层析原理与技术

1、 1 2021-7-29 2 2021-7-29内容提要内容提要1、层析原理与技术、层析原理与技术2、层析方法、层析方法凝胶过滤层析凝胶过滤层析离子交换层析离子交换层析羟基磷灰石层析羟基磷灰石层析疏水层析疏水层析亲和层析亲和层析 3 2021-7-29 层析的起源和原理层析的起源和原理 起源-1906年，俄国植物学家Tsweet 原理-利用物质分配系数不同达到分离 目的0.050.0100.0% Buffer B-0.0100.0000.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0800.0900.100-0.0500.0000.0500.1000.1500.200

2、0.2500.3000.3500.4000.4500.50000:00:0001:00:0002:00:00FractionsHr:Min:SecVoltsAU层析原理层析原理Chromatography层析层析色谱色谱 4 2021-7-29什么是蛋白层析什么是蛋白层析 根据蛋白分子物理化学特性的不同而达到分离 极性/疏水性：polarity (solubility, volatility) HIC, RP 离子特性：ionic characteristics (charge) IEX 大小与形状：size/mass (diffusion, sedimentation) GF 结构特征与活性

3、位点：shape (ligand binding, affinity) AC 这些特性的区别使不同蛋白质分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离层析原理层析原理 5 2021-7-29分离机制 分子的大小分子的大小-凝胶过滤凝胶过滤(size-exclusion)（分子筛，分子（分子筛，分子 排阻）排阻） 分子的电性分子的电性-离子交换（离子交换（IEC）阳离子交换、阴离子交换）阳离子交换、阴离子交换 分子的表面疏水结构分子的表面疏水结构-疏水层析（疏水层析（HIC），反相），反相 其它：羟基磷灰石，金属螯合其它：羟基磷灰石，金属螯合(IMAC)，亲和，染料配基介质层析，亲和，染料配基介

4、质层析 精制（精制（polishing）：高分辨率层析）：高分辨率层析 分离机制分离机制 6 2021-7-29层析的基本概念层析原理层析原理 7 2021-7-29层析的基本概念固定相：固定相是层析的一个基质 ，能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。（在柱层析中称其为层析填料。）它对层析的效果起着关键的作用。 层析原理层析原理流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体等。（柱层析中一般称为洗脱剂。）A good gel for gel filtration contains about 95% water 8 2021-7-29凝胶过滤层析凝胶过滤层析

5、离子交换层析离子交换层析羟基磷灰石层析羟基磷灰石层析疏水层析疏水层析亲和层析亲和层析 9 2021-7-29GelFiltration凝胶过滤IonExchange离子交换Hydrophobic Interaction疏水层析Affinity亲和层析 CHT羟基磷灰石层析原理层析原理 10 2021-7-29凝胶过滤层析凝胶过滤层析/分子筛分子筛 11 2021-7-29 分子筛层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。 具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。凝胶过滤凝胶过滤 12 2021-7-2

6、91. Spherical particles packed into a column2. Sample applied3.Buffer mobile phase and sample move through column, molecules diffuse in and out of matrix4. large molecules leave the column first followed by smaller molecules in order of size, molecules larger than the matrix pores pass straight thro

7、ugh.DiffusionBufferDiffusion into the poresDiffusion out of the poresBuffer凝胶过滤凝胶过滤 13 2021-7-29凝胶过滤层析凝胶过滤层析分离纯化原理分离纯化原理 14 2021-7-29Steric exclusion leads to early elution 按照分子量大小洗脱按照分子量大小洗脱 大分子首先洗脱，最小的分子在最后面大分子首先洗脱，最小的分子在最后面洗脱洗脱 15 2021-7-29 100 1,000 10,000 100,000 Bio-Gel P2Bio-Gel P4Bio-Gel P6B

