建d s - D N A 合 成 与 S a l I 匹 配接 头 相 连N o t I 酶 切1 ) S a l I / N o t I 2 ) T 4 D N A l i g a s e N o t I p r i m e r / a d a p t o rc D N A 重 组 子载 体S a l I a d a p t o rcDNA的定向插入的定向插入 5

35、、基因文库的筛选 基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。 筛选的方法： 核酸杂交法 PCR筛选法 免疫筛选法核酸杂交法 以其适应性和快速性成为基因文库筛选中最常用的一种方法。 用放射性的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂交筛选。基本原理： 具有一定同源性的两条核酸单链在适宜的温度及离子强度下，按照碱基配对原则高度特异复性，形成双链。基本过程： 待测核酸变性后，转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上（核酸印迹转移）；然后用标记探针与之杂交。核酸杂交探针核酸杂交探针杂交探针是指具有一定序列的核甘酸片断，它能与互补的核甘酸序列复性杂交，且通过适当的标记来进行检

36、测 同源或部分同源探针 总cDNA探针 特异性cDNA探针 人工合成的寡核甘酸探针探针标记探针标记 放射性标记放射性标记 32P，3H，35S，14C，125I 等等 非放射性标记非放射性标记 地高辛，生物素，地高辛，生物素，荧光素等荧光素等 用于标记用于标记dUTP培养基上的菌落将硝酸纤维素膜覆盖于菌落上移出硝酸纤维素膜裂解、中和以去除细菌蛋白DNA印迹用 P标记的探针杂交32放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板PCR筛选法 PCR筛选法与核酸杂交筛选法具有同样的通用性，而且操作简单，但前提是已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。 要从一个基因组DNA文库中筛选目的基因，首先将整个文库保存在

37、多空培养板上，用设计好的目的基因探针对每个孔进行PCR筛选，鉴定阳性的孔， 把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔板中进行PCR筛选。 重复以上程序，直到鉴定出与目的基因相应的单个克隆为止。多孔培养板移液枪加样，单孔PCR筛选阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔中，进行PCR筛选得到单个克隆免疫筛选法 该方法是基于抗原抗体特异性结合原理，所以该法适用于表达文库的筛选。 如果实验中靶基因的序列完全未知但是有针对该基因产物的特异性抗体，就可以用免疫筛选法进行筛选。滤膜（固定抗体）+125I-IgG抗原Broome 和 Gilbert抗原抗原-抗体复合物SNP的理论与应用的理论与应用DNA DNA 多多 态

38、态 性性 基因组基因组DNADNA中中, ,由不同碱基结构的由不同碱基结构的等位基因等位基因所形成的多态性所形成的多态性产生机制产生机制点 突 变-序列多态性 插入或缺失-长度多态性存在部位存在部位编 码 区 非编码区DNADNA遗传标记遗传标记 是特定的碱基序列 遵循孟德尔遗传规律遗传 具有终身不变的遗传特征 SNP 指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A,T,C,G）的突变而引起的多态性。染色体DNA同一位置上的每一个碱基类型叫做一个等位位点。SNP-RFLP-SSR (限制性片段多态性) （微卫星标志）根据SNP在基因组中的分布位置可分为： 基因编码区SNP（cSNP） 基因调控区SNP

39、（pSNP） 基因间随机非编码区SNP（rSNP）同义cSNP，即SNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同非同义cSNP，即SNP所导致的编码序列改变可使以其为模板翻译的蛋白质的氨基酸序列发生改变，从而影响蛋白质功能SNP的检测技术 常用技术： 限制性酶切片段长度多态性（RFLP） PCR-单链构象多态性（PCR-SSCP） 毛细管电泳 变性高效液相色谱（DHPLC）以上技术仅能判断SNP的有无，而不能知道确切的碱基类型，只有进行DNA序列分析才能确认所发现的SNP通过DNA测序法获得新的SNPSNP的应用 人类基因单体型图的绘制 SNP与

