反应器培养螺旋藻过程中细菌群落组成变化

1、反应器培养螺旋藻过程中细菌群落组成变化摘要：以研究螺旋藻反应器培养过程中细菌生物量、群落组成变化为目的，使用气升式反应器培养钝顶螺旋藻（spirulina plarensis）25 天，在不同时期对螺旋藻液取样，分别记录螺旋藻和细菌的生物量，发现随螺旋藻生物量的增长，细菌的生物量有一定的增长趋势。应用pcr-dgge技术分析其培养过程中细菌种类组成，发现在不同时期细菌群落组成变化明显。通过dgge图谱中18 条特征条带的克隆、测序及系统进化分析，发现其中有8 条序列与变型菌纲序列相似，3 条与拟杆菌纲序列相似，2 条与变型菌纲序列相似，2 条与异常球菌纲序列相似，2 条与放线菌纲相似，还有1

2、条与蓝藻纲的序列相似。在所有相似序列中，有17 条来源于高温、碱性、淡水环境，与螺旋藻的培养环境相似。在整个培养过程中，变型菌纲与拟杆菌纲的细菌为优势类群。关键词：螺旋藻；细菌；气升式反应器；pcr-dgge；16s rdna序列分析changes in bacterial community during the process of spirulina plarensis culture by using airlift reactorabstractthe intention of this experiment is to study the changes of bacterial

3、biomass and community during the process of spirulina plarensis culture by using airlift reactor. carry samples at different time during the 25 days culture to note the biomass of spirulina plarensis and bacteria. the biomass of the bacteria has the direction of increasing along with the spirulina p

4、larensis biomass ncreased. using the pcr-dgge technology to analyze the species of the bacteria during the certain period of the culture process discovers that there are obvious species composition changes in different periods. 18 dgge bands were excised, cloned and sequenced. among these sequences,

5、 8 are similar to -proteobacteria, 3 are similar to bacteroidetes, 2 are similar to - proteobacteria, 2 are similar to deinococci, 2 are similar to actinobacteria and 1 is similar to cyanobacteria. there are 17 sequences rooted in the similar environment of the spirulina plarensis culture. during th

6、e culture, the -proteobacteria and the bacteroidetes are superior genera.keywords： spirulina; bacteria; airlift reactor; pcr-dgge; 16s rdna sequence analysis0引言螺旋藻是一种经济微藻，属于蓝藻门、蓝藻纲、颤藻科、螺旋藻属1。螺旋藻有很高的营养和实用价值2-3，对螺旋藻进行培养的方法也较多。现阶段主要分为封闭式培养与开放式培养两大类4，具体方式有利用开放池、生物反应器等5。其中，气升式光生物反应器是一种能够进行螺旋藻高密度培养的装置6-7。

7、藻类培养过程中藻-菌关系一直是研究的热点问题之一，但目前主要集中在海洋赤潮藻方面，发现主要存在相互促进的共生关系、藻类抑菌作用、细菌杀藻现象等，相关研究结果可用于微生物防治赤潮8。但是在螺旋藻培养过程中，藻-菌关系相关报道很少，这可能不利于培养高品质的螺旋藻。对于螺旋藻相关的藻-菌关系的描述，目前仅有张加春等研究了程海螺旋藻玻璃温室-半封闭跑道式循环培养池中的细菌，发现细菌总数通常为104107 cells/ml，并且随培养时间的变化呈一定规律性被动，研究同时认为培养的好坏与细菌总数有一定关系；通过鉴定发现，优势菌为奈瑟氏球菌属、葡萄球菌属、微球菌属和肠杆菌科的种类，并且认为有些细菌种类能明显