8、io-Gel P10Bio-Gel P30Bio-Gel P60Bio-Gel P1001,8008004,0001,0006,000，用于脱盐用于脱盐1,50020,0002,50040,0003,00060,0005,000100,000100凝胶过滤层析凝胶过滤层析凝胶的选择凝胶的选择 16 2021-7-29柱长的选择柱长的选择 分离：30120cm 脱盐：30cm以下 洗脱液洗脱液 离子强度低高离子作用 排阻作用（0.1-0.5M) 疏水作用 pH中性中性流速，流速，根据层析介质的说明，一般很低样品容量样品容量：13CV凝胶过滤层析凝胶过滤层析操作参数选择操作参数选择 17 2021

9、-7-29 1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质可分离相对分子量从几百到几十万的物质 具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/30 2.脱盐脱盐凝胶过滤层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析的应用凝胶过滤层析的应用 18 2021-7-29凝胶过滤层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析的特点：凝胶过滤层析的特点：1. 层析柱规模很大，实验室1.0-2.530-100cm，工艺1020200cm，从而设备成本很高；2. 上样体积少，必须少于柱床体积的3才能达到较好的分离效果，如果大体积样

10、品必须浓缩，从而造成样品的损失和增大工艺的复杂性；3. 工艺时间（生产周期）长，甚至24小时或以上；4. 分辨率低；5. 不需摸索纯化条件，按照分子量区带分离因此，往往用分子筛分离时只适用于纯化的最后一步，或离子交换上样前的脱盐 19 2021-7-29离子交换层析离子交换层析 20 2021-7-29 离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。离子交换层析离子交换层析 21 2021-7-29cationweakstronganionweakstrongDEAEDiethylamino-ethylQ Quater

11、nary amineCMCarboxy-methylSSulfonate离子交换层析离子交换层析离子交换层析类型及其选择离子交换层析类型及其选择-O-CH2CH2-NH+C2H5C2H5-N+(CH3)3-O-CH2-C-O-O-SO3- 22 2021-7-29pIstability rangestability range与阳离子交换与阳离子交换介质结合介质结合+-denaturationdenaturationpH102离子交换层析离子交换层析离子交换层析原理离子交换层析原理蛋白质滴定曲线蛋白质滴定曲线蛋白质净电荷蛋白质净电荷与阴离子交换与阴离子交换介质结合介质结合 23 2021-7-

12、29Products:UNOsphere Q & S, Macro-Prep High Q & S, CM, DEAE, AG resinsEquilibrationSampleApplicationSampleAdsorptionElutionRegeneration-+-+-+离子交换层析离子交换层析离子交换层析原理离子交换层析原理 24 2021-7-29sampleapplicationand washelutionequilibrationregeneration-+-anionexchangerbead离子交换过程离子交换过程 25 2021-7-29离子强度离子强度 洗脱时多采用

13、离子浓度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等. 在不同盐浓度（离子强度）及其不同变化率（梯度）条件下保留行为不同，需对该条件进行摸索。一般的，随离子强度增加，蛋白质保留值减小。缓冲液与缓冲液与pH 选择适当的缓冲体系，起始浓度要尽可能低些(0.01-0.05M) 缓冲液PH值： 阳离子低于pI一个pH单位以上 阴离子通常高于pI一个pH单位以上 蛋白质在不同pH下保留行为差别较大，所以许对缓冲体系和操作pH进行摸索，以得到最佳层析条件。离子交换层析离子交换层析离子交换层析操作参数选择离子交换层析操作参数选择 26 2021-7-29pI5.5+-pH102离子交换层析离子交换层析缓冲液与缓冲

14、液与pHpI7.5阳离子交换阳离子交换阴离子交换阴离子交换碱性蛋白，采用阳离子交换酸性蛋白，采用阴离子交换蛋白质净电荷蛋白质净电荷pH4.0pH9.0蛋白质稳定性范围蛋白质稳定性范围 27 2021-7-29pH 7.0pH 8.0pH 8.9pH 6.0pH6.0pH7.0pH 8.0pH 8.9缓冲液与缓冲液与pH的影响的影响阴离子交换阴离子交换离子交换层析离子交换层析离子交换层析操作参数选择离子交换层析操作参数选择 28 2021-7-29离子交换层析离子交换层析离子交换层析操作参数选择离子交换层析操作参数选择盐溶液梯度的影响盐溶液梯度的影响 29 2021-7-29疏水层析疏水层析 3

