微生物检测手段及注意事项

1、微生物检测手段及注意事项微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文对生长量测定法、微生物计数法、生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常用的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经

2、发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其他生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，通常情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长通常指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和他们的生长抑制紧密相关。所以有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定的方法也都直接或间接的以次为根据，

3、而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，可以从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。1.微生物计量法1.1体积测量法又称测菌丝浓度法，通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10 mL）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5 min）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有

4、一定偏差。称干重法可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的1020%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤15次，进行干燥。干燥可用烘箱在105或100下烘干，或采用红外线烘干，也可在80或40下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（Activity Dry Yeast, ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。1.3比浊法微生物的生长引起培养物混浊度的增高

5、。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。该法主要用于发酵工业菌体生长监测。如使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计，在波长600 nm处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600，以此监控E.coli的生长及诱导时间。1.4菌丝长度测量法对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度，或是利用一只一端开口并带有刻度的细玻璃管，到入合适的培养基，卧放，在开口的一端接种微生物，一段时间后记录其菌丝生长长度

6、，借此衡量丝状微生物的生长。2.微生物计数法2.1血球计数板法血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1 mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1 mm2面积上刻有400个小方格。通过油镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1 mL菌液中所含的菌体数。这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。2.2染色计数法为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计

7、数法。借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。2.3比例计数法将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。这种计数方法比较粗放。并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。2.4液体稀释法对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5 mL试样，接种1 mL到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN（M

8、ost Probable Number）得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。2.5平板菌落计数法这是一种最常用的活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。一般以直径9 cm的平板上出现50500个菌落为宜。但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数，而且同时将菌液中的细菌进行了一次分离培养，获得了单克隆。2.6试剂纸在

9、平板计数法的基础上，发展了小型商品化产品以供快速计数用。形式有小型厚滤纸片，琼脂片等。在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基，其中加入活性指示剂2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（TTC，无色）待蘸取测试菌液后置密封包装袋中培养。短期培养后在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品的含菌量。试剂纸法计数快捷准确，相比而言避免了平板计数法的人为操作误差。2.7膜过滤法用特殊的滤膜过滤一定体积的含菌样品，经丫叮橙染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光，活细胞会发橙色荧光，而死细胞则发绿色荧光。3.间接测定法微生物的生长伴随着一系列生理指标发生变化，例如酸碱度，发酵液中的含氮量，含

10、糖量，产气量等，与生长量相平行的生理指标很多，它们可作为生长测定的相对值。因此可利用生理指标等间接参数来测定生物量。3.1测定含氮量大多数细菌的含氮量为干重的12.5%，酵母为7.5%，霉菌为6.0%。根据含氮量6.25，即可测定粗蛋白的含量。含氮量的测定方法有很多，如用硫酸，过氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas测N2气法。Dumas测N2气法是将样品与CuO混合，在CO2气流中加热后产生氮气，收集在呼吸计中，用KOH吸去CO2后即可测出N2的量。3.2测定含碳量将少量（干重0.22.0 mg）生物材料混入1 mL水或无机缓冲液中，用2 mL 2%的K2Cr2O7溶液在100下加热30分钟后

11、冷却。加水稀释至5 mL，在580 nm的波长下读取吸光光度值，即可推算出生长量。需用试剂做空白对照，用标准样品做标准曲线。还原糖测定法还原糖通常是指单糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通过还原糖的测定可间接反映微生物的生长状况，常用于大规模工业发酵生产上微生物生长的常规监测。方法是，离心发酵液，取上清液，加入斐林试剂，沸水浴煮沸3分钟，取出加少许盐酸酸化，加入Na2S2O3临近终点时加入淀粉溶液，继续加Na2S2O3至终点，查表读出还原糖的含量。3.4氨基氮的测定离心发酵液，取上清液，加入甲基红和盐酸作指示剂，加入0.02 mol/L的NaOH调色至颜色刚刚褪去，加入底物18%的中性甲醛，反应

12、数刻，加入0.02 mol/L的使之变色，根据NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根据培养液中氨基氮的含量，可间接反映微生物的生长状况。3.5其他生理物质的测定P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及产酸，产气，产CO2（用标记葡萄糖做基质），耗氧，黏度，产热等指标，都可用于生长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化，最终产气量，微生物活性三方面的测定反映微生物的生长。如在BMP-2的发酵生产上，随时监测溶氧量的变化和酸碱度的变化，判断细菌的长势。4.商业化快速微生物检测法微生物的检测，其发展方向是快速，准确，简便，自动化，当前很多生物制品公司利用传统微生物检测原理，结合不