8、抑制或促进螺旋藻生长，其作用是通过代谢产物作用于藻体9。现在，虽然利用气升式光生物反应器可以进行藻类的高密度培养并能获得高产10，是螺旋藻大规模培养的一种趋势，但是对于螺旋藻气升式反应器培养中的细菌群落变化未见相应报道。变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，dgge）技术已成为最近国内外研究微生物分子生态的重要技术，muzyer等首次将dgge技术应用于微生物生态学研究，随后广泛用于活性污泥、生物膜、土壤、底泥等环境和微环境样品中的微生物多样性检测和种群演替的研究11-12。本次实验，以分析螺旋藻气升式光生物反应器培养螺旋藻过程中细菌

9、生物量及群落组成的变化为目的，在螺旋藻培养过程中每日进行取样，观察、计算并记录螺旋藻和细菌生物量的变化。在不同的培养时期留取细菌的dna样品，借助pcr-dgge技术分析螺旋藻培养过程中细菌的群落组成变化。通过实验，得到了气升式反应器培养螺旋藻过程中细菌群落组成变化的趋势。1 材料与方法1.1 培养条件实验藻种为钝顶螺旋藻（spirulina plarensis）（由中国科学院海洋研究所海洋生物技术发展中心光合组提供，取自东营螺旋藻开放式培养池，采集时藻体为旺盛生长状态），培养液为zarrouk培养液（zarrouk，1966），用二氧化氯对培养液和反应器同时进行化学灭菌。使用10 l藻类气升

10、式光生物反应器对螺旋藻进行连续光照（光强为90-180 mol/m2s）、通气培养（通气量控制在0.10 m3/h左右）。每天定时取样测定螺旋藻样品的od560值、ph值及温度。螺旋藻在10 升气升式光生物反应器中的培养过程中，螺旋藻的初始接种密度为0.27 g/l，接种时室内温度19.8 ，ph值为9.49。在螺旋藻的培养过程中，温度、ph值均有所上升，室内温度变化范围为18.0-21.5 ，取得样品的温度变化范围为19.724.7 （最高温出现在培养的第23 天），反应器内ph的变化范围为9.4910.11（最高ph出现在培养的第25 天）。通过每日补加nahco3来补充反应体系的碳源，并

11、基本将ph控制在低于10.10的水平。对于培养中取样和补加培养液、nahco3的记录如表1 所示：表1. 培养体系中取样与添加培养液、nahco3的记录记录项目培养时间（天）12345678910111213常规取样（ml）100100100100100100100100100100100100100留取dna样品取样（ml）500-500-500-500-500-500-500测量干重曲线取样（ml）-500-补加zarrouk培养液（ml）800-800-800-800-800-1300-800补加nahco3（g）3333333333333表1. 培养体系中取样与添加培养液、nahco3

12、的记录（续）记录项目培养时间（天）141516171819202122232425常规取样（ml）100100100100100100100100100100100100留取dna样品取样（ml）-500测量干重曲线取样（ml）-补加zarrouk培养液（ml）-500-200-200-200-补加nahco3（g）66101010101010101010101.2 螺旋藻藻液样品生物量的测定参照王金霞对于螺旋藻生物量测定的方法6，对此次实验中培养的螺旋藻的生物量进行测定，建立螺旋藻干重与样品od560值间的关系，并得到回归方程：y = 0.7245x + 0.0058，相关系数r2 = 0.

13、9939，其中y为螺旋藻细胞干重，单位为g/l，x为560 nm的光密度值（od560值）。1.3 细菌的计数与形态观察方法每日定时取样的藻液中的细菌用土温-80处理（浓度为1: 2000）后，用荧光显微镜法计数。具体方法为：用试管量取2 ml的新鲜水样,加入20 l土温-80，涡旋处理3 min后取40 l加入2 ml分装灭菌的超纯水中，再涡旋处理3 min后取1 ml进行吖啶橙染色3 min,真空抽滤到经过苏丹黑染色的微孔滤膜（孔径为0.2 m,直径25 mm）上，将抽滤后的滤膜置于载玻片上,用荧光显微镜在放大倍数为10100 下观测计数,随机观测15 个视野,每个视野不少于30 个细菌个