15、0 2021-7-29 基于生物分子表面疏水性不同而达到分离的技术基于生物分子表面疏水性不同而达到分离的技术 疏水作用来自于分子的水化结构，高浓度盐溶液破坏生物分子的水化结构，使蛋疏水作用来自于分子的水化结构，高浓度盐溶液破坏生物分子的水化结构，使蛋白质内部的疏水基团暴露于分子外表面，从而可与疏水介质结合白质内部的疏水基团暴露于分子外表面，从而可与疏水介质结合 不同离子的疏水性不同离子的疏水性 Anions: SO42- Cl- Br- NO3- ClO4- I- SCN- Cations: Mg2+ Li+ Na+ K+ NH4+ 蛋白质以高浓度盐溶液结合与疏水层析柱上，以低浓度盐溶液洗脱蛋

16、白质以高浓度盐溶液结合与疏水层析柱上，以低浓度盐溶液洗脱原理原理疏水层析疏水层析 31 2021-7-29疏水层析疏水层析生物分子表面大都有或强或弱的疏水区域，在不同环境下，与各种疏水介质产生不同强弱的结合高离子强度可加强疏水性跟离子交换相反，高盐吸附，低盐洗脱；洗脱样品又 可直接或稍加稀释后加上其他层析柱，作为连接层析 步骤的桥梁，取代盐析沉淀技术配体种类繁多，很难预测哪一种、哪一个条件最适合 ，可用疏水层析试盒选择介质 32 2021-7-29作用原理作用原理溶质曝露在外的疏水基配基水分子大量水分子DG = DH - T DS 33 2021-7-29操作参数选择操作参数选择疏水层析疏水层

17、析疏水介质选择：甲基，丁基，苯基疏水疏水介质选择：甲基，丁基，苯基疏水 疏水性强的蛋白质：甲基，丁基疏水性强的蛋白质：甲基，丁基 疏水性弱的蛋白质：丁基，苯基疏水性弱的蛋白质：丁基，苯基盐：硫酸铵，醋酸铵等等盐：硫酸铵，醋酸铵等等缓冲体系和缓冲体系和pH洗脱梯度洗脱梯度 34 2021-7-29Sample: GFP sample brought up to 2 M AS, filteredLoad:5 mlBuffer: A:2 M (NH4)2SO4+ 0.1 M NaP, pH 7B: 0.1 M NaP, pH 7Flow Rate: 3 ml/min (230 cm/hr)0.025

18、.050.075.0100.0% Buffer B12345678910111213141516171819202122-0.0100.0000.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0800.0900.100-0.0250.0000.0250.0500.0750.1000.1250.1500.1750.20000:00:0000:10:0000:20:0000:30:00FractionsHr:Min:SecVoltsAU0.025.050.075.0100.0% Buffer B19:16.8123456789101112131415161718-0.010

19、0.0000.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0800.0900.100-0.0250.0000.0250.0500.0750.1000.1250.1500.1750.20000:00:0000:10:0000:20:0000:30:00FractionsHr:Min:SecVoltsAUMacro-Prep 甲基疏水甲基疏水苯基疏水苯基疏水20% EtOH疏水层析疏水层析 35 2021-7-29亲和层析亲和层析 36 2021-7-29亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。亲和层析纯化过程简单、

20、迅速，且分离效率高。亲和层析亲和层析 37 2021-7-291. Equilibration2. Sample application3. Binding and washing4. Desorption and elutionEquilibrate the column and the sample to binding conditions.MatrixSpecific ligand亲和层析亲和层析 38 2021-7-29亲和层析亲和层析1. Equilibration2. Sample application3. Binding and washing4. Desorption an

