生物工艺学第12章菌种

1、自然界菌种的源泉：土壤 水 空气 植物等 新的微生物菌种需要从自然生态环境中混新的微生物菌种需要从自然生态环境中混 杂的微生物群中挑选出来，因此必须要有杂的微生物群中挑选出来，因此必须要有 快速而准确的新种快速而准确的新种分离分离和和筛选筛选方法。方法。微生物工业对菌种的要求微生物工业对菌种的要求 1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。 2.易控制培养条件，发酵周期较短。易控制培养条件，发酵周期较短。 3.抗杂菌和噬菌体的能力强。抗杂菌和噬菌体的能力强。 4.不易变异和退化，不产生任何有害物质不易变异和退化，不产生任何有害物质和和 毒素。毒素。 典型的微生

2、物新种分离筛选过程典型的微生物新种分离筛选过程 分离微生物新种的具体过程大体可分为：分离微生物新种的具体过程大体可分为：采样、增殖、纯化和性能测定采样、增殖、纯化和性能测定(2) 药理活性化合物的分离-体外筛选 筛选能抑制生物代谢途径中一关键性酶（靶酶或靶标酶）的活性。 抗高血压：用血管紧张素转移酶 抗骨质疏松：用组织蛋白酶B（CAT-B模型） OHOOHOOHGlu12345678910123456EC50=6.06ug/ml抗HIV：HIV逆转录酶 （EC500.064 ug/ml） HOCOOHHOHOCOOHCOOHOHOHOOCOOHOHOHOOHOO HCH OCO O HHOOC

3、HOCOOH891011121314151617181920212223242526272829307654321 1.2 菌种的选育自然界获得的菌种经进一步选育获得多种类型突变株提高产量改进质量获得新产品在微生物理论研究方面积累知识利于后期分离选育方法：自然选育人工选育 诱变育种杂交育种基因工程育种 理想的工业发酵菌种应具备的条件：理想的工业发酵菌种应具备的条件：(1)遗传性状稳定；遗传性状稳定；(2)生长速度快，不易被噬菌体等污染；生长速度快，不易被噬菌体等污染；(3)目标产物的产量尽可能接近理论转化率；目标产物的产量尽可能接近理论转化率；(4)目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利

4、目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离；于产物分离；(5)尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量及利于产物分离；产量及利于产物分离；(6)培养基成分简单、来源广、价格低廉；培养基成分简单、来源广、价格低廉；(7)对温度、对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；感；(8)对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。 自然选育是指不经人工处理，利用菌种自然选育是指不经人工处理，利用菌种自然突变自然突变（spontaneousmutation）而进行而进行菌种筛选

5、的过程。菌种筛选的过程。突变原因：突变原因：1.环境因素环境因素2.碱基自发突变碱基自发突变自发突变的自发突变的频率较低频率较低，变异程变异程度不大度不大，育育种种过程十分缓慢过程十分缓慢。 自然选育在工业生产中可以达到纯化菌种，防止菌种衰退，稳定生产，提高产量的目的。自然选育最为成功的例子：自然选育最为成功的例子：目前被广泛使用的卡介苗目前被广泛使用的卡介苗(BCGvaccine)。法国的卡尔密脱法国的卡尔密脱(Calmette)和介林和介林(Guerin)把牛型的结核分枝杆菌接种在把牛型的结核分枝杆菌接种在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上，连续牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上，连续传代培养传代培养

6、230代，前后经历代，前后经历13年时间，年时间，在在1923年获得显著减毒的结核杆菌年获得显著减毒的结核杆菌-卡卡介苗。介苗。 以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-610-10左右。 诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。物理、化学或生物诱变方法物理、化学或生物诱变方法 物理诱变剂：射线如紫外线、X-射线、-射线，快中子。 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专

7、业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。 紫外线诱变处理： UV波长一般选择在260nm。实际操作时紫外灯功率15W，距离30cm，被诱变材料（菌）的悬浮液进行适当时间的照射处理。 化学诱变剂：指一些化学物质，如碱基类似物（如5-氟尿嘧啶）、氮芥、亚硝酸及一些烷化剂 等。 化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂及亚硝酸。使用化学诱变剂的优缺点： 大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射 更有效。 化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射进行工作时，设备费用大，并要注意安全性。 大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，

8、要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。 氮芥诱变处理：将待处理菌（孢子）的悬浮液与氮芥盐酸盐溶液及NaHCO3溶液混合，放置适当时间后，加入NaHCO3与甘氨酸的混合溶液终止作用，诱变处理结束。 生物诱变剂 指能引起染色体或基因突变的一些生物因素，如噬菌体。1碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，因为回复突变率高，效果不大。2亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。3吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。4紫外线仍十