14、体。改进晏荣军等描述的细菌计数公式13，采用细菌数量=nas1/（s2v）的方法计算细菌数量。其中n为稀释倍数，a为15个视野中细菌的平均数，s1为滤膜的有效过滤面积，s2为视野面积，v为过滤水样的体积。同时，观察时记录和拍摄细菌的形态特征。1.4 细菌生物量的计算参照李洪波等人的研究结果 14，细菌生物量以20 fg/cell（fg=10-15g）计算。1.5 螺旋藻培养液样品中细菌dna的提取如表1所示，在培养的第1、3、5、7、9、11、13、25 天，分别取500 ml螺旋藻培养液样品，样品经过400 目筛绢过滤，留存滤液。使用40 ml灭菌超纯水冲洗筛绢上的藻体，将冲洗下来的藻体加入

15、400 l土温-80，涡旋震荡处理5 min，再经过400 目筛绢过滤，留存滤液，重复3次，将所有的滤液合并，真空抽滤到白色微孔滤膜（孔径为0.22 m,直径50 mm）上，将滤膜保存于-20 冰箱中，预备提取dna使用。dna的提取方法：将收集了大量菌体的滤膜剪成碎片，加入3 mlstet缓冲液（8%（w/v）蔗糖，0.5%（v/v）triton x-100，50 mmol/ledta，50 mmol/l triscl（ph8.0），0.22 m滤膜过滤除菌，4 保存），加入用10 mmol/l的triscl配置的10 mg/ml的溶菌酶1.5 ml，剧烈涡旋震荡10 min，在37水浴锅中

16、水浴60 min；取出后加入20 mg/ml的蛋白酶k至终浓度200 g/ml，再进行50 水浴1h以上，其余步骤同fuhrman等15。取3 l琼脂糖凝胶电泳检测。1.6 细菌pcr-dgge分析1.6.1 pcr条件及检测以提取的藻液样品中的细菌dna为模板进行，16s rdna v3区的pcr扩增。引物序列为：*gc341f （5-cgc ccg ccg cgc gcg gcg ggc ggg gcg ggg gca cgg ggg gcc tac ggg agg cag cag-3）和534r（5-att acc gcg gct gct gg-3）16。pcr的反应条件为：95 预变性

17、10 min；94 变性1 min，65 退火45 s，72 延伸45 s，20个循环，每个循环退火温度下降0.5 ，最后降低至55 ；然后再进行20个循环：95 变性1 min，55 退火45 s，72 延伸45 s；最后72 持续延伸10 min。反应后的产物放4 冰箱保存。扩增产物经1.0（wv）琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。1.6.2 dgge电泳及分析取16s rdna v3区pcr产物35 l，采用biorad公司的d-code system电泳仪进行电泳分分离。1616 cm page胶的浓度为8%，变性浓度为35%-65%（7 mol/l尿素和40%去离子甲酰胺为100%变性），

18、电泳缓冲液为1tae，58 ，55 v12 h进行电泳。电泳结束后，将胶板使用1: 10000（体积比）的sybr green i染色30 min，清水漂洗后，于蓝光下观察、摄影。根据胶板上条带的多少，亮度变化等对dgge结果进行分析。1.7 细菌16s rdna序列的测定 从dgge凝胶上小心切下dgge条带，500 l无菌水冲洗3次，60 l无菌水浸泡并于4 过夜，12000 rpm离心5 min，收集上清，以此作为模板，引物341f（不含gc-clamp）/534r进行16s rdna v3区pcr扩增。pcr反应条件为95 预变性6 min；然后94 变性l min，55 退火45 s

