第十一章 动物基因工程

1、2 第一节 基因工程概述 理论上的三大发现理论上的三大发现vDNA为遗传物质：为遗传物质：Avery的肺炎双球菌转化实的肺炎双球菌转化实验验vDNA双螺旋结构的发现和双螺旋结构的发现和DNA半保留复制机制半保留复制机制v遗传密码与中心法则遗传密码与中心法则3技术上的三大发明技术上的三大发明1.限制性内切酶和连接酶：限制性内切酶和连接酶：DNA的的“手术刀手术刀”与与“缝纫机缝纫机”2.载体：运送遗传物质的工具，如质粒、病毒载体：运送遗传物质的工具，如质粒、病毒等等3.逆转录酶：从逆转录酶：从mRNA到到 DNA，使真核基因，使真核基因制备成为可能制备成为可能123、基因工程的内容、基因工程的内

2、容v目的基因的获得目的基因的获得v目的基因与载体的连接成重组目的基因与载体的连接成重组DNA分子分子v重组重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞v筛选重组克隆筛选重组克隆 v基因表达与产物分离基因表达与产物分离13基因操作中的工具酶基因操作中的工具酶手术刀手术刀限制性核酸内切酶、核酸外切酶限制性核酸内切酶、核酸外切酶缝纫机缝纫机连接酶连接酶复印机复印机DNA聚合酶、逆转录酶聚合酶、逆转录酶第二节第二节 基因操作中的工具酶基因操作中的工具酶14第三节第三节 基因工程的载体基因工程的载体 将外源将外源 DNA 或基因携带入宿主细胞（或基因携带入宿主细胞（host cell）的工具称为载体。的工

3、具称为载体。 一、基因工程载体的概念：一、基因工程载体的概念：15二、基因工程载体的分类：二、基因工程载体的分类： 基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增、基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增、传代乃至表达。传代乃至表达。目前已构建应用的基因工程载体主要有目前已构建应用的基因工程载体主要有质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体病毒载体病毒载体人工构建的组合载体人工构建的组合载体16一、一、 细菌质粒载体细菌质粒载体质粒介绍：质粒介绍： 质粒质粒 (plasmid)是是能自主复制的双链环状能自主复制的双链环状DNA分分子子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，它们在细菌中以独立于染色体之外

4、的方式存在，一个质粒就是一个一个质粒就是一个DNA分子，其大小可从分子，其大小可从1 kb到到300 kb 。质粒广泛存在于细菌之中，在某些蓝藻、绿藻和真菌质粒广泛存在于细菌之中，在某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。细胞中也存在质粒。质粒质粒DNA的特点为：的特点为：（1）双链环状；）双链环状；（2）分子量很小；）分子量很小；（3）自主或半自主复制；）自主或半自主复制；（4）不同生物质粒中的基因种类不同。）不同生物质粒中的基因种类不同。17二、质粒载体的种类二、质粒载体的种类 （一）克隆载体（一）克隆载体 克隆载体主要用于扩增或保存克隆载体主要用于扩增或保存 DNA 片片段，是最简单的载体

5、。段，是最简单的载体。 克隆克隆载体必须具备的基本条件：载体必须具备的基本条件：具有复制起点具有复制起点具有抗菌素抗性基因具有抗菌素抗性基因具有若干个限制酶单一识别位点具有若干个限制酶单一识别位点具有较小的分子量和较高的拷贝数具有较小的分子量和较高的拷贝数18噬菌体噬菌体 噬菌体内含双链环形、单链环形、双链线形、单链线噬菌体内含双链环形、单链环形、双链线形、单链线形等多种形式、大小不一的形等多种形式、大小不一的DNA，最常见的是双链，最常见的是双链线形线形DNA, 且感染率高。且感染率高。 0.02 - 0.3 m二、二、 噬菌体噬菌体(Bacterophage)载体载体19 噬菌体噬菌体27

6、5,000, Scanning electron 20基因工程的主要目的是通过基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因优良性状相关基因的的重重组组，获得具有高度应用价值的，获得具有高度应用价值的新物种新物种。为此，须从现。为此，须从现有生物群体中，根据需要分离出可用于克隆的此类基有生物群体中，根据需要分离出可用于克隆的此类基因。这样的基因通常称之为因。这样的基因通常称之为目的基因目的基因。目的基因主。目的基因主要是要是结构基因结构基因。目的基因：目的基因： 纯度很高纯度很高 片断大小适于重组操作片断大小适于重组操作 第四节第四节 获得真核生物目的基因的方法获得真核生物目的基因的方法21目的基因

