紫外吸收法和Bradford法检测蛋白质浓度

1、 紫外吸收法和紫外吸收法和bradford法法 检测蛋白质浓度检测蛋白质浓度一、紫外吸收法一、紫外吸收法 1、原理：原理： 蛋白质分子中含有共轭双键，在蛋白质分子中含有共轭双键，在280nm处有处有最大吸收值，其吸光度与蛋白浓度成正比。以标最大吸收值，其吸光度与蛋白浓度成正比。以标准蛋白作参比即可求得未知蛋白浓度。准蛋白作参比即可求得未知蛋白浓度。 2、器材与试剂器材与试剂（1）、器材 a.紫外分光光度计 b.坐标纸 c.恒温水浴 d.微量加样器 e.移液管 f.试管与试管架（2）、试剂）、试剂a. 9 g/l nacl 溶液溶液b. 标准牛血清白蛋白溶液标准牛血清白蛋白溶液 牛血清白蛋白牛血

2、清白蛋白0.1克加生理盐水定容克加生理盐水定容 至至 100毫升。毫升。c. 待测血清样品待测血清样品1 取血清取血清0.1毫升，用生理盐水稀释毫升，用生理盐水稀释 至至 2.0毫升。毫升。3、操作、操作取3支试管按下表操作： 空白 标准 测定 标准蛋白标准蛋白 （1 mg/ml） 0 1.0 0 待测样品待测样品1 （ml） 0 0 1.0 生理盐水生理盐水 (ml) 4.0 3.0 3.0 轻轻混匀放置5分钟，在nm处以空白调零，测定各管光密度，计算蛋白含量 计算公式：计算公式： 测定测定o.d/标准标准o.d x 标准浓度标准浓度x稀释倍数稀释倍数 =待测样品蛋白浓度（待测样品蛋白浓度（

3、mg/ml) 也可也可 分别测定各管分别测定各管280nm处的处的o.d值，值，以蛋白浓度以蛋白浓度为横坐标，以为横坐标，以o.d值为纵坐标绘制标准曲线。值为纵坐标绘制标准曲线。 根据未知蛋白的根据未知蛋白的o.d 值，可在标准曲线上查出该蛋值，可在标准曲线上查出该蛋白的浓度。白的浓度。v280nm/260nm吸收差法：吸收差法： v 由于核酸在260nm处有吸收峰，同时测定280nm和260nm的光度值，然后计算出蛋白浓度。依生理盐水调零点， 用经验公式计算蛋白浓度（简便但精确度稍差） v 1.450 x0.d2800.745x0.d260 =蛋白浓度（蛋白浓度（mg/ml） 二二、brad

4、ford法(一）、原理：原理： 考马斯亮蓝g250 ( cbb- g-250）与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。 该方法快速、准确、干扰因素少。cbb- g-250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。但较高浓度的十二烷基硫酸钠（soldium dodecyl sulfate），triton x100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。v（2）0.14mol/l 氯化钠溶液（生理盐水）氯化钠溶液（生理盐

5、水）v（3）标准蛋白质溶液（标准蛋白质溶液（0.1mg/ml）： 精确称取10.0毫克牛血清白蛋白，用生理生理盐水盐水定容至100毫升。 (4) 血清样品(已稀释200倍) (5) 层析样品(前次层析实验分离的原液)(三）、操作操作（标准曲线制作）（标准曲线制作） ：取7支试管按下表操作： 空白 待测标1 标2 标3 标4 标5标准蛋白标准蛋白 （ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0待测样品待测样品2（ml） 0.2 生理盐水生理盐水（ml） 1.0 0.8 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0cbb-g250(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 最终蛋白浓度（微克/毫升） 3.3 6.6 9.9 13.2 16.5 混匀，室温放置5分钟，在595nm测定各管o.d值并以蛋白浓度为横坐标，以以蛋白浓度为横坐标，以o.d值为纵坐标绘制标准曲值为纵坐标绘制标准曲线线v以以bradford法测定血清和层析分离法