9、分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺失突变。但它可能影响邻近基因的性能。出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选菌株选育典型流程出发菌株（砂土管或冷冻管）出发菌株（砂土管或冷冻管） 小试小试 原种特性考擦原种特性考擦斜面斜面 或摇瓶培养或摇瓶培养24h 培养基优化培养基优化 单孢子悬液单孢子悬液 菌悬液菌悬液 挑出高产菌株挑出高产菌株诱变处理诱变处理 摇瓶复筛摇瓶复筛 处理前后计数处理前后计数 稀释涂平板稀释涂平板 传种斜面传种斜面 观察单菌落形态观察单菌落形态挑选单菌落转种斜面挑选单菌落转种斜面 保藏菌株保藏菌株 对照组比较对照组比较 摇瓶初

10、筛摇瓶初筛 挑出高产斜面挑出高产斜面 .出发菌株的选择环节出发菌株的选择环节 1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。 2在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。 3每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。 4出发菌株开始时可以同时选23株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留下作继续诱变。 5要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。 6根据采用的诱变剂选择细胞生理状态。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。待处理的菌

11、悬液应考虑微生物的待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态生理状态、悬液的均一性悬液的均一性和和环境条件环境条件。一般要求菌体处于。一般要求菌体处于对对数生长期数生长期。悬液的悬液的均一性均一性可保证诱变剂与每个细胞可保证诱变剂与每个细胞机会机会均等并充分地接触均等并充分地接触，避免细胞团中变异菌株与非，避免细胞团中变异菌株与非变异菌株混杂，出现不纯的菌落，给后续的筛选变异菌株混杂，出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。为避免细胞团出现，可用玻璃珠工作造成困难。为避免细胞团出现，可用玻璃珠振荡打散细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤，得振荡打散细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤，得到分散的菌体。到分散的

12、菌体。对产孢子或芽孢的微生物最好采用其对产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或孢子或芽孢芽孢。将经过一定时期培养的斜面上的孢子洗下，。将经过一定时期培养的斜面上的孢子洗下，过滤。过滤。利用孢子进行诱变处理的优点：利用孢子进行诱变处理的优点：能使能使分散状态细胞均匀地接触诱变剂，更重要分散状态细胞均匀地接触诱变剂，更重要的是它尽可能地避免了出现表型延迟的是它尽可能地避免了出现表型延迟现象现象。所以应尽可能选择孢子或单倍体的细所以应尽可能选择孢子或单倍体的细胞作为诱变对象。胞作为诱变对象。表型延迟表型延迟(phenotypiclag)：指某一突变在指某一突变在DNA复制和细胞分裂后复制和细胞分裂后(

13、即下一代即下一代)，才在细胞表型上显示出来。，才在细胞表型上显示出来。原因如下：原因如下：一方面：一方面：因为对数期细胞往往是因为对数期细胞往往是多核多核的，的，很可能一个核发生突变，而另一个核未突很可能一个核发生突变，而另一个核未突变，若突变性状是隐性的，在当代并不表变，若突变性状是隐性的，在当代并不表现出来，在筛选时就会被淘汰；若突变性现出来，在筛选时就会被淘汰；若突变性状是显性的，那么，在当代就表现出来，状是显性的，那么，在当代就表现出来，但在进一步传代后，就会出现分离现象，但在进一步传代后，就会出现分离现象，造成生产性状衰退。造成生产性状衰退。另一方面：另一方面：另一方面：另一方面：就

14、是虽然菌体发生了突变，并就是虽然菌体发生了突变，并且突变基因由杂合状态变成了纯合状态，且突变基因由杂合状态变成了纯合状态，但仍不表现出突变性状（但仍不表现出突变性状（生理性延迟现生理性延迟现象）象）。这可以用营养缺陷型来说明：这可以用营养缺陷型来说明：一个发生营养缺陷型突变的菌株，产某一个发生营养缺陷型突变的菌株，产某种酶的基因已发生突变，但是由于突变前种酶的基因已发生突变，但是由于突变前菌体内所含的酶系仍然存在，仍具有野生菌体内所含的酶系仍然存在，仍具有野生型表型。只有通过数次细胞分裂，细胞内型表型。只有通过数次细胞分裂，细胞内正常的酶得以稀释或被分解，营养缺陷型正常的酶得以稀释或被分解，营

15、养缺陷型突变的性状才会表现出来。突变的性状才会表现出来。仅仅采用诱变剂的理化指标控制诱变剂的用仅仅采用诱变剂的理化指标控制诱变剂的用量常会造成偏差，不利于重复操作。量常会造成偏差，不利于重复操作。例如，同样功率的紫外线照射诱变效应还受例如，同样功率的紫外线照射诱变效应还受到紫外灯质量及其预热时间、灯与被照射物的距到紫外灯质量及其预热时间、灯与被照射物的距离、照射时间、菌悬液的浓度、厚度及其均匀程离、照射时间、菌悬液的浓度、厚度及其均匀程度等诸多因素的影响。度等诸多因素的影响。另外，不同种类和不同生长阶段的微生物对另外，不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同。诱变剂的敏感程度不同。