21、d elutionTarget bindsOthers wash outApply sample under binding conditions. 39 2021-7-29亲和层析亲和层析1. Equilibration2. Sample application3. Binding and washing4. Desorption and elutionTarget elutesChange the eluent to elute the target. 40 2021-7-29Profinity IMAC纯化His-tagged ProteinChelex 100纯化DNA，PCR样品制备

22、Affi-Gel Protein A纯化单克隆抗体Dye - Affi-Gel Blue (DEAE or CM) 纯化单抗，分离HSAAffi-Gel 肝素凝胶肝素凝胶多种蛋白，如凝结因子、蛋白酶、核酸酶、脂酶Affi-Gel Polymixin去除内毒素（热原）Affi-Gel 硼胶硼胶分离核苷酸、核苷、儿茶酚胺、糖类等小分子亲和层析亲和层析产品与应用产品与应用 41 2021-7-29Profinity IMAC Resins固定化金属螯合层析：Immobilized Metal Affinity Chromatography （IMAC） 基于纯化重组组氨酸标记蛋白设计，专门纯化His

23、-tagged Protein 螯合带电离子，如Zn2+,Ni2+,Cu2+, 现有的产品为螯合Ni2+的介质 UNOsphere 技术技术 更好的流动特性，在高流速下载量，目的蛋白得率和纯度不会受到影响。IDA 42 2021-7-29不同 IMAC 介质纯化氨基肽酶(aminopeptidase)纯度比较Profinity IMAC, IDA ligandProfinity IMAC Resins 43 2021-7-29Profinity IMAC Resins 纯化 6His-tagged proteinSample：E.coli. lysate96% 纯度Profinity IMAC

24、 Resins 44 2021-7-29羟基磷灰石层析羟基磷灰石层析 45 2021-7-29 Ca10(PO4)6(OH)2 5 个带正电荷的Ca离子对（C位点） 2 个磷酸三价离子，每个含有带6个负电荷的氧原子（P位点） 2 个羟基 于其他层析介质不同，CHT的骨架是化学反应的表面CHT陶瓷羟基磷灰石晶体结构陶瓷羟基磷灰石晶体结构陶瓷羟基磷灰石（陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术）分离技术 46 2021-7-29 蛋白质带正电氨基蛋白质带正电氨基 经典的阳离子交换经典的阳离子交换 用中性盐溶液用中性盐溶液 (NaCl) 或缓冲盐溶或缓冲盐溶液液 (PO4)洗脱洗脱初级保留机制初级保留机制陶

25、瓷羟基磷灰石（陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术）分离技术 47 2021-7-29 带负电羧基带负电羧基 经典的金属螯合作用，并受离子排阻调节经典的金属螯合作用，并受离子排阻调节 比离子间静电相互作用强比离子间静电相互作用强1560倍倍 在无在无PO4 条件下不能被任何浓度条件下不能被任何浓度NaCl洗脱洗脱 用用PO4洗脱洗脱初级保留机制初级保留机制陶瓷羟基磷灰石（陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术）分离技术 48 2021-7-29 优点优点 独特的分离机制 高再生能力 高分辨率 容易规模放大 容易进行方法开发 高机械稳定性 高化学稳定性 层析柱寿命长颗粒大小：颗粒大小：20um、40um和和80um陶瓷羟基磷灰石（陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术）分离技术 49 2021-7-29Type I由于具有更高的表面积，I型具有更高的蛋白载量，而且具有更大的保留.Type II由于具有大孔结构，II 型具有更高的核酸载量，能分离单链和双链DNA，和超螺旋与非超螺旋的DNA白蛋白不能与II型结合，对于一些含白蛋白的抗体样品，II型分离纯化更有利.大分子重组疫苗的中间纯化和大规模制备如何