感受态细胞的制备及重组质粒的转化汇编

1、experiments of molecular biology 分分：分离外源基因：分离外源基因目的基因。目的基因。切、接切、接：利用酶学：利用酶学方法，将外源基因方法，将外源基因与载体连接，形成与载体连接，形成复制子。复制子。转转：转化宿主细胞，：转化宿主细胞，使复制子可以扩增使复制子可以扩增复制。复制。筛筛：筛选含有目的：筛选含有目的基因的细胞基因的细胞( (转化子转化子) )并扩增以获得目的并扩增以获得目的基因克隆基因克隆。experiments of molecular biology “分子分子手术手术刀刀” “分子分子运输车运输车”“分子分子缝合针缝合针”“分子分子运输车运输车”

2、 experiments of molecular biology 受体细胞经过一些特殊方法（如：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能允许含有外源生变化，成为能允许含有外源DNA的载体分子的载体分子通过的细胞，即感受态细胞通过的细胞，即感受态细胞(competent cell) 。感受态细胞感受态细胞(competent cell) experiments of molecular biology 是将异源是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的

3、一种手段。获得新的遗传性状的一种手段。 转化是微生物遗转化是微生物遗传、分子遗传、基因传、分子遗传、基因工程等研究的基本实工程等研究的基本实验技术。验技术。experiments of molecular biology v 化学的方法化学的方法( (CaCl2法、热休克法法、热休克法) )：使用化学试：使用化学试剂（如剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热休克）制备的感受态细胞，通过热休克处理将载体处理将载体DNA分子导入受体细胞。分子导入受体细胞。v 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体态细胞，通过高压脉冲的作

4、用将载体DNA分子分子导入受体细胞。导入受体细胞。experiments of molecular biology v将处于对数生长期的细菌置入将处于对数生长期的细菌置入0的的CaCl2低渗溶液中，低渗溶液中，使细胞膨胀，同时使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域；得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域；v此时加入此时加入DNA，Ca2+又与又与DNA结合形成抗结合形成抗DNase的羟基的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；v经短暂的经短

5、暂的42热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。分子便趁机进入细胞内。experiments of molecular biology v转化过程所用的受体细胞一般是限制转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体。变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体。vCaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般

6、实验的要求。行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求。v制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积 15-30的无菌甘油于的无菌甘油于-70保存保存(半年半年)。experiments of molecular biology 影响影响因素因素细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度杂菌和其它外源杂菌和其它外源 DNA 的污染的污染载体载体DNA及重组及重组DNA受体细胞受体细胞试剂的纯度和试剂的纯度和器皿的洁净度器皿的洁净度转化操作转化操作experiments of molecular biology 实验原理实验原理v 本实验以本实验以E.co

7、li JM109菌株为受体细胞，并用菌株为受体细胞，并用CaCl2处理使其处于处理使其处于感受态，然后与感受态，然后与pMD19-T-X重组质粒共保温，实现转化。由于重重组质粒共保温，实现转化。由于重组质粒带有氨苄青霉素抗性基因组质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过，可通过Amp抗性来筛选转抗性来筛选转化子。化子。v 如受体细胞没有转入如受体细胞没有转入pMD19-T-X重组质粒，则在含重组质粒，则在含Amp的培养基的培养基上不能生长。上不能生长。v 能在含能在含Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）已导入了重组质粒。培养基上生长的受体细胞（转化子）已导入了重组质粒。experim

8、ents of molecular biology experiments of molecular biology 实验实验仪器仪器、材料材料1 超净工作台超净工作台2 高速离心机高速离心机3 恒温摇床恒温摇床4 恒温培养箱恒温培养箱5 恒温水浴锅恒温水浴锅6 制冰机制冰机7 移液移液枪枪experiments of molecular biology 1大肠杆菌大肠杆菌JM109菌株菌株2重组质粒重组质粒31.5mL 离心管离心管，Tip头头4试管、培养皿试管、培养皿1 LB液体培养基液体培养基2含有含有Amp的的LB平板培养基平板培养基（终浓度为终浓度为50gmL）3氨苄青霉素贮存液氨苄

9、青霉素贮存液（浓度浓度50mgmL）40.1mol/L CaCl2溶液溶液experiments of molecular biology 1受体菌的培养受体菌的培养感受态细胞的制备感受态细胞的制备23质粒向感受态大肠杆质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化菌细胞的转化实验实验安排安排experiments of molecular biology 从新活化的从新活化的E.coli JM109平板上挑取一单菌落，接种于平板上挑取一单菌落，接种于3ml LB液体培养中，液体培养中，37振荡培养振荡培养12h左右，直至对数生左右，直至对数生长期。（已做）长期。（已做） 将该菌悬液以将该菌悬液以1:50转接

10、于转接于50ml LB液体培养基中，液体培养基中，37 250rpm振荡扩大培养约振荡扩大培养约1-2h，当，当OD600nm值为值为0.30.5时，取出置冰浴。时，取出置冰浴。experiments of molecular biology 1、取取1mL菌液于菌液于1只只1.5mL离心管中，置冰浴离心管中，置冰浴5min，10000rpm离心离心 1min （每班需做对照管至少（每班需做对照管至少1管）（从这一步开始，所有操作均管）（从这一步开始，所有操作均在在冰上冰上进行，进行，速度尽量快而稳速度尽量快而稳） ；2、弃上清弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸上，每管加入，将离心管倒置于干净吸

11、水纸上，每管加入0.5mL冰预冷冰预冷 的的0.1mol/L CaCl2悬浮悬浮细菌，置冰浴细菌，置冰浴10min；3、4000rpm离心离心10min，弃上清弃上清；4、每管加入、每管加入50L冰冰预预冷冷的的0.1mol/L CaCl2悬浮悬浮细菌，冰上放置，细菌，冰上放置， 即为感受态细胞。即为感受态细胞。experiments of molecular biology 1、实验管加、实验管加5L重组质粒重组质粒DNA，对照管加，对照管加5L灭菌灭菌水，水，轻轻轻轻 混匀混匀，置冰浴，置冰浴20min；2、42水浴水浴热应激热应激90s（精确计时精确计时），迅速放回冰浴，冷却，迅速放回冰

12、浴，冷却 5min后加入后加入1mL LB液体液体培养基培养基（不含（不含Amp），37 250rpm振荡振荡培养约培养约1h；3、取、取50L菌液菌液均匀涂布均匀涂布在在LB琼脂平板上（含琼脂平板上（含50g/mL Amp， 事先做好事先做好），），37培养过夜培养过夜（12-16h）后）后观察结果。观察结果。切记：切记：玻璃棒经玻璃棒经酒精灯烧过后稍酒精灯烧过后稍微凉一下再用，微凉一下再用，不要过烫！不要过烫！experiments of molecular biology 以同体积的灭菌双蒸水代替重组质粒，其它操以同体积的灭菌双蒸水代替重组质粒，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生

13、素（作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素（Amp）的的LB琼脂平板上应没有菌落出现。琼脂平板上应没有菌落出现。experiments of molecular biology v 感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速（所有操作率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速（所有操作均应在冰上进行均应在冰上进行）。v 为减少对细胞的机械损伤，操作时动作一定要轻柔。为减少对细胞的机械损伤，操作时动作一定要轻柔。v 菌液涂布操作时应避免反复来回涂布，过多的机械挤压菌液涂布操作时应避免反复来回涂布，过多的机械挤压