16、所以在诱变处理前，一般应预先做诱所以在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线致死曲线，选，选择合适的处理剂量。致死率表示诱变剂造择合适的处理剂量。致死率表示诱变剂造成菌悬液中死亡菌体数占菌体总数的比率。成菌悬液中死亡菌体数占菌体总数的比率。要确定一个合适的剂量，常常需要经要确定一个合适的剂量，常常需要经过多次试验。过多次试验。就一般微生物而言，突变率随剂量的增就一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但达到一定剂量后，再加大剂量大而增高，但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。反而会使突变率下降。对于诱变剂的具体用量有不同的看法：对于诱变剂

17、的具体用量有不同的看法：有人认为应采用高剂量有人认为应采用高剂量：就是造成菌体致：就是造成菌体致死率在死率在90-99.9%时的剂量是合适的，这样时的剂量是合适的，这样能获得较高的正突变率，并且淘汰了大部能获得较高的正突变率，并且淘汰了大部分菌体，减轻了筛选工作的负担。分菌体，减轻了筛选工作的负担。许多人倾向于采用低剂量：许多人倾向于采用低剂量：(致死率在致死率在70%-80%),甚至更低剂量甚至更低剂量(致死率在致死率在30-70%)，他，他们认为低剂量处理能提高正突变率，而负们认为低剂量处理能提高正突变率，而负突变较多地出现在偏高的剂量中。突变较多地出现在偏高的剂量中。诱变育种中还常常采取

18、诱变育种中还常常采取诱变剂复合诱变剂复合处理，处理，使它们产生协同效应。使它们产生协同效应。复合处理可以将两种或多种诱变剂复合处理可以将两种或多种诱变剂分先后或同时使用，也可用同一诱变剂分先后或同时使用，也可用同一诱变剂重复使用。因为每种诱变剂有各自的作重复使用。因为每种诱变剂有各自的作用方式，引起的变异有局限性，用方式，引起的变异有局限性，复合处复合处理则可扩大突变的位点范围，使获得正理则可扩大突变的位点范围，使获得正突变菌株的可能性增大，突变菌株的可能性增大，因此，诱变剂因此，诱变剂复合处理的效果往往好于单独处理复合处理的效果往往好于单独处理.菌种菌种单独处理单独处理复合处理复合处理诱变剂

19、诱变剂突变率突变率(%)诱变剂诱变剂突变率突变率(%)土曲霉土曲霉紫外线紫外线X射线射线21.319.7紫外线紫外线+X射线射线42.8土曲霉土曲霉氮芥氮芥(0.1%)紫外线紫外线不明显不明显4.7紫外线紫外线+氮芥氮芥11.0链霉菌链霉菌紫外线紫外线射线射线31.035.0紫外线紫外线+射线射线43.6金色链霉菌金色链霉菌(2U-84)二乙烯三胺二乙烯三胺硫酸二乙酯硫酸二乙酯紫外线紫外线6.061.7812.5紫外线紫外线+二乙烯三胺二乙烯三胺紫外线紫外线+硫酸二乙酯硫酸二乙酯26.635.86灰色链霉菌灰色链霉菌(JIC-1)紫外线紫外线9.8紫外线紫外线+可见光照射可见光照射1次次紫外线

20、紫外线+可见光照射可见光照射6次次9.716.6 . 中间培养环节中间培养环节 由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表型延迟的过程，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。因此需进行几代培养（中间培养），这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。 . 分离和筛选环节分离和筛选环节 筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异. 例如初筛可以用平皿培养，直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比

21、较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。几个例子几个例子紫外线的诱变育种紫外线的诱变育种 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A灯与处理材料的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。 被照射的菌悬液细胞数， 细菌为106个ml左右， 霉菌孢子和酵母细胞为106107个ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射后的处理

22、应在红灯下进行。 具体操作步骤： 1将细菌培养液以3000rmin 离心5min，倾去上清液，将菌体 打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。 2将菌悬液放入一已灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液用定性滤纸过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个ml左右，作为待处理菌悬液。 3取24m1制备的菌液加到直径 9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射1050s。操作全程应避免白炽光。 4取未照射的制备菌液和照射菌液 各0.5ml进行

23、稀释分离，计数活菌 细胞数。 5取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120rmin振荡培养46h。 6取中间培养液稀释分离、培养。 7挑取菌落进行筛选。亚硝基胍诱变曲霉菌亚硝基胍诱变曲霉菌 N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。 NTG的诱变作用随pH的升高而增强。具体操作步骤 1单孢子悬液制备 取斜面， 加入6ml 0.1molL pH6.0 的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立