13、同的检测方法，设计了形式各异的微生物检测仪器设备，正逐步广泛应用于医学微生物检测和科学研究领域。例如：4.1试剂盒，培养基等手段抗干扰培养基和微生物数量快速检测技术结合解决了传统微生物检测手段不能解决的难题，为建立一套完整的抗干扰微生物检测系统奠定了坚实的基础。如：抗干扰微生物培养基，新型生化鉴定管，微生物计数卡，环境质量检测试剂盒等，可方便的用于多项检测。4.2借助新型先进仪器BACTOMETER全自动各类总菌数及快速细菌检测系统可以数小时内获得监测结果，样本颜色及光学特征都不影响读数，对酵母和霉菌检测同样高度敏感原理是利用电阻抗法（Impedance Technology）将待测样本与培养

14、基置于反应试剂盒内，底部有一对不锈钢电极，测定因微生物生长而产生阻抗改变。如微生物生长时可将培养基中的大分子营养物经代谢转变为活跃小分子，电阻抗法可测试这种微弱变化，从而比传统平板法更快速监测微生物的存在及数量。测定项目包括总生菌数，酵母菌，大肠杆菌群，霉菌，乳酸菌，嗜热菌，革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌等。微生物OD值是反映菌体生长状态的一个指标，OD是Optical Density（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度。通常400700 nm都是微生物测定的范围，需要紫外分光光度计测最大吸收波长。用得最多的是：505 nm测菌丝菌体、560 nm测酵母、600 nm测细菌。用测OD方法

15、画微生物生长曲线时，同一株菌的起始培养浓度可以准备多管（根据检测点的需要，如需检测10个点，就准备10管），然后每个点取一管出来测OD值就行了。一般测菌体密度的OD的波长范围是580 nm-660 nm，如枯草芽孢杆菌用600 nm，已经属于可见光区（200 nm400 nm为紫外光区，400 nm800 nm为可见光区）。空白如用水做，需要离心洗涤菌体；空白如用不接种的培养基做就不需要洗涤，但是不接种的培养基要和接种的同时培养以求条件一致，最后注意一般OD值在控制在0.10.4最好，在这个区内的值就可靠，如果OD大于1.0，一般要稀释后再测，因为OD太大，分光光度计的灵敏度就会显著降低。一般

16、都测吸光值，而且最好是整个实验过程中，保持发酵液或菌体的稀释倍数一致，吸光值与稀释倍数不一定成正比，可保证整个实验点有可比性。且取值的时候要连续读数，重复3次的数最好。另，用分光光度计测微生物的OD值为什么要把波长设为600 nm这个波长其实只是针对浊度，而分光光度计在600 nm处对浊度的反应比较灵敏。测吸收峰的实际意义并不大，比如LB摇瓶培养过夜的大肠杆菌，其实在400多纳米处的吸收最大，但那很可能是培养液的吸收峰。部分发酵产品配方和工艺(二)纤维素酶菌种：黑曲霉GD-6。种子培养基：麸皮2.0%，葡萄糖3.0%，(NH4)2SO40.15%，pH 5.56.0，2830，培养40 h。发

17、酵培养基：酵母膏1.0%，蛋白胨0.2%，(NH4)2HPO40.2%，K2HPO40.02%，KH2PO40.08%，MgSO40.09%，pH 5.56.0，2830，培养140 h。黄原胶菌种：黄单孢菌。发酵培养基：葡萄糖4%，酵母粉0.05%，豆粕粉0.02%，无机盐适量。发酵参考环境：5100吨罐，搅拌转速115转/分，罐压0.5公斤，最高通风量1:0.5/分，pH在7.0左右，28,发酵周期72 h，发酵液最高粘度14600 mPas左右。虫草多糖发酵培养基：葡萄糖4.0%，黄豆饼粉4.0%，酵母膏0.5%，KH2PO40.25%，MgSO40.15%。发酵参考环境：5100吨罐，

