《医学第七组》ppt课件

1、生技大实验综合展现生技大实验综合展现第七组组员1.单元一:目的基因的提取2.单元二:目的基因的衔接转化及重组子挑选3.单元三:重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达4.单元四:重组蛋白的分别纯化及检测实验内容：实验内容：实验原理实验原理 1.总RNA的提取：RNA的提取普通是用强变性剂使蛋白质和DNA变性，利用有机溶剂抽提去掉蛋白质、多糖等；最后在RNA沉淀剂的作用下，分别出RNA。 2.琼脂糖凝胶电泳：核酸分子带负电，在电场中向正极挪动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，主要具有分子筛效应。 3.逆转录PCR：RNADNADNA逆转录酶PCR扩增单元一：目的基因的提取单元一：目的基因的提取实验结果实验

2、结果1紫外分光光度法测定RNA浓度：1.A260/A280=1.82.0最正确2.C (ug/ml) = A26040稀释倍数3个样本的RNA纯度较高，实验过程未出现污染均在均在2000ng/L以上且分布以上且分布较为均匀，较为均匀，阐明阐明RNA的的提取较为充提取较为充分，且研磨分，且研磨后样本的分后样本的分装较为平均装较为平均 电泳检测RNA完好性1.三条明显的亮带2.28S和18S rRNA处为明显的亮带，5S rRNA带的亮度那么较弱3.28S/18S 约为2:11号样品的条带相对号样品的条带相对2号和三号号和三号亮度较弱，缘由能够是分装斑亮度较弱，缘由能够是分装斑马鱼粉末时马鱼粉末时

3、1号管的量最少，号管的量最少，导致其导致其RNA的总量也较少的总量也较少 RT-PCR琼脂糖凝胶电泳1号样品中出现了两条带，分号样品中出现了两条带，分析缘由能够是在析缘由能够是在1.样品中含样品中含有其他有其他DNA 2.PCR产物构产物构成了不同的构象。成了不同的构象。3号样品出现了细微拖带的景象，号样品出现了细微拖带的景象，缘由能够是：缘由能够是：1.电泳缓冲液失效电泳缓冲液失效 2.反响试剂或耗材中存在核酸酶反响试剂或耗材中存在核酸酶导致核酸部分降解导致核酸部分降解 3.拍照前放置拍照前放置时间过长。时间过长。单元二：目的基因的衔接、转化及重组子挑单元二：目的基因的衔接、转化及重组子挑选

4、选实验内容：实验内容：1.cDNA的的TA克隆克隆2.重组质粒转化大肠杆菌重组质粒转化大肠杆菌3.质粒酶切鉴定插入片段质粒酶切鉴定插入片段实验原理：实验原理：1.TA克隆2.感受态细胞制备、质粒转化3.蓝白斑挑选胶回收DNA感受态细胞制备测OD挑选2号DNA正 负感受态细胞vector、solutionTA克隆vector转化蓝白斑挑选实验步骤：实验步骤：随机挑选1、2、3、4号白色阳性菌落，进展菌落PCR鉴定随机挑选上述过夜培育的1、2号菌落，进展双酶切鉴定双酶切鉴定菌液SolutionEDTA、RNaseASolutionNaOHSolution中和1.提取质粒2.双酶切10Buffer

5、，Kpn I 、Xbal I 、灭菌水灭火65 水浴中10min3.电泳琼脂糖凝胶电泳结果实验结果实验结果1.蓝白斑挑选LB/Amp/IPTG/X-Gal平板 空载质粒的摩尔数=310-15mol 插入DNA片段的摩尔数=1.93310-12mol 空载质粒的摩尔数：插入DNA片段的摩尔数1:1000，该比值远小于1:2到1:10的范围，待插入DNA片段过多，当时未稀释待插入DNA，直接进展了转化实验，导致实验组和对照组菌落密度偏大。 空载质粒转化效率计算如下： 1l5ng/l即5ng的质粒参与2号100l 感受态细胞EP管中，取50l加LB/Amp/IPTG/X-Gal平板，最后参与玻璃珠，

6、摇动混匀涂布平板，第二天记录蓝色菌落合计6000，此时转化效率=6000cfu/ 5ng=2.4103cfu/ng=2.4106cfu/g质粒110050 2.菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳 Marker 1 2 3 4 bp20001000750500250100 3.KpnI / Xba I 双酶切琼脂糖凝胶电泳表示图 Marker 1 2 bp 2000 1000 750 500 250 100单元三单元三 重组重组DNA在大肠杆菌中的在大肠杆菌中的诱导表达诱导表达实验原理实验原理乳糖支配子的调控机制乳糖支配子的调控机制 实验流程实验流程1 23 4菌体活化菌体活化、放大、放大诱导诱导收菌

7、收菌紫外灯察紫外灯察看、超破看、超破紫外灯下紫外灯下UV365nm1# -5#管察看结果管察看结果 实验结果实验结果实验结果分析实验结果分析 1#为阴性对照组，所用工程菌并不含有为阴性对照组，所用工程菌并不含有GFP序列，故不能序列，故不能表达荧光蛋白，紫外灯下无荧光。表达荧光蛋白，紫外灯下无荧光。 2#未参与未参与IPTG和葡萄糖，但其培育基中含有乳糖，故和葡萄糖，但其培育基中含有乳糖，故2#中中存在异构乳糖的诱导效应，不存在葡萄糖降解物阻遏效应存在异构乳糖的诱导效应，不存在葡萄糖降解物阻遏效应，又因乳糖含量较低，又因乳糖含量较低，2#出现微弱的荧光。出现微弱的荧光。 3#培育过程中同时参与