24、即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达l06个ml，此为待处理孢子悬液。 2NTG溶液的制备 用分析天平称取2mg NTG ，加入2ml 0.1molL pH 6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。3诱变处理 吸取NTG溶液lml， 加入到1ml孢子悬液中，30振荡 30min，立即稀释1000倍停止作用， 然后以10-2，10-4两个稀释度分离培养，30 3天后计数。 4死亡率计算 将未处理的孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离， 30下培养3天。根据处理前后的活孢子数可计算出死亡率。 5挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选1.2.3 1.2.3

25、杂交育种杂交育种 杂交育种(Hybridization)一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核微生物的接合、F因子转移、转导和转化等过程，促使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。 准性生殖（parasexual reproduction）: 一种类似于有性生殖但较原始的生殖方式。主要存在于一些产生或不产生有性孢子的真核微生物半知菌中。与有性生殖的最大区别是不经减数分裂、不产生有性孢子。其过程包括异核体（hetrokargon）的形成，二倍体的形成以及体细胞的交换和单元化。首先形态上没有区别的、但在遗传性状上可能有区别的两个亲本体细胞的菌丝联结，即通过

26、菌丝联结形成异核体，其频率很低。异核体中来自不同菌丝细胞的细胞质融合，但核不融合。异核体能够独立生活但其分生孢子发生分离，都表现亲体的类型，但异核体可以极低的频率发生核融合，形成杂合二倍体。二倍体的杂合子在进行有丝分裂过程中，有极少数细胞会发生染色体交换（即体细胞交换），导致某些基因的重组或通过单元化过程的染色体不离开行为，及随后的染色体丢失，形成某些基因结合的二倍或单倍分离子。 准性生殖的特点是：重组体细胞和一般体细胞没有什么不同，不产生在特殊的囊器中；无减数分裂，不产生有性孢子；染色体的交换和减少是不规则的，而且是不协调的。准性生殖中体细胞交换可导致基因重组，因此，对于无有性生殖或有性生殖

27、不常见的真菌，可通过准性生殖进行有丝分裂定位，为遗传分析提供了一种手段。在工业生产的育种工作中也常被采用，以改变菌种的遗传特性。 基因型不同的微生物间通过杂交的好处是： 集中不同菌株的优良生产性能 克服菌种的退化，克服长期诱变造成生活能力的下降 改变产品质量和产量 生产出新产品 有杂交现象的微生物为数不多，在有工业价值的微生物中更少，而且即使发生杂交，遗传重组的频率亦不高，这影响了杂交育种在微生物品种选育中的应用。 原生质体融合可有效的克服这一不足。 1.2.3.1 1.2.3.1 原生质体融合技术原生质体融合技术 指通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程

28、，亦可称为“细胞融合”(cell fusion)。 始于1976年,最早是在动物细胞实验中发展起来的，后来，在酵母菌、霉菌、高等植物、以及细菌和放线菌中也得到了应用。 原生质体融合育种是基因重组的一种重要方法。 原生质体融合作为一种新的育种手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。 是继转化、转导和接合等微生物基因重组方式之后，又一个极其重要的基因重组技术。 应用原生质体融合技术后，细胞间基因重组的频率大大提高了，在某些例子中，原生质体的重组频率已大于10-1(而诱变育种一般仅为10-8)。如今，能借助原生质体融合技术进行基因重组的细胞极其广泛，包括原核微生物、真核微生物以及

29、动植物和人体的细胞。 原生质体融合育种的特点原生质体融合育种的特点 杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。 受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。 遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。 存在着两株以上亲株同时参与 融合形成融合子的可能性。 有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。 提高菌株产量的潜力较大。 原生质体融合育种的过程原生质体融合育种的过程原生质体融合技术示意图原生质体融合技术示意图 主要步骤为：选择亲株、制备原生质体、原生主要步骤为：选择亲株、

30、制备原生质体、原生质体融合、原生质体再生及筛选优良性状的融合子质体融合、原生质体再生及筛选优良性状的融合子. . 选择亲株选择亲株两亲株应 稳定、互补、具遗传标记 为了获得高产优质的融合子，首先应该选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。同时，为了能明确检测到融合后产生的重组子并计算重组频率，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等。可以通过诱变剂对原种进行处理来获得这些遗传标记。在进行原生质体融合前，应先测定菌株各遗传标记的稳定性，如果自发回复突变的频率过高，应考虑该菌株是否适用。. . 原生质体制备原生质体制备 去除细胞壁是制备原生质体的关键去除细胞壁是制备

31、原生质体的关键。 一般都采用一般都采用酶解法酶解法去壁。根据微生物细去壁。根据微生物细胞壁组成和结构的不同，需分别采用不胞壁组成和结构的不同，需分别采用不同的酶，如同的酶，如溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶等。等。 有时需有时需结合其它一些措施结合其它一些措施，如在生长培，如在生长培养基中养基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，等，以以提高细胞壁对酶解的敏感性。提高细胞壁对酶解的敏感性。甘氨酸、蔗糖或抗生素的作用甘氨酸、蔗糖或抗生素的作用 在菌体生长的培养基中添加在菌体生长的培养基中添加甘氨酸甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解。甘氨酸的可以使菌体较容易被酶解。甘氨