18、搅拌转速140转/分，通风量1:0.5/分，罐压0.5公斤，培养4572小时。细菌纤维素菌种：AcetobacterxylinumNUST4。发酵培养基：葡萄糖2.4%，蔗糖2.2%，蛋白胨1.6%，醋酸0.24%，Na2HPO43.5%，KH2PO40.1%，MgSO40.6%，FeSO40.0015%，pH 6.0。Mg2+最适添加量为6 g/L;0.015 g/L Fe2+时纤维素产量达最大；添加0.003 g/L烟酸、0.02 g/L生物素和20 mL/L乙醇时纤维素产量达9.87 g/L。菌种：木醋杆菌1.1812。发酵培养基：蔗糖5.0%，蛋白胨1.5%，柠檬酸0.2%，Na2HP

19、O40.2%，KH2PO40.2%，MgSO40.03%，乙醇1%。培养条件：pH 6.8，温度28，培养周期6。细菌纤维素产量干重为2 g/L。发酵完毕后过滤收集粗纤维，再用4% NaOH溶液冲洗，去离子水和0.5%乙酸反复冲洗，即获细菌纤维素。头孢菌素菌种：顶头孢霉。种子培养基：玉米浆，蔗糖，葡萄糖，DL-蛋氨酸，豆油，CaCO3，pH 6.56.6。发酵培养基：玉米浆，淀粉，糊精，蛋氨酸，葡萄糖，豆油，CaCO3，MgSO4，(NH4)2S04，FeSO4，MnSO4，ZnSO4，CuSO4，pH 6.06.1。发酵参考环境：5100吨罐，搅拌转速115转/分，罐压0.5公斤，最高通风量

20、1:1/分，pH在6左右，周期150小时。螺旋霉素菌种：螺旋霉素链霉菌。发酵参考环境：5100吨罐，搅拌转速115转/分，罐压0.5公斤，最高通风量1:1/分，发酵周期130小时左右。根据螺旋霉素生物合成的研究结果，短链脂肪酸是合成螺旋霉素的前体，结果发现在发酵培养48 h后添加0.5%浓度的乙醇，能够提高其发酵效价10%左右。加入豆油能较大幅度地提高螺旋霉素的发酵效价。在培养48 h时加入较在基础料中加入更能提高螺旋霉素发酵效价，豆油的浓度以1%为好。利福霉素菌种：地中海诺卡氏菌。培养基：葡萄糖10%，液化淀粉2%，黄豆饼粉1%，蛋白胨1%，鱼粉0.5%，各种无机盐适量。发酵参考环境：510

21、0吨罐，搅拌转速115转/分，罐压0.5公斤，最高通风量1:1/分，发酵周期130小时左右。红霉素菌种：红色链霉菌。培养基A：液化淀粉4%，葡萄糖4%，黄豆饼粉4%，正丙醇1%，无机盐适量。培养基B：黄豆饼粉4，葡萄糖4，淀粉4，糊精2%，CaCO30.6，(NH4)2SO40.15%，KH2PO40.02，NaC1 0.2%，MgSO40.02%。发酵参考环境：10100吨罐，搅拌转速115转/分，最高通风量1:1/分，pH自然，28，周期160小时。洁霉素菌种：链霉菌。发酵培养基：黄豆饼粉2.5%，玉米浆0.6%，(NH4)2SO40.5%，NaNO34%，NaCl 0.6%，CaCO30

22、.9%，玉米淀粉2.5%，葡萄糖3%，KH2PO40.07%。发酵参考环境：5100吨罐，搅拌转速100转/分，通风量1:0.5/分，罐压0.7公斤，pH 6.57，培养温度：060 h，31；60130 h，30；130 h至放罐31。发酵液初期粘度最大到130 mPas，发酵周期150小时。土霉素培养基：黄豆饼粉3%，玉米浆0.65%，淀粉8%，(NH4)2SO41.2%，NaCl 0.2%，CaCO31.1%，KH2PO40.015%，每罐外加CoCl2510 g/吨。发酵参考环境：5100吨罐，搅拌转速140转/分，通风量1:0.7/分，罐压0.7公斤。环孢素培养基：葡萄糖2%，面粉4

23、%，干酪素0.61.2%，NaNO30.15%，KH2PO40.2%，KCl 0.05%，MgSO40.005%，CaCO30.2%。发酵参考环境：5100吨罐，搅拌转速140转/分，通风量1:0.7/分，罐压0.7公斤，pH 6.5，发酵时间4天左右，温度25度左右。其中通气和培养温度对CyA的生物合成量影响非常大。纳他霉素菌种：褐黄孢链霉菌。培养基：大豆蛋白胨l.8%，酵母粉0.45%，葡萄糖3.6%，pH 7.5。发酵时间96 h左右。庆大霉素菌种：庆大小单孢菌。培养基：淀粉4%，玉米粉2%，黄豆饼粉3%，蛋白胨0.3%，(NH4)2SO40.1%，CaCO30.5%，每罐外加CoCl2