19、，72 延伸45 s，循环20 次；最后72 延伸10 min。将上述v3区pcr产物经过纯化连接到载体pmd-18t，转化 ecoli topl0感受态细胞，在含有x-gal 、iptg和氨苄青霉素的sob培养基上选择具有氨苄青霉素抗性的白色转化子。采用t载体通用引物t7和sp6进行菌落pcr，pcr产物经1（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测是否为阳性克隆。再以阳性克隆的pcr产物为模板，进行pcr，引物为*gc341f 和534r，条件同上，再进行dgge，与原来的条带在同一位置的克隆才是真正的阳性克隆。交由北京诺赛生物公司进行测序。1.8 16s rdna序列分析测序获得的16s rrna序列

20、与blast比对（http：/），获得与每条序列相似性最高的序列。使用bioedit附带的clustalw multiple alignment工具进行序列比对。应用mega4.1软件的邻位相接法进行系统进化分析。2 结果2.1 螺旋藻及细菌的显微镜下观察结果培养的过程中，应用光学和荧光显微镜观察的螺旋藻与细菌的形态，发现螺旋藻在培养的过程中除生物量明显上升外，形态未见明显变化，但培养后期出现破损的螺旋藻藻段。细菌在培养过程中丰度变化不大，且以球状、杆状、螺旋状为主要形态。2.2 螺旋藻在培养过程中生物量的变化2.2.1 螺旋藻细胞干重光密度值标准曲线及

21、回归方程的建立将所得螺旋藻干重与光密度值绘成标准曲线，采用最小二乘法得到一次线性回归方程: y = 0.7245x + 0.0058，相关系数r2 = 0.9939，其中y为螺旋藻细胞干重，单位为g/l，x为560 nm的光密度值（od560值）。2.2.2 10l气升式光生物反应器培养螺旋藻的生物量变化培养过程中，螺旋藻的平均生长速率为0.042 g/ld，最大比生长速率为0.15/d。螺旋藻细胞干重由0.27 g/l上升到1.32 g/l。随培养天数的增加，od值基本保持不断上升。在培养螺旋藻的25 天中，螺旋藻的生物量也不断上升（图1）。图1. 螺旋藻生长曲线2.3 螺旋藻培养过程中的细

22、菌生物量变化培养的25天中，细菌的数量不断变化，但均保持在107 cells/ml的水平上，其变化范围为2.814.35107 cells/ml。在整个螺旋藻的培养过程中，细菌生物量变化范围为5.628.710-10 g/l，与张加春等9文献中记录的细菌数量的变化范围一致。同时，细菌生物量有一定的上升趋势（图2）。图2. 细菌生物量变化曲线2.4 藻菌生物量变化关系将螺旋藻与细菌的生物量变化趋势线合并分析发现，随着培养天数的增多，螺旋藻的生物量不断上升，而细菌生物量有波动变化。细菌生物量的变化趋势为：开始培养时增长较螺旋藻快，到培养的919 天时，基本保持平稳，培养后期又有上升。总体上，随藻类

23、生物量的增长，细菌生物量有一定的上升趋势（图3）。 螺旋藻生物量 细菌生物量图3. 培养过程中螺旋藻生物量与细菌生物量的变化将培养过程中细菌生物量与螺旋藻生物量的比值进行比较发现，细菌生物量与螺旋藻生物量的比值在培养前期的第1、2 天及培养中期的第10、12 天出现短暂的上升，但都未能持续，在培养过程中整体呈现下降的趋势（图4）。图4. 培养过程中细菌生物量与螺旋藻生物量比值的变化2.5 细菌群落组成变化2.5.1 藻液样品基因组dna及16s rdna v3区pcr提取藻液样品的基因组dna可直接进行pcr，dna片段大小主要集中在23 kb左右。通过细菌特异性引物进行pcr扩增得到16s

24、rdna v3区序列，扩增所产生的dna片段均为单一条带，片段大小约为200 bp，表明扩增产物无明显的非特异性扩增现象。2.5.2 细菌16s rdna v3区特征片段dgge指纹图谱对不同培养时期的样品进行变性梯度凝胶电泳并进行观察、摄影，dgge图谱如图5所示。从dgge电泳图谱中可看出，不同培养时期的电泳条带数和位置不完全相同（如band1、13、16、17只出现在特定时期），条带的亮度也不完全相同（如band1、2、5、7、8、12、17、18发生条带亮度的变化），表示在不同的培养时期细菌的多样性和组成发生变化。根据dgge图谱上条带的有无进行聚类分析，结果表明：在时间上，样品明显的