32、酸的作用机理并不十分清楚，有人认为甘作用机理并不十分清楚，有人认为甘氨酸渗入细胞壁肽聚糖中代替氨酸渗入细胞壁肽聚糖中代替D-丙氨酸的位置，影丙氨酸的位置，影响细胞壁中各组分间的交联度。响细胞壁中各组分间的交联度。 不同菌种对甘氨酸的最适需求量各不相同。在不同菌种对甘氨酸的最适需求量各不相同。在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性。敏感性。蔗糖蔗糖的作用可能是扰乱了菌体的代谢，最的作用可能是扰乱了菌体的代谢，最适的蔗糖添加浓度随不同菌种而变化。适的蔗糖添加浓度随不同菌种而变化。 青霉素青霉素能干扰肽聚糖合成中的转肽作用，使多能干扰肽聚糖合

33、成中的转肽作用，使多糖部分不能交联，从而影响肽聚糖的网状结构的形糖部分不能交联，从而影响肽聚糖的网状结构的形成，所以，在菌体生长对数期加入适量青霉素，就成，所以，在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感。能使细胞对溶菌酶更敏感。 菌龄也是影响溶壁的因素之一。一般处于对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。 原生质体对渗透压极其敏感，低渗将引起细胞破裂。一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性。 对于不同微生物，原生质体的高渗稳定液组对于不同微生物，原生质体的高渗稳定液组成也是不同的。成也是不同的。 如细菌的稳定液常用如细菌的稳定液常用SMMSMM液液 (

34、 (用于芽孢杆菌原生质体制备和融合，用于芽孢杆菌原生质体制备和融合， 其主要成分是蔗糖其主要成分是蔗糖0.5M, 0.5M, 顺丁烯二酸顺丁烯二酸 0.02M, MgCl0.02M, MgCl2 20.02M)0.02M)和和DFDF液液( (用于用于 棒状杆菌原生质体制备和融合，主要成分是蔗糖棒状杆菌原生质体制备和融合，主要成分是蔗糖0.25M0.25M琥珀酸琥珀酸0.25M, EDTA0.001M, K0.25M, EDTA0.001M, K2 2HPOHPO4 40.02M, 0.02M, KHKH2 2POPO4 40.11M , MgCl0.11M , MgCl2 2 0.01M)0

35、.01M)。 在链霉菌中用得较多的是在链霉菌中用得较多的是P P液液( (主要成分蔗糖主要成分蔗糖0.3M, 0.3M, MgClMgCl2 20.01M, CaCl0.01M, CaCl2 20.25M0.25M及少量磷酸盐和无机离及少量磷酸盐和无机离子子) )。 真菌中广为使用的是真菌中广为使用的是0.7M NaCl0.7M NaCl或或0.6M 0.6M MgSOMgSO4 4溶液，溶液， 高渗稳定液使原生质体内空泡增大，浮力增加，高渗稳定液使原生质体内空泡增大，浮力增加，易与菌丝碎片分开。易与菌丝碎片分开。一些微生物的去壁方法一些微生物的去壁方法微生物微生物细胞壁主要细胞壁主要成分成分

36、去壁方法去壁方法革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌 芽孢杆菌芽孢杆菌 葡萄球菌葡萄球菌 链霉菌链霉菌小单胞菌小单胞菌肽聚糖肽聚糖溶菌酶处理溶菌酶处理溶葡萄球菌素处理溶葡萄球菌素处理溶菌酶处理溶菌酶处理( (菌丝生长时补充菌丝生长时补充0.50.55.0%5.0%甘氨酸甘氨酸或或101034%34%蔗糖蔗糖) )溶菌酶处理溶菌酶处理( (菌丝生长时补充菌丝生长时补充0.20.20.5%0.5%甘氨酸甘氨酸) )革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌 大肠杆菌大肠杆菌碱性普罗委登斯菌碱性普罗委登斯菌 黄色短杆菌黄色短杆菌肽聚糖和脂肽聚糖和脂多糖多糖溶菌酶和溶菌酶和EDTAEDTA处理处理溶菌酶和溶菌酶和EDTAEDTA处