7、的获得方法目的基因的获得方法 分离分离 化学合成化学合成 22一、利用一、利用PCR法获取目的基因法获取目的基因1.PCR:polymerase chain reaction,聚合酶链聚合酶链式反应，是式反应，是80年代发展起来的新技术，是通过模拟年代发展起来的新技术，是通过模拟体内体内DNA复制的方式，在体外选择性地将复制的方式，在体外选择性地将 DNA 某某个特殊区域扩增出来的技术。个特殊区域扩增出来的技术。 摘要：摘要： 其过程与其过程与 DNA 复制一样有复制一样有三个步骤：模板变三个步骤：模板变 性，引物与模板复性，延伸。性，引物与模板复性，延伸。 232、PCR 扩增，主要的是引物

8、设计，引物设计扩增，主要的是引物设计，引物设计需要遵循一定的原则。需要遵循一定的原则。3、用于、用于 PCR 的的 DNA 聚合酶种类很多，性质聚合酶种类很多，性质各异，可以满足不同的实验需要。各异，可以满足不同的实验需要。4、 PCR 技术应用广泛，可以通过技术应用广泛，可以通过 A/T 克隆、克隆、 UDG 克隆等方法介导克隆，还可以通过同克隆等方法介导克隆，还可以通过同源重组、源重组、 重叠延伸等方法介导定点诱变。反重叠延伸等方法介导定点诱变。反向向 PCR ，反转录，反转录 PCR 在基因操作中也扮在基因操作中也扮演了重要角色。演了重要角色。 PCR 技术还广泛应用于鉴技术还广泛应用于

9、鉴定、诊断等领域。定、诊断等领域。 24（一（一 ） PCR 的基本原理的基本原理 1基本要素和扩增原理基本要素和扩增原理 基本要素与基本要素与DNA复制的基本要素是一致的。复制的基本要素是一致的。待拷贝的待拷贝的 DNA 称为模板，它可以是双链称为模板，它可以是双链 DNA 也可是单链也可是单链DNA，最后扩增得到的产物是双链，最后扩增得到的产物是双链状态的。引物是状态的。引物是 DNA 复制的先锋，就象结晶过复制的先锋，就象结晶过程中的晶核，引导程中的晶核，引导 DNA 的合成。在的合成。在 PCR 扩增扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。中一般使用合成的寡核苷酸作引物。DNA 聚合聚合酶

10、是酶是 DNA 复制的动力，在复制的动力，在 dNTP 等底物存在等底物存在时在引物的引导下沿着模板时在引物的引导下沿着模板 DNA 合成互补的合成互补的 DNA 链。链。 252PCR 扩增的步骤扩增的步骤 首先将模板首先将模板 DNA 置于置于 92 -96，进行，进行变性变性（denaturation）处理，使）处理，使 dsDNA 在在高温下解链成为高温下解链成为 ssDNA ，且热变性不改变其化，且热变性不改变其化学性质；然后学性质；然后退火退火（annealing） ，将温度降，将温度降至至 37 -72，使引物与模板的互补区相结合；，使引物与模板的互补区相结合；最后，在最后，在

11、72 条件下，条件下， DNA 聚合酶将聚合酶将 dNTP 连续加到引物的连续加到引物的 3-OH 端，合成端，合成 DNA ，这个步骤称为这个步骤称为延伸延伸（extension）。这三个热）。这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过反应过程的重复称为一个循环，经过 20-40 个个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的 DNA 片段。片段。 27PCR28PCR：变性退火延伸变性退火延伸29（三）（三） PCR反应程序反应程序 1常规程序常规程序预变性预变性 : 94-96 几十秒至几分钟几十秒至几分钟变性：变性：94 、 30 秒钟秒钟退火：退火

12、：50-65 、30 秒钟；秒钟； 2535 次循环次循环延伸：延伸： 72 、 1 分钟分钟72 保持保持 3-7min4 保存保存302复性（退火）和延伸温度复性（退火）和延伸温度 复性的温度是复性的温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因扩增是否顺利的关键因素，通常在素，通常在 50-60 之间。具体的温度主要由之间。具体的温度主要由引物的引物的 Tm 值决定。延伸温度绝大多数设定为值决定。延伸温度绝大多数设定为 72 。如果复性的温度很高，可以将延伸温度。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法和复性温度设置成同一温度，变成二步法 PCR 。 313反应时间反

13、应时间 变性步骤一般使用变性步骤一般使用 30 秒钟，如果模板的秒钟，如果模板的 G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有间可适当延长。复性时间有 30 秒种一般是足够秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用 1kb 用用 1 分钟来保证充足的时间。分钟来保证充足的时间。 324循环次数循环次数 v循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为贝数为 104105 数量级时，循环数通常为数量级时，循环数通常为 2535 次。次。

14、v平台效应（平台效应（plateau effect）：）：PCR 扩增过程扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP 和和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低聚合酶的稳定性或活性降低 ，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。 33（五）（五） 循