24、810 g/吨。发酵参考环境：5100吨罐，搅拌转速140转/分，通风量1:1/分，罐压0.5公斤，pH 7.58.0，发酵周期80小时。金霉素菌种：金色链霉菌。培养基及培养条件：玉米淀粉8.5%，花生粉1.5%，黄豆粉2.5%，淀粉酶(酶活力2000 IU/mL) 0.004%，NaCl 0.25%，(NH4)2SO40.5%，CaCO30.7%，蛋白胨1.0%，酵母粉0.2%，MgSO40.025%，豆油4.0 mL/100mL。在温度290.5，发酵培养166 h。小诺霉素菌种:棘孢小单孢种子培养基：黄豆饼粉l.5%，葡萄糖0.1%，玉米粉2%，鱼粉0.2%，淀粉4%，pH 7.5。发酵

25、培养基：葡萄糖0.5%，淀粉4%，玉米粉1.5%，热榨黄豆饼粉2.5%，蛋白胨0.2%，硫酸铵0.05%，pH7.2。四环素培养基主要成分：液化淀粉，玉米浆，黄豆粉，KH2PO4，每罐外加二巯基苯并噻唑和NaBr。发酵参考环境：5100吨罐，搅拌转速140转/分，通风量1:0.7/分，罐压0.7公斤，pH 6.0左右。部分发酵产品配方和工艺(一)赤霉素发酵1060吨罐，搅拌转速115转/分，通风量1:1/分，培养温度大多采用2932。培养基的起始pH值控制在5.5左右，而将发酵过程的pH值维持在3.54.5之间为宜。种子培养基：葡萄糖1.5%，豆饼粉1.5%，淀粉1.0%，KH2PO40.1%

26、，(NH4)2SO40.05%，MgSO40.1%，自然pH值。发酵培养基：豆饼粉0.9%淀粉7.0%，葡萄糖1.0%，KH2PO40.15%，MgSO40.08%，-淀粉酶0.003%，pH 5.05.5发酵周期130小时阿维菌素：种子培养基：淀粉3.0%，豆饼粉2.0%，酵母粉0.2%，CoCl26H2O 0.5 ppm，pH 7.07.2。发酵培养基：淀粉5.0%，玉米粉l.0%，酵母粉l.0%，豆饼粉1.0%，CaCO30.2%，CoCl26H2O 0.5 ppm，pH 7.07.2。妥布霉素发酵菌种：黑暗链霉菌。发酵培养基：黄豆饼粉2.5%，葡萄糖1.0%，玉米粉1.0%，玉米淀粉1

27、.5%，(NH4)2SO40.5%，鱼粉0.4%；MgS040.6%，油1.0%，ZnSO40.05%，CaCO30.6%，温度37，发酵时间112 h左右。氢化可的松 菌种：蓝色犁头霉(AS365) 发酵培养基：葡萄糖1.0%，酵母浸膏0.23%，玉米浆1.5%，硫酸铵0.5%，pH 6.46.5。28培养24 h，投入0.25%的RSA（醋酯化合物：17-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯，RSA），转化3642 h。宁南霉素菌种：诺尔斯链霉菌西昌变种孢子斜面培养基：可溶性淀粉2%，蔗糖1.0%，硝酸钾1.0%，K2HPO40.5%，MgSO40.5%，NaCl 0.5%，Ca

28、CO30.5%，硫酸亚铁0.01%，琼脂2.0%，灭菌前pH 7.27.4。种子培养基：玉米粉2.0%，黄豆饼粉3.0%，酵母粉0.01%，K2HPO40.01%，MgSO40.0025%，NaCl 0.02%，CaCO30.03%，初始pH 7.0。发酵培养基：玉米粉2.0%，淀粉1.0%，花生饼粉3.5%，酵母粉0.05%，K2HPO40.02%，MgSO40.05%，(NH4)2SO40.25%，CaCO30.5%，初始pH 7.0。发酵48 h达到发酵高峰。多抗霉素发酵培养基：玉米粉1.5%，豆饼粉2.0%，饴糖2.0%，KH2PO40.1%，NaCl 0.1%，CaCO30.3%，p