37、理处理溶菌酶处理溶菌酶处理( (生长时补充生长时补充0.41M0.41M蔗糖蔗糖及及 0.3U/ml0.3U/ml青霉素青霉素) )霉菌霉菌纤维素和几纤维素和几丁质丁质纤维素酶或真菌中分离的溶壁酶纤维素酶或真菌中分离的溶壁酶酵母菌酵母菌葡聚糖和几葡聚糖和几丁质丁质蜗牛酶蜗牛酶. . 原生质体融合原生质体融合 聚乙二醇聚乙二醇(PEG)能有效地促进原生质体融合能有效地促进原生质体融合 PEG促进原生质体融合的促进原生质体融合的机理机理并不清楚，并不清楚，有人推测助融作用可能与下列过程有关：开始有人推测助融作用可能与下列过程有关：开始由于强烈的脱水而使原生质体粘在一起，并形由于强烈的脱水而使原生质

38、体粘在一起，并形成聚合体。原生质体收缩并高度变形，使原生成聚合体。原生质体收缩并高度变形，使原生质体之间的接触面增大，细胞膜结构发生紊乱，质体之间的接触面增大，细胞膜结构发生紊乱，从而加大了细胞膜的流动性，膜内的蛋白质和从而加大了细胞膜的流动性，膜内的蛋白质和糖蛋白相互作用和混合，使紧密接触的原生质糖蛋白相互作用和混合，使紧密接触的原生质体相互融合。体相互融合。. . 原生质体再生原生质体再生 原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞壁壁 ，恢复完整的细胞形态结构。，恢复完整的细胞形态结构。 不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，不同微生物的原生质体的最适

39、再生条件不同，甚至一些非常接近的种，最适再生条件也往往有甚至一些非常接近的种，最适再生条件也往往有所差别，如再生培养基成分及培养温度等。但最所差别，如再生培养基成分及培养温度等。但最重要的一个共同点是都需要重要的一个共同点是都需要高渗透压高渗透压。 能再生细胞壁的原生质体只占总量能再生细胞壁的原生质体只占总量的一部分。细菌一般再生率为的一部分。细菌一般再生率为3-10%3-10%。但有资料报道，在再生培养基中添加牛但有资料报道，在再生培养基中添加牛血清白蛋白，可使枯草杆菌原生质体的血清白蛋白，可使枯草杆菌原生质体的再生率达再生率达100%100%。真菌再生率一般在。真菌再生率一般在20-20-

40、80%80%。链霉菌再生率最高可达。链霉菌再生率最高可达50%50%。 为获得较高的再生率，在实验过程中应为获得较高的再生率，在实验过程中应避免因强力使原生质体破裂。避免因强力使原生质体破裂。 涂布时，原生质体悬液的浓度不宜过高。涂布时，原生质体悬液的浓度不宜过高。因为若有残存的菌体存在，它们将会率先因为若有残存的菌体存在，它们将会率先在再生培养基中长成菌落，并抑制周围原在再生培养基中长成菌落，并抑制周围原生质体的再生。生质体的再生。 另外，菌龄、再生时的温度、溶菌酶用另外，菌龄、再生时的温度、溶菌酶用量和溶壁时间等因素都会影响原生质体的量和溶壁时间等因素都会影响原生质体的再生。再生。. .

41、筛选优良性状融合重组子筛选优良性状融合重组子 原生质体融合后，来自两亲代的遗传原生质体融合后，来自两亲代的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代称物质经过交换并发生重组而形成的子代称为融合重组子。这种重组子通过两亲株遗为融合重组子。这种重组子通过两亲株遗传标记的互补而得以识别。如两亲株的遗传标记的互补而得以识别。如两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型传标记分别为营养缺陷型A+B-和和A-B+，融，融合重组子应是合重组子应是A+B+或或A-B-。 重组子的检出方法有两种：重组子的检出方法有两种：直接法直接法和和间接法间接法。 直接法直接法将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生将融合液涂布在不补充亲株生

42、长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子；重组子； 间接法间接法把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落上，使亲株和重组子都再生成菌落 ，然后用影印法将，然后用影印法将它们复制到它们复制到选择培养基选择培养基上检出重组子。上检出重组子。 从实际效果来看，直接法虽然方便，从实际效果来看，直接法虽然方便，但由于选择条件的限制，对某些重组子的但由于选择条件的限制，对某些重组子的生长有影响。虽然间接法操作上要多一步，生长有影响。虽然间接法操作上要多一步，但不会因营养关系限制

43、某些重组子的再生。但不会因营养关系限制某些重组子的再生。特别是对一些有表型延迟现象的遗传标记，特别是对一些有表型延迟现象的遗传标记，宜用间接法。宜用间接法。 若原生质体融合的两亲株带有抗药性若原生质体融合的两亲株带有抗药性遗传标记，可以用类似的方法筛选重组子。遗传标记，可以用类似的方法筛选重组子。 原生质体融合后，两亲株的基因组之间原生质体融合后，两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生多种多样的基有机会发生多次交换，产生多种多样的基因组合，从而得到多种类型的重组子，而因组合，从而得到多种类型的重组子，而且参与融合的亲株数不限于两个，可以多且参与融合的亲株数不限于两个，可以多至三、四个。这些