25、聚成三类，即培养前期（d1、d3），培养中期（d5、d7、d9、d11）与培养后期（d13、d25）（图6）。可见螺旋藻培养的三个时期，其细菌的群落组成是不同的。一般来说，dgge图谱上条带的多少可以反映群落的多样性16，对8 个样品的条带数进行统计（图7），d25条带数最多（17 条），多样性最高；d1与d3条带数最少（13 条），多样性最低。培养前期条带数未发生变化，均为13 条；培养中期条带数保持在16 条的水平上；培养后期条带数的变化范围为1617 条，平均17 条。可见在螺旋藻培养过程中，条带数随培养时间的增长而增多，即培养系统内存在的细菌多样性呈现上升趋势。d1d25分别表示第1、

26、3、5、7、9、11、13、25天采集的样品，点标记的条带为切割测序比对成功的条带，编号为band118，*标记的条带未能成功测序图5. 不同时期样品的dgge图谱图6. 细菌dna的dgge结果聚类分析图7. dgge图谱的条带数统计2.5.3 细菌种类16s rdna序列及系统发育分析细菌16s rdna v3区特征片段经dgge分离、条带切割，并进行克隆测序，共得到18 条dgg序列，大小在168195 bp范围内。所得序列在ncbi上进行blast核酸比对，并进行相似相分析（表2）。序列已提交至genbank核算数据库，序列号为gq412104gq412121。表2. 经dgge分离获

27、得的细菌16s rdna v3序列比对结果条带序列号分类地位相似序列描述环境相似度band1gq412104-proteobacteriauncultured gamma proteobacterium clone wn-uwb-56（dq432256）盐碱水体/沉积物96%band2gq412105-proteobacteriauncultured alpha proteobacterium clone wn-hwb-29（dq432334）盐碱水体/沉积物100%band3gq412106-proteobacteriauncultured alpha proteobacterium clo

28、ne wn-fwb-32（dq432439）盐碱水体/沉积物100%band4gq412107-proteobacteriauncultured alpha proteobacterium clone wn-hwb-29（dq432187）盐碱水体/沉积物100%band5gq412108deinococciuncultured thermales bacterium clone a1943（eu283558）安德森湖97%band6gq412109bacteroidetesuncultured cfb group bacterium clone ml110m-11（af452597）盐碱水体

29、93%band7gq412110-proteobacteriauncultured alpha proteobacterium partial, clone 83 t9d-oil（fm242321）沉积物96%band8gq412111-proteobacteriaalcanivorax sp. 2a17 gene for 16s rrna（ab435641）热带海域96%band9gq412112-proteobacteriauncultured alpha proteobacterium clone wn-hsb-5（dq432283）盐碱水体/沉积物99%band10gq412113ac

30、tinobacteriaplantibacter sp. wpcb192 16s ribosomal rna gene（fj006927）淡水环境100%band11gq412114bacteroidetesuncultured bacteroidetes bacterium clone wn-fsb-88（dq432122）盐碱水体/沉积物93%band12gq412115bacteroidetesuncultured cfb group bacterium clone ml310m-18（af449772）盐碱水体92%band13gq412116cyanobacteriauncultur

31、ed arthrospira sp. clone lami-42（eu872311）湖水表面膜状物100%band14gq412117-proteobacteriacaulobacter sp. dna for 16s ribosomal rna, strain mcs33（aj227811）淡水环境95%band15gq412118-proteobacteriauncultured alpha proteobacterium clone wn-fwb-191（dq432417）盐碱水体/沉积物99%band16gq412119-proteobacteriaphyllobacterium sp