15、环条件的设定循环条件的设定1、变性、变性2、退火、退火3、延伸、延伸4、循环次数、循环次数34（六）（六） 引物设计原则引物设计原则通用原则：通用原则：1、引物长度：、引物长度：1530Nt为宜为宜2、引物碱基尽可能随机分布、引物碱基尽可能随机分布3、引物内部不应自身形成二级结构、引物内部不应自身形成二级结构4、两个引物之间不能形成互补结构、两个引物之间不能形成互补结构5、引物、引物3末端与模板配对末端与模板配对35RT-PCR36第七节第七节 转基因技术转基因技术（Transgenic technology）37 转基因与转基因动转基因与转基因动物物速生长效应的速生长效应的“转基因超级鼠转基

16、因超级鼠”。转基因鼠。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快比与它同胎所生的小鼠生长速度快2 23 3倍，体积倍，体积大一倍。大一倍。1982年，英国的年，英国的自然自然杂志发表了一篇文杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠大鼠 生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中,培育出具快速生长效应的培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快23倍，体积大一倍。倍，体积大一倍。38转基因：转基因：1）将人工分离和修饰过的基因导入

17、到生物体基因组中，由）将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，称之为转基因技术。称之为转基因技术。2）转基因技术就是指利用分子生物学技术，将某些生物的）转基因技术就是指利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到其它物种中，改造生物的遗传物质，使遗传物基因转移到其它物种中，改造生物的遗传物质，使遗传物质得到改造的生物在性状、营养和消费品质等方面向人类质得到改造的生物在性状、营养和消费品质等方面向人类需要的目标转变。需要的目标转变。转基因动物：转基因动物： 所谓转基因动物就是指以实验方法将外

18、源基因导入动所谓转基因动物就是指以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。一、概念一、概念391、显微注射法：、显微注射法：将将DNA注射到胚胎的细胞核内，注射到胚胎的细胞核内，再把注射过再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。育成正常的幼仔。 2、体细胞核移植方法：、体细胞核移植方法：先在体外培养的体细胞中进先在体外培养的体细胞中进行基因导入并筛选。然后将带转基因体细胞移植到行基因导入并筛选。然后将带转基因体细胞移植到去掉细胞核的卵细胞中，生产重构胚胎。去掉细胞

19、核的卵细胞中，生产重构胚胎。转基因的方法转基因的方法40Microinjection of DNA in to the nucleus of a recently fertilized egg.The egg is held in place by a suction pipette shown at the bottom, while the injection pipette is shown penetrating the egg at the top.Transgenic mice. This photograph shows a pair of littermates at age

20、10 weeks. The larger mouse developed from an egg that had been injected with DNA containing the rat growth hormone gene placed downstream from a metal lothioein promoter. The larger mouse weights 44g; the smaller, uninjected control weighs 413逆转录病毒感染法：逆转录病毒感染法：最早用来得到转基因小鼠的方法，最早用来得到转基因小鼠的方法，利用逆转录载体将遗

21、传信息以利用逆转录载体将遗传信息以RNA分子的形式，在逆转分子的形式，在逆转录整合酶和逆转录基因组末端的特异性核酸序列的作用下，录整合酶和逆转录基因组末端的特异性核酸序列的作用下，反转录并整合到宿主基因组中去，最终得到转基因小鼠。反转录并整合到宿主基因组中去，最终得到转基因小鼠。4胚胎干细胞法：胚胎干细胞法：将转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，将转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，可参与嵌合体的形成，将来出生的动物的生殖系统就有可可参与嵌合体的形成，将来出生的动物的生殖系统就有可能整合上外源基因，通过杂交繁育得到纯合目的基因的个能整合上外源基因，通过杂交繁育得到纯合目的基因的个体，即为转基因动物

22、。体，即为转基因动物。42 1、研究基因的结构与功能，了解动物生命现象、研究基因的结构与功能，了解动物生命现象的内在本质。的内在本质。 2、建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及、建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及治疗方法。治疗方法。 3、改善动物生产性能，提高动物育种效率。、改善动物生产性能，提高动物育种效率。 4、作为医用或食用蛋白的生物反应器。可以通、作为医用或食用蛋白的生物反应器。可以通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白。药用蛋白。转基因动物的应用前景转基因动物的应用前景43 生物反应器是指利用转基因活体动物的某生物反应器是指利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来进行种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来进行工业化生产活性功能蛋白的技术，这些蛋白一工业化生产活性功能蛋白的技术，这些蛋白一般是药用蛋白或营养保健蛋白。般是药用蛋白或营养保健蛋白。什么是生物反应器？什么是生物反应器？44生物反应器的种类及应用生物反应器的种类及应用 用于表达的生物反应器包括动物血液、泌用于表达的生物反应器包括动物血液、泌尿系统、精囊腺、乳腺等，还包括禽蛋和昆虫尿系统、精囊腺、乳腺等，还包括禽蛋和昆虫（例如家蚕