44、都是常规杂交育种不可至三、四个。这些都是常规杂交育种不可能达到的。能达到的。 以上获得的还仅仅是融合重组子，还需以上获得的还仅仅是融合重组子，还需要对它们进行生理生化测定及生产性能的要对它们进行生理生化测定及生产性能的测定，以确定它是否是符合育种要求的优测定，以确定它是否是符合育种要求的优良菌株。良菌株。1.2.4 1.2.4 基因育种基因育种 基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另个细胞的方

45、法。完整的基因克隆过程包括以下步骤完整的基因克隆过程包括以下步骤 获得待克隆的DNA片段（基因）； 目的基因与载体在体外连接； 重组DNA分子导入宿主细胞； 筛选、鉴定阳性重组子； 重组子的扩增与或表达。 目的基因的获取目的基因的获取. 通过建立基因文库分离靶基因 基因文库包括两类： 基因组文库：利用限制性内切酶。 cDNA文库：用mRNA反转录成单链DNA，再经DNA聚合酶的作用产生双链DNA。可去除真核生物基因中不表达的内含子。. 化学合成法制备DNA片段 从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传密码，再依照密码合成基因。. 聚合酶链反应法扩增基因片段 对于已知全部或部分核苷酸序列的基因，

46、可以通过聚合酶链反应（），以基因组DNA或cDNA模板扩增得到目的基因片段。PCRPCR技术技术 根据需扩增片段的两端设计引物。 使DNA解链（高温），引物结合于基因的两端（低温），在合适温度下开始合成（链延长）反应。 特点：需要很少的DNA模板，且能直接从基因组中得到目的基因。DNADNA扩增扩增PCRPCR反应反应 基因克隆载体基因克隆载体. . 载体应具备的条件：载体应具备的条件： 能在适当的宿主细胞中复制； 具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA插入； 具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子； 载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离； 对于

47、表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子等基因表达元件。宿主细胞必须符合以下条件宿主细胞必须符合以下条件 对载体的复制和扩增没有严格的限制； 不存在特异的内切酶体系降解外源DNA； 在重组DNA增殖过程中，不会对它进行修饰； 重组缺陷型，不会产生体内重组； 容易导入重组DNA分子； 符合重组DNA操作的安全标准。. . 常用载体常用载体质粒质粒质粒的特点质粒的特点 质粒的存在并非微生物生命活动必需。 每个细胞中存在的质粒数称为该质粒的拷贝数。不同类型的质粒其拷贝数各异，同一质粒在不同条件下，拷贝数也可能差异很大，有严紧型和松弛型两种。 质粒DNA分子常呈现三种形态；常见的一种是共价、

48、闭环状DNA(CCC DNA)；其次是由于条链有缺口而产生的开环DNA(ocDNA)；第三种是由双环分子两段均断裂而产生的线性DNA。质粒载体质粒载体 DNADNA分子体外连接分子体外连接 DNA片段的体外连接是重组DNA技术的关键。DNA连接是由DNA连接酶催化完成的。重组重组DNADNA中常用的工具酶中常用的工具酶 限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等.限制性内切酶限制性内切酶 切开DNA分子所需的酶：每一种酶都有其各自的作用位点。 常用限制性内切酶种类及特性限制性内切酶的剪切方式限制性内切酶的剪切方式 粘性未端：切开后的两段DNA各留下一个尾，这2个尾的核苷酸顺序完全

49、一样，中是方向相反。它们之间是互补的，在适当条件下可以再连接一起。DNADNA连接酶连接酶 DNA连接酶催化两条双链DNA片段相邻的5-磷酸和3-羟基间形成磷酸二酯键。 在分子克隆中最有用的的DNA连接酶是来自于T4噬菌体的DNA连接酶。 T4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于： A. 连接具有同源互补粘性末端的 片段； C. 在双链平端的DNA分子上添加合成的人 工接头,连接双链DNA分子间的平端. DNA体外重组 重组重组DNADNA导入宿主菌导入宿主菌 体外连接的重组DNA分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据所采用的载体的性质，将重组DNA分子导入受体可有不同的方

50、法。. . 转转 化化 指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态-即容易接受外源DNA的状态，然后利用短暂热休克使DNA导入宿主细菌中。 此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。操作步骤：质粒DNA转化感受态大肠杆菌1从琼脂平板上挑取新鲜菌落接入10ml肉汤培养基中，37培养过夜。2取0.5ml培养物接入50ml肉汤中，无菌添加0.4ml 2.5molLMgCl2，于37振荡培养。3将o.1molL CaCl2溶液、试管及吸管在冰浴中冷却。4当培养物OD600在0.50.8左右时，开始收获细胞(大约需22