32、. akb-2008-va5 partial 16s rrna gene, strain akb-2008-va5（am989040）蓝藻水华97%band17gq412120deinococciuncultured deinococci bacterium clone la7-b27n （af513964）夏威夷群岛湖泊94%band18gq412121actinobacteriauncultured actinobacterium clone tfm-108（eu626146）热泉98%blast相似性比较分析的结果表明，所有序列与数据库中16s rdna序列的相似性范围为92100。在所

33、有相似序列中，有17 条来自于高温、碱性、淡水环境，与螺旋藻的培养环境相似。成功测序的18 条序列中有8 条属变型菌纲（-proteobacteria）（占所有序列的44%），3 条属拟杆菌纲（bacteroidetes）（占17%），2 条属变型菌纲（-proteobacteria）（占11%），2 条属异常球菌纲（deinococci）（占11%），2 条属于放线菌纲（actinobacteria）（占11%），还有1 条属于蓝藻纲（cyanobacteria）（占6%）（图8）。可见，变型菌纲是螺旋藻的培养过程中细菌的优势类群。用mega4.1的邻位相接法对序列进行系统进化分析，进一步证

34、明了相似序列的从属地位（图9）。条带的有无和亮度变化可以反映细菌类群在螺旋藻培养过程中的变化16-17。在18 条测序成功的条带中，有14 条（band2-12，14-15，18）始终存在于培养过程中，其中有7 条（band2，3，4，7，9，14，15）属于变型菌纲（-proteobacteria）（占共有条带的50%），比例最高；3 条（band6，11，12）属于拟杆菌纲（bacteroidetes）（占22%）；2 条（band10，18）属于放线菌纲（actinobacteria）（占14%）；还有2 条分别属于变型菌纲（-proteobacteria）（band8）和异常球菌纲（d

35、einococci）（band5）（各占7%）。在这14条条带中，有6 条发生了亮度改变。band2（-proteobacteria）随培养时间的增长亮度变低，而band5（deinococci）、12（bacteroidetes）、18（actinobacteria）随着培养时间的增长亮度变高；band7（-proteobacteria）在培养中后期时亮度最低而band8（-proteobacteria）在培养中期时亮度最高。在18条测序条带中有4条只出现在培养的某些阶段，说明细菌类群在培养过程中发生了一定的变化，其中，band1（-proteobacteria）出现在培养的中后期，且条带亮

36、度逐渐增强；band13（cyanobacteria出现在培养中期；band16（-proteobacteria）出现在培养后期；band17（deinococci）出现在培养的中后期，条带亮度随培养时间的增长变强后又变暗。总之，在整个螺旋藻的培养过程中，变型菌纲（-proteobacteria）与拟杆菌纲（bacteroidetes）是最优势的细菌类群，但是在培养的某些时期，某些细菌的优势度会增加，因此细菌类群的分布发生了变化，如band17（deinococci）在培养的中期具有一定的优势度（条带亮度较高），band1（-proteobacteria）与band16（-proteobact

37、eria）在培养的后期，特别是第25 天成为优势类群之一。对不同时期样品中所含条带代表的类群组成进行分类统计，可以看出各个类群随时间的变化关系（图10）。变型菌纲（-proteobacteria）的细菌在每个时期所占优势均最高（所占比例各时期的比例为31.3%38.5%），其次是拟杆菌纲（bacteroidetes）（17.6%23.1%）。随着培养的进行，各种细菌类群在不同时期所占的比例不同，如两类优势细菌的优势度在培养过程中都有下降趋势。此外，某些细菌指出现在培养的特定阶段，如蓝藻纲（cyanobacteria）细菌，这可能与培养环境的不断改变有关。图8. 相似序列的综合信息饼图图9. 细