29、H 6.5。10接种量，28，120h。BT该菌生长的最适pH在7.07.2，弱碱性条件有利于芽泡及晶体的形成；增加培养基中糖含量显著提高菌体的生长量，但对芽孢及晶体的形成均有一定影响；高通气量有利于菌的生长，并可缩短发酵周期，但后期通气量过大影响芽孢及晶体形成。该菌发酵的最佳工艺条件为：控制发酵温度在30；发酵前期(包括延迟期、加速期、对数期)：pH控制在7.0，采用达1:2.0 v/(vmin)的大通气量，达1:2.0 v/(vmin)，为菌的生长提供良好的环境，尽可能提高菌数(高于7.51010/mL)；发酵后期(减速期、恒定期)：不控pH，并适当减小通气旦到1:0.5、1:1.0 v/

30、(vmin)，更有利于菌体向芽孢及伴孢晶体转化(98以上)。液体培养基：I号培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.5%，NaCl 0.5%，pH 7.2；II号培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.5%，NaCl 0.5%，葡萄糖1.0%，pH7.2。衣康酸菌种：土曲霉。发酵参考环境：5100吨罐，搅拌转速100转/分，通风量1:0.2/分，罐压0.7公斤，pH 4.0左右。培养基：葡萄糖14%，米糠0.3%，各种无机盐适量。发酵周期90小时。曲酸菌种：黄曲霉。发酵参考环境：5100吨罐，搅拌转速100转/分，通风量1:0.2/分，罐压0.7公斤，pH 4.0左右。培养基：主要成分为液化淀粉14%，各

31、种无机盐适量。发酵周期130小时。菌种：米曲霉。利用豆渣的发酵培养基：豆渣80%，麸皮24%，酵母膏1.2%，MgSO47H2O 0.16%，pH自然；30发酵培养，56 d菌体生长量和曲酸产量最大。利用黄浆水发酵培养基为：葡萄糖12%，酵母膏0.5，MgSO47H2O 0.05%，K2HPO40.05%，黄浆水100%，pH为6.0。30发酵培养，56 d菌体生长量和曲酸产量最大。柠檬酸菌种：黑曲霉。发酵参考环境：5100吨罐，搅拌转速100转/分，通风量1:1/分，罐压0.7公斤，pH在3左右；培养基主要成分为液化淀粉14%，各种无机盐适量，产酸温度为3436，发酵周期90小时。谷氨酸菌种

32、：谷氨酸棒杆菌。发酵参考环境：5100吨罐，搅拌转速100转/分，通风量1:1/分，罐压0.7公斤，pH在7.0左右；培养基主要成分：葡萄糖13%，MgSO47H2O 0.08%，KH2PO40.08%，玉米浆3%9%，糖蜜0.5%1%，豆浓3%5%，KCl 0.1%，发酵周期30小时。赖氨酸菌种：谷氨酸棒杆菌。发酵参考环境：5100吨罐，搅拌转速100转/分，通风量1:1/分，罐压0.7公斤，pH在7.0左右。种子培养基：葡萄糖1.5%，(NH4)2SO40.4%，MgSO47H2O 40 mg，玉米浆2.0%，尿素0.1%，CaCO33.0%，乙酸铵0.1%，K2HPO40.15%，豆浓0

33、.86%，pH 7.27.4，115高压灭菌15 min。发酵培养基：葡萄糖15.0%，(NH4)2SO43.5%，MgSO47H2O 20 mg，玉米浆2.5%，乙酸铵0.9%，生物素20 g，K2HPO40.15%，豆浓1.6%，pH7.27.4。115高压灭菌15 min。碱性蛋白酶菌种：芽孢杆菌发酵培养基I：可溶性淀粉1%，蛋白胨0.5%，Na2HPO40.4%，KH2PO40.03%，CaCl20.1%，pH中性，121灭菌25 min。发酵培养基II：玉米粉2%，豆饼粉3%，麸皮3%，Na2HPO40.4%，KH2PO40.03%，ZnCl20.1%，pH 8.0，121灭菌25 min。发酵培养基III：黄豆饼粉5%，玉米粉5%，麸皮2.5%，KH2PO40.03%，Na2HPO40.4%，Na2CO30.1%，自然pH。在36下通风培养，前期通风1:0.15，后期通风1:0.2，培养40 h左右。低温碱性蛋白酶菌种：黄海黄杆菌。发酵培养基I：豆饼粉(水解液，加0.5% NaOH，121水解30 min，冷却、过滤) 4.5%、玉米浆6%，Na2HP