8、了培育过程中同时参与了IPTG和葡萄糖，故大肠杆菌细胞和葡萄糖，故大肠杆菌细胞优先利用葡萄糖，优先利用葡萄糖，GFP的表达被抑制，无荧光。的表达被抑制，无荧光。 4#培育中参与了培育中参与了IPTG，无葡萄糖，无葡萄糖，IPTG耐久诱导耐久诱导GFP的表的表达产生大量的绿色荧光蛋白，故达产生大量的绿色荧光蛋白，故4#发出非常明显的荧光。发出非常明显的荧光。 5#为为4#第三次离心的上清液，无荧光。缘由是实验中采用第三次离心的上清液，无荧光。缘由是实验中采用原核细胞表达系统，外源基因的表达产物往往在胞浆中聚原核细胞表达系统，外源基因的表达产物往往在胞浆中聚集构成均一密度的包涵体，三次离心后细胞沉

9、在底部，上集构成均一密度的包涵体，三次离心后细胞沉在底部，上清液中没有或极少细胞，故无荧光。清液中没有或极少细胞，故无荧光。单元四单元四 重组蛋白的分别纯化及检测实验原理实验原理1.亲和层析:以普通凝胶作载体，衔接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分别纯化蛋白质，这种方法称为金属螯合亲和层析。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳:由丙稀酰胺单体acrylamide)和交联试剂N，N甲叉双丙稀酰胺N,N-methylene bisacrylamide)在催化剂存在的情况下聚合而成的三维网状构造的凝胶，改动单体的浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径大小的凝胶。本实验采用化学聚合法制胶，进展不延续电泳，并用考马斯亮蓝

10、快速染色，以分别和鉴定纯化的蛋白产物。3.western blot:蛋白质样品经 SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带经过电泳方法转移、固定到载体如尼龙膜、硝酸纤维素膜、PVDF膜上；然后以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体和酶标志的第二抗体反响，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中培育，显出谱带，即可检测出样品中的特异组分。 PAGE胶配置、保胶配置、保管每组配两块管每组配两块Western-blot检测检测10月月31日日10月月31日日亲和层析亲和层析SDS-PAGESDS-PAGE转移转移封锁封锁 1抗抗 过过 夜夜2抗抗显色显色11月月1日日11月月2日

11、日染色、脱色过夜染色、脱色过夜察看结果、拍照察看结果、拍照配置western-blot用试剂实验流程实验流程1.亲和层析加缓冲液加50mmol/L咪唑加300mmol/L咪唑第一、二个峰是没能结合到柱子上的杂蛋白质，第三个峰为虽然结合到柱子上，但是结合不严密的杂蛋白，第四个峰为我们需求的目的蛋白绿色荧光蛋白。实验结果实验结果2.SDS-PAGE凝胶电泳170130 95 72 55 43 34 26 17 10pGFP未诱导MpGFP加Glu及IPTGpGFP加IPTG诱导离心上清层析穿流峰50mM咪唑洗脱300mM咪唑洗脱KD 从上图可以看出，marker条带位于最左端，marker泳道中1

12、0KD和17KD两条带几乎重合，但还是可以看出上面的蓝色及下方的绿色条带； 7号泳道GFP条带最深最宽，位于26-34KD左右，该结果与其约27KD的分子量相符，其条带又深又宽，与其经过300mM咪唑洗脱纯化的实验过程相符； 6号泳道为经50mM咪唑洗脱，可以看出许多其他条带及隐约的一条GFP条带，证明有少量GFP被洗脱； 5号泳道为杂蛋白，为层析时的穿流峰，含有许多不同分子量的条带，但不含GFP； 4号泳道为离心上清，由于超破后离心，上清中含有许多蛋白，包括GFP，因此电泳结果中不仅含杂蛋白，也含GFP； 1、2、3号泳道分别为重组大肠杆菌GFP的本底程度表达、葡萄糖降解物阻遏效应后的表达及

13、诱导表达，因此只需3号泳道有GFP的出现，当然，1、2、3号泳道还有其他杂蛋白的表达，上图中可以看出几条隐约出现的细细的条带。3.Western-Blot170130 95 72 55 43 34 26 17 10 M 1 2 1号泳道是离心上清，2号泳道是300mM咪唑洗脱蛋白。50mM咪唑洗脱蛋白和穿流峰洗脱蛋白被不幸剪掉。 可以明显看到目的蛋白，在26KD和34KD之间。从上图可以看出，剪膜时出现过失，将3、4号泳道剪掉，缘由是marker并非点在最左端，为方便标志分子量图中未画出PVDF膜左侧的膜，因此剪膜时对点样在marker左侧还是右侧判别失误，当时以为点样在左侧，结果将右侧PVDF膜剪掉，因此错失了3、4泳道的条带。从上图中只可以看出marker、1号泳道全部条带及2号泳道部分条带，marker泳道中10KD和17KD两条带几乎重合，但还是可以看出上面的蓝色及下方的绿色条带；1号泳道鉴定的是离心上清中的可溶蛋白，可以看出只含GFP一条带，约在26-34KD之间，与其实践分子量27KD相符，由于离心上清中有许多其他蛋白，而蛋白印迹