38、菌16s rdna序列的系统发生树图10. 各条带代表类群的组成分析3 讨论在本次实验中，螺旋藻的培养、生长状况良好，在25 天的培养中，螺旋藻的生长曲线基本呈现直线上升趋势。这可能与在培养过程中不断补加培养液、nahco3有关，它们提供了藻类不断生长的营养和环境。生长曲线在培养的第12 天发生了一定的下降趋势，这可能是由于第11 天测量螺旋藻的干重浓度曲线的取样需要（取样约1100 ml），补加了1300 ml 2 倍浓度的zarrouk培养液，造成了系统较大的扰动，致使第12 天的生物量略有下降。在培养过程中，细菌的丰度、生物量也发生变化，并有一定的上升趋势，这可能与培养过程中不断有藻体破

39、损，为细菌生长提供了附着空间与营养有关。细菌生物量曲线中有一平滑期，在这一时期，可能是藻-菌生物量在这一时段趋于平衡，而培养的前、后期可能由于培养体系中发生较大的环境变化，而产生细菌生物量的较大波动。虽然细菌生物量有上升的趋势，但其生物量的增长率小于螺旋藻生物量的增长率，这可能与气升式光生物反应器适宜对藻类进行高密度培养但培养环境对于存在于反应器中的细菌并不充分适合有关。也可能是由于螺旋藻的不断生长，使细菌的空间生态位减少造成的。藻-菌生物量的曲线显示，除了培养初期和中期出现的小范围的上升波动，整体呈现下降趋势。分析这可能是与培养过程中系统环境的改变有关。在培养初期，第1、2 天螺旋藻刚刚接种

40、，处于适应期，细菌增长的速率大于螺旋藻；第12 天的变化可能是由于第11 天取样并添加培养液较多，培养环境产生了较大的扰动造成的。推测细菌对于环境的适应比螺旋藻快，但是其生长速率不及螺旋藻。同时，螺旋藻的旺盛生长可能对细菌有抑制作用，使细菌在培养过程中生物量虽有增长，但相对螺旋藻其增量仍较小。dgge是一种快速且相对有效的研究群落结构的方法，具有分辨率高、加样量小、重复性好、节约时间、操作简便等优点18。但应用dgge分析细菌群落组成还存在一些局限性，如dna的提取、pcr的扩增条件、变性梯度的选择等均会影响到结果19，且dgge并不能分离样品中所有的dna片断，只能检测到微生物群落中数量上大

41、于1%的优势种群16, 20-22。dgge在实际的应用中也受到一些条件的限制，但仍是一种快速有效检测细菌群落结构的技术方法23。在本次实验的dgge图谱中，band9、14、15处在同一位置，虽然它们是在不同时期采集的样品，但均属于变型菌纲（-proteobacteria），差别较小。而band3与band6虽处在同一位置，但经过blast分析发现它们分别属于变型菌纲（-proteobacteria）和拟杆菌纲（bacteroidetes），对于这种现象已经有学者进行了相关详细的研究，证明同一位置的条带可能代表不同的细菌类群，这主要是dgge技术的分辨率造成的16, 24-26。dgge技术

42、虽然具有重复性高、多样品同时分析等优点，但是同时也存在许多缺陷，因此在分析微生物多样性和群落组成的研究中，最好结合两种或多种分子生物学技术方法进行分析。通过对培养过程中不同时期dgge图谱的条带数统计可以得出，随着螺旋藻培养的进行，dgge图谱中条带数逐渐增多，表明在此过程中，细菌群落的多样性不断增高。这可能与培养过程中不断补加螺旋藻培养液，提供了细菌生长的营养和环境有关。这种多样性增高的现象与海水或淡水水华环境中细菌多样性的变化不同27-28，这可能是由于螺旋藻在培养中生长状态良好，虽然生物量较高，近似于室内模拟水华，但在25 天中并未达到螺旋藻的衰败期有关。在18 条测序序列的比对结果中，