40、疾病易感基因的相关性分析 当一个遗传标记的频率在患者中明显超过非患者时，就表明该标记可能与这种疾病有关。 指导用药与药物设计 由于SNP能够充分反映个体间的遗传差异，所以通过研究SNP与个体对药物敏感或耐受的相关性研究，可能阐明遗传因素对药效的英系那个，因此可能建立与基因型相关的治疗方案，对患者施行个性化用药。基因基因克隆技术克隆技术“克隆”一词被广泛使用：在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体；所以同意受精卵分裂而来的单卵双生子便是属于同一克隆；在细胞水平上，克隆指由同一个组细胞分裂而来的一群带有完全相同遗传物质的子细胞；在分子生物学中，将

41、外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制的过程为克隆。RACE技术技术RACE技术的简介技术的简介 cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。 完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。 末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。RACE(rapid-amplification of cDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。RACE的优点的优点与筛库法相比较，有许多方面的优点 此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。 节约了实验所花费的经费和时间。 只

42、要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。具体的实验步骤 cDNA第一条链的合成：第一条链的合成： 建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后，在气浴中42度保温一个小时。 注意： 在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。直接进行第二链的合成。 cDNA第二链的合成：第二链的合成： 第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4 DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。建议进行阳性对照,cDNA的

43、质量取决于制备的polyA+RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.53kb之间。通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。接头的连接及连接产物的稀释接头的连接及连接产物的稀释按照程序进行连接反应。如果没有对比样品和对照的产量，利用TricineEDTA buffer制备接头连接的ds cDNA的1/50和1/250的稀释物，用两种稀释物进行以下的RACE PCR反应，直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。 RACEPCR扩增扩增 进行进行5和和3的的RACEPCR扩增。扩增。 利用以下的程序进行降落利用以下的程序进行降落PCR反应：反

44、应： 94度度 30秒秒 5个循环个循环 ： 94度度 5秒秒 72度度 4分分 5个循环个循环 ： 94度度 5秒秒 70度度 4分分 2025个循环：个循环： 94度度 5秒秒 68度度 4分分注意注意： 建议使用降落PCR反应，这就要求GSP的Tm值70度。 当循环结束时，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5l，使用适当的分子量marker。 可以根据基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带，在68度多加5个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在25kb的时候，经常使用4min，0.2-2kb的时候将延伸时间减到23min，对于51

45、0kb的条带，延伸时间增加到10min。 RACE产物的验证：产物的验证： 应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，验证是非常有用的。 有3种验证RACE产物的方法： （1）比较由GSP和NGSP获得RACE产物。 （2）Southern blot （3）克隆并测序 我们建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。比较由比较由GSP和和NGSP获得获得RACE产物。产物。 对于5末端的RACE产物，比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。 对于3末端的RACE产物，比

46、较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。 如果条带是正确的，在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于结构中GSP1和嵌套引物的位置。 RACE产物的克隆和测序：产物的克隆和测序： 可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物，此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用TricineEDTA buffer 30l重新悬浮DNA样品。 电泳5l回收的样品来鉴定回收的质量。 将回收的PC

47、R产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点，将产物克隆到常规载体中 对于5端的RACE产物，建议挑取至少810个不同的克隆以获得5端的最大可能性的序列。（反转录并不总是进行到mRNA模板的5末端，尤其是长模板。另外，T4 DNA聚合酶会移走5末端的020个碱基。） 一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获得多的序列信息。理想的是，可以对整个开放读码框进行测序。包括5和3的非翻译区。全长全长cDNA的获得的获得 通过部分或全部测序鉴定了通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后，产物后，可以通过两种选择获得全长的可以通过两种选择获得全长的cDNA。 通过通过PCR的方法。的方法。 通过克隆的方法。通过克隆的方法。通过通过PCR的方法获得全长的方法获得全长cDNA： 扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。 根据从5和3RACE产物获得序列信息设计5和3GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3或者5的末端，应该是2328nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点，这样会导致高背景。在某些时候可以设计3和5的嵌套引物。但是还是应该先利用一