51、.5h)5将培养物置冰浴中冷却10min。6取10ml培养物置2个冷离心管中弃去上清液。7加入1ml 0.1molL CaCl2，再加0.9ml CaCl2，置冰浴中放置20min。83000rmin离心10min，弃去上清液9加入1ml 0.1molL CaCl2，重新悬浮细胞，置冰浴中保存。10加入120l待转化质粒 DNA溶液。11在冰上放置20min，在37处理2min。再插入冰中加入0.9m1肉汤37静置培养90min。12以不同的量涂布选择培养基平板。13于37培养过夜。鉴定转化菌落。. . 感染和转染感染和转染 利用噬菌体DNA作为载体时可经两种方式导入受体菌。一种是感染，即在体

52、外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。另一种方式是转染，即在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。 重组克隆的筛选与鉴定重组克隆的筛选与鉴定 基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。 通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。. . 遗传学方法遗传学方法鉴定鉴定. . 抗药性标志的筛选抗药性标志的筛选 如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如apr或tcr ，转化后只有

53、含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，该标志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，还可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落。. . -半乳糖苷酶系统筛选半乳糖苷酶系统筛选 很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码-半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸(-肽)。 当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有-半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal 变为兰色化合物，这就是所谓的-互补。 而重组子由于基因插入使-肽基因失活，不能形成-互补，在含X-gal的平板上，含阳性重组子的细

54、菌为无色菌落或噬菌斑。. . 菌落快速裂解鉴定法菌落快速裂解鉴定法 从平板上直接挑选菌落裂解后，直接电泳检测载体质粒大小，判断有无插入片段存在，该法适于插入片段较大的重组子初筛。. . 内切酶图谱鉴定内切酶图谱鉴定 经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶切割，释放出插入片断鉴定。纯种分离方法纯种分离方法 （1 1）划线法：简单、快捷。）划线法：简单、快捷。 （2 2）稀释法：菌落单一均匀。）稀释法：菌落单一均匀。固体培养基四区划法接种法固体培养基四区划法接种法接种针先以火焰灭菌法灭菌接种针先以火焰灭菌法灭菌步骤一轻触营养平板上无菌的琼脂处冷轻触

55、营养平板上无菌的琼脂处冷却却步骤二以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。步骤三更换一个新的无菌营养平板更换一个新的无菌营养平板步骤四将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区此为第一菌区。步骤五步骤六重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。步骤七由第五步骤的第一区中划出第二由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上图。区，如右上图。步骤八重复第六以及第七步骤，由第七步骤的重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中划出第三区，

56、如右上图。第二区中划出第三区，如右上图。 步骤九重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营养平板，如右上图。的营养平板，如右上图。步骤十步骤十 在营养平板上贴好标签，标示好接种日在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及培养基期、操作者姓名、菌种学名以及培养基名称。名称。固体培养基的稀释涂抹接种法固体培养基的稀释涂抹接种法吸取准备好欲稀释的菌液吸取准备好欲稀释的菌液吸取充分均匀后的菌液吸取充分均匀后的菌液 取含有取含有 9mL9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌

57、。无菌水之试管，将试管口过火灭菌。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。将试管于震荡机上，使菌液混合均匀将试管于震荡机上，使菌液混合均匀 取出试管中的第一次十倍稀释菌液取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL1mL，加入另一个新的含加入另一个新的含9mL9mL无菌水的试管中。无菌水的试管中。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。 从最后稀释菌液中吸取从最后稀释菌液中吸取 0.1mL0.1mL菌液，菌液，置入准备好的无菌琼脂内。置入准备好的无菌琼脂内。将三角玻璃涂棒浸于酒精中将三角玻璃涂棒浸于酒精中 将三角玻璃棒在火焰上燃烧将三

58、角玻璃棒在火焰上燃烧（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧） 使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。数推算出菌液浓度。 生产性能的测定生产性能的测定 一般采用两步法：一般采用两步法： 初筛：以量为主初筛：以量为主 复筛：以质为主复筛：以质为主1.3 菌种的保藏菌种的保藏 在工业发酵生产中，对优良微生物菌种的保存和长期保藏，是十分重要的。1.3.1 1.3.1 理想的菌种保藏方法的基本要求理想的

59、菌种保藏方法的基本要求(1)经长期保藏后菌种存活健在；(2)保证高产突变株不改变表型和基因型，特别 是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产 的高产能力。1.3.2 1.3.2 工业微生物菌种保藏技术工业微生物菌种保藏技术 冷冻保藏 冻干保藏(3)其它保藏（传代保藏、载体保藏等）（1 1） 冷冻保藏冷冻保藏 冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。 通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速度。 冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。冷冻保藏种类冷冻保藏种类 普通冷冻保藏技术(-20)超低温冷冻保藏技术(-60一-80)液氮冷冻保藏技术 . . 普通冷冻保藏技术普通冷冻保藏技术(-20)(-20) 将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管内，然后于温度范围在-5-20的普通冰箱(-20)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养