43、多数相似序列来源于盐碱湖泊或热泉的环境，与螺旋藻培养过程中高温、碱性、淡水的环境相似，从而说明这些细菌能很好的适应培养液的环境，推测其是在培养过程中共存的细菌。4 条只出现在特定时期的序列，可能与培养过程中环境的变化有关。在螺旋藻的培养过程中，系统内的ph值不断升高，碱性增大，温度则呈现出波动上升的趋势。band1只存在与培养的中后期，并在培养后期成为优势类群之一，而其相似序列来源于盐碱环境，推测band1的出现和存在可能与培养过程中碱性增大，并在后期达到最大，适合其代表细菌类群的生境要求有关；band13出现在培养的中期，其相似序列来源于湖水表面的膜状物，推测这可能与螺旋藻在中期生长旺盛，提

44、供了此类细菌的生存环境有关；band16只存在于螺旋藻培养的后期，且在d25成为优势类群之一，这可能与螺旋藻生物量在培养后期达到最大螺旋藻在反应器中的旺盛生长类似于室内模拟的水华环境有关；band17存在于培养的中后期，在中期优势度最大，其相似序列来源于热带湖泊，推测band17代表的细菌类群可能与培养过程在中期出现小的温度跃增有关。在螺旋藻培养过程中，细菌类群的组成虽然发生了一定的变化，但是变型菌纲（-proteobacteria）和拟杆菌纲（bacteroidetes）始终是优势类群。有学者的研究表明，变型菌纲的细菌，特别是rosebacter在海洋环境中的颗粒物上及藻类培养物中占优势，与

45、藻类培养有密切的联系，而拟杆菌纲的细菌有殖民化颗粒物质和降解有机物的能力29-30。因此，推测此次实验中这两类优势菌群的存在可能与螺旋藻培养液的富营养环境和有机物代谢有关。在实验中，通过显微镜观察可以发现在培养的后期出现了一些螺旋藻的破碎藻体，为细菌的附着提供了空间，对细菌的分离计数可能会产生一定的影响，可以在今后的实验中设计相应的方法及时移除破碎藻体。本次实验使用的藻种来源于开放池培养过程，未经除菌处理直接进行反应器培养。其中存在的细菌很多可能来源于开放培养的过程中。而有研究表明，螺旋藻遗传学研究进展缓慢，困难之一就是藻的无菌纯化31。说明螺旋藻无菌纯化过程较难，而其生产过程中若注意不够，会

46、较易染菌。此次的实验结果也可以帮助分析螺旋藻大规模培养过程中细菌的组成，有利于在螺旋藻无菌化生产中进行细菌的分离和杀灭。本次实验通过综合分析螺旋藻与细菌的生长、生物量曲线以及dgge和测序分析，可知在螺旋藻的培养过程中，存在着一些喜高温碱性淡水环境的细菌。而这些细菌在螺旋藻的高密度培养中发挥的具体作用还有待进一步的研究。4 结论（1）通过对细菌dgge图谱的分析，发现在气升式光生物反应器培养螺旋藻的过程中，细菌群落组成发生一定的变化，但有14 条经测序的条带在培养过程中一直存在，依据亮度变化分析，随着螺旋藻的生长，有3 条生物量增加，1 条生物量减少，2 条生物另发生波动，另外8 条的生物量在

47、培养过程中未见较大变化，推测这些条带所代表的细菌在培养过程中与螺旋藻是伴生关系。对于细菌序列的分析可知，在反应器培养过程中出现的种类与半封闭跑道式培养池中存在的细菌种类有所不同。通过序列比对发现在测序的18条序列中，多数比对序列与本次实验中螺旋藻的培养环境相似，另有少数序列未见与此次实验环境相似的报道。（2）通过对于螺旋藻与细菌生物量的分析，可以得出，在培养的过程中，螺旋藻与细菌的生物量均有所增加，但细菌的增长速度及比率不及螺旋藻。在培养过程中，细菌的种类多样性也呈现一定的上升趋势。参考文献：1 商树田螺旋藻的培养与应用生物学通报，1994，29（10）：23-242 张成武，吴洁，欧阳